專利名稱：一種促進(jìn)酮古龍酸菌生長和產(chǎn)酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種通過添加外源營養(yǎng)因子硫辛酸促進(jìn)酮古龍酸菌生長和產(chǎn)酸的方法。
背景技術(shù)：
維生素C(vatamin C，VC)是一種水溶性維生素，又名L 一抗壞血酸(L-ascorbic acid)，能參與體內(nèi)多種羥化反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)，是一類重要的細(xì)胞代謝氧化還原化合物，在人體中起著必不可少的生理作用，在醫(yī)藥、食品、飼料、化妝品等諸多領(lǐng)域具有重要而廣泛的用途。隨著人們生活水平的提高和對VC的需求不斷增加，促進(jìn)了對其生產(chǎn)工藝的研究改進(jìn)，生物發(fā)酵法是工業(yè)生產(chǎn)VC的發(fā)展方向。我國VC混合菌發(fā)酵法生產(chǎn)工藝處于國際領(lǐng)先地位。該方法的第一步是在生黑醋酸桿菌作用下將D —山梨醇氧化為L-山梨糖，俗稱醇糖轉(zhuǎn)化；第二步是在一種混合菌系的作用下將L-山梨糖進(jìn)一步氧化為2-酮基-L-古龍酸Q-keto-L-gulonicacicbKGA)，俗稱糖酸轉(zhuǎn)化，KGA是VC的前體。上述混合菌系包括2種微生物，直接負(fù)責(zé)山梨糖生物氧化的微生物是普通酮古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare)，俗稱小菌。另一種微生物俗稱大菌，本身不能轉(zhuǎn)化山梨糖，作為伴生菌起到輔助小菌生長和產(chǎn)酸的作用，生產(chǎn)中常用的有臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、蘇云金芽孢桿菌 (Bacillus thuringiensis)等。目前VC生產(chǎn)普遍采用我國首創(chuàng)的混合菌發(fā)酵法，小菌為產(chǎn)酸菌，但單獨(dú)培養(yǎng)生長緩慢，傳代困難，且產(chǎn)酸能力很弱，大菌與小菌混合培養(yǎng)可促進(jìn)小菌其生長及產(chǎn)酸，但大小菌的混菌發(fā)酵給工藝控制增加了難度，造成發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和能源的浪費(fèi)，增加了環(huán)境污染，提高了生產(chǎn)成本。通過單菌發(fā)酵實(shí)現(xiàn)糖酸轉(zhuǎn)化一直是VC發(fā)酵工藝追求的目標(biāo)。如果能夠解決小菌單獨(dú)生長的問題，完全可以直接利用小菌進(jìn)行單菌發(fā)酵。本發(fā)明通過對酮古龍酸菌基因組進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，酮古龍酸菌的硫辛酸的合成代謝途徑中酶不完整，提示酮古龍酸菌自身不能合成這個(gè)營養(yǎng)因子，需要從外界攝取。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高酮古龍酸菌的生長和產(chǎn)酸速度的方法，實(shí)現(xiàn)直接利用小菌進(jìn)行單菌發(fā)酵生產(chǎn)VC的目的，簡化了 VC發(fā)酵工藝。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明將硫辛酸應(yīng)用到酮古龍酸菌的發(fā)酵中，可用于VC發(fā)酵。硫辛酸是細(xì)菌生長所需B族維生素，作為輔酶或輔基的組成成分，是一種?；d體，在 α -酮酸氧化作用和脫羧作用時(shí)行使偶聯(lián)?；D(zhuǎn)移和電子轉(zhuǎn)移的功能，在物質(zhì)代謝中起重要作用。目前國際上用于VC工業(yè)生產(chǎn)使用的酮古龍酸菌均來源于同一祖先菌株，表現(xiàn)為單獨(dú)生長不良，需要和大菌共培養(yǎng)，從酮古龍酸菌基因組分析，酮古龍酸菌的硫辛酸合成代謝途徑不全，因而在培養(yǎng)基中補(bǔ)充這種營養(yǎng)因子將有利于提高酮古龍酸菌的生長和產(chǎn)酸。本發(fā)明方法可以用含有外源營養(yǎng)因子硫辛酸的HJY基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)酮古龍酸菌，和/或在酮古龍酸菌發(fā)酵培養(yǎng)的過程中向培養(yǎng)基中添加外源營養(yǎng)因子硫辛酸，并控制發(fā)酵條件和時(shí)間在一定范圍內(nèi)。其中，酮古龍酸菌HJY基礎(chǔ)培養(yǎng)基中硫辛酸的終濃度優(yōu)選為0.01 5. iaiig/L，更優(yōu)選0.6%ig/L。本發(fā)明的實(shí)施例結(jié)果表明，當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)因子硫辛酸終濃度為 0. 64mg/L時(shí)，能夠顯著提高酮古龍酸菌的生長和產(chǎn)酸速度。上述發(fā)酵條件優(yōu)選以酮古龍酸菌Y25為發(fā)酵生產(chǎn)菌株，28 32°C，150 250r/ min振蕩培養(yǎng)，優(yōu)選30°C、200r/min振蕩培養(yǎng)。IL HJY基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方為15g山梨糖，3g酵母膏，3g玉米漿，15g蛋白胨，4g尿素，2g 葡萄糖，0.2g MgSO4 · 12H20，4g CaCO3, 5g KH2PO4,加 dH20 至 1L，ρΗ6· 8，110°C高壓滅菌 25min。本發(fā)明的優(yōu)選酮古龍酸菌的發(fā)酵周期為50 70小時(shí)，其生長和產(chǎn)酸的時(shí)間均在此范圍內(nèi)，發(fā)酵周期優(yōu)選60小時(shí)。通過檢測酮古龍酸菌Y25生長60小時(shí)后菌液的0D_、菌體干重和產(chǎn)酸量來測定營養(yǎng)因子對酮古龍酸菌生長和產(chǎn)酸的促進(jìn)效果。本發(fā)明提供的方法在生物發(fā)酵法生產(chǎn)VC產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域具有創(chuàng)新性和很強(qiáng)的實(shí)用性， 對目前的大小菌混合發(fā)酵生成VC法具有很好的改進(jìn)作用。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)在沒有大菌伴生的情況下，提高了小菌的生長速度和產(chǎn)酸速度。( 簡化VC生產(chǎn)工藝，且工藝可控。(3)降低能源消耗，節(jié)約成本。(4)減少排放，有利于環(huán)保。本發(fā)明提供的方法可以用于目前發(fā)酵法生產(chǎn)VC工業(yè)的推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例11.菌株和質(zhì)粒酮古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare) Y25和臘樣芽孢桿菌L26 購自石藥維生公司。2.培養(yǎng)基HJY基礎(chǔ)培養(yǎng)基(IL) :15g山梨糖，3g酵母膏，3g玉米漿，15g蛋白胨，4g 尿素，2g 葡萄糖，0.2g MgSO4 · 12H20，4g CaCO3, 5g KH2PO4,加 dH20 至 1L，ρΗ6· 8，110°C高壓滅菌25min。3.主要試劑硫辛酸(lipoic acid)購于SIGMA公司。4.主要溶液硫辛酸溶液濃度均為0. lmg/mL，蒸餾水溶解，0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，4°C存放。5.硫辛酸對小菌生長的影響挑取小菌單菌落于5mL HJY培養(yǎng)基，30°C，200r/min培養(yǎng)7 活化，按1 %的接種量轉(zhuǎn)接入新鮮的5mL HJY基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。加入不同量的硫辛酸溶液至終濃度依次為0. OOmg/ L、0. 01mg/L、0. 02mg/L、0. 04mg/L、0. 08mg/L、0. 16mg/L、0. 32mg/L、0. 64mg/L、l. 28mg/L、 2.56mg/L、5. 12mg/L。以未接小菌菌液的HJY基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為空白對照，以硫辛酸終濃度為0. 00mg/L樣品作為陰性對照，以按0. 2%的接種量接入新鮮的大菌臘樣芽孢桿菌U6菌液的樣品為陽性對照。每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)重復(fù)，30°C，200r/min培養(yǎng)60h。測定菌液0D_吸光值，另外12000rpm離心5min收集3mL菌液菌體，37°C恒溫干燥72小時(shí)，稱量菌體干重。 0D_和菌體干重反映小菌生長情況(表1)。碘量法滴定測定小菌產(chǎn)酸量來評價(jià)小菌產(chǎn)酸情況(表1)。 表1硫辛酸對小菌生長和產(chǎn)酸的促進(jìn)作用
權(quán)利要求
1.硫辛酸在酮古龍酸菌發(fā)酵中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵為VC發(fā)酵。
3.一種促進(jìn)酮古龍酸菌生長和產(chǎn)酸的方法，其特征在于，用含有外源營養(yǎng)因子硫辛酸的HJY基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)酮古龍酸菌，和/或在酮古龍酸菌發(fā)酵培養(yǎng)的過程中向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加外源營養(yǎng)因子硫辛酸，控制其生長和產(chǎn)酸的時(shí)間。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，HJY基礎(chǔ)培養(yǎng)基中硫辛酸的終濃度為 0. 01 5. 12mg/L。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，HJY基礎(chǔ)培養(yǎng)基中硫辛酸的終濃度為 0.64mg/L。
6.如權(quán)利要求3 5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，發(fā)酵條件為28 32°C、150 250r/min振蕩培養(yǎng)。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，酮古龍酸菌的發(fā)酵周期為50 70小時(shí)，控制其生長和產(chǎn)酸的時(shí)間在此范圍內(nèi)。
8.如權(quán)利要求3 5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，ILHJY基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方為15g 山梨糖，3g酵母膏，3g玉米漿，15g蛋白胨，4g尿素，2g葡萄糖，0. 2g MgSO4 · 12H20，4g CaCO3, 5g KH2PO4,力卩 dH20 至 1L, ρΗ6· 8，110°C高壓滅菌 25min。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種促進(jìn)酮古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare)生長和產(chǎn)酸的方法。通過在酮古龍酸菌培養(yǎng)基中添加營養(yǎng)因子硫辛酸，能夠提高酮古龍酸菌的生長速度和產(chǎn)酸能力，從而達(dá)到用單菌發(fā)酵的方法實(shí)現(xiàn)糖酸轉(zhuǎn)化的目的，簡化了維生素C的發(fā)酵工藝。
文檔編號C12P17/04GK102321698SQ201110235170
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月16日
發(fā)明者侯偉, 張惟材, 汪建華, 熊向華, 韓雙 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所