專(zhuān)利名稱(chēng)：與植物抗蚜蟲(chóng)能力相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與植物抗蚜蟲(chóng)能力相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蚜蟲(chóng)為同翅目蚜科，是一種破壞力極強(qiáng)的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，它的特點(diǎn)為個(gè)頭小，身子軟，繁殖能力特強(qiáng)，多寄主，能進(jìn)行孤雌生殖和有性生殖。由于蚜蟲(chóng)具有適應(yīng)能力強(qiáng)，食譜廣，繁殖率極強(qiáng)等特點(diǎn)，如何有效地對(duì)它進(jìn)行有效防治成為許多科學(xué)工作者多年來(lái)一直致力研究的難題。植物基因工程的發(fā)展為蚜蟲(chóng)防治開(kāi)辟了新的途徑。目前研究者已克隆得到了多個(gè)與抗蚜相關(guān)的基因。從抗蚜蟲(chóng)廣譜性上來(lái)分，這些基因主要分為兩類(lèi)一個(gè)是特異性抗蟲(chóng)牙基因如Nr基因(Nasonovia ribisnigr):該基因從一種野生型的萵苣中獲得,只針對(duì)Nasonovia ribisnigr (屬于姆蟲(chóng)的一個(gè)種)起作用；Vat基因法國(guó)的一個(gè)研究小組從朝鮮的一個(gè)甜瓜品種中發(fā)現(xiàn)的，該基因可抑制蚜蟲(chóng)在植物器官上繁殖，又可以防止蚜蟲(chóng)傳播病毒；sdl基因只針對(duì)于蘋(píng)果紅圓尾姆(Dysaphis devecta)生物I型和II型起作用，目前該基因已經(jīng)被繪制了精密的物理圖譜，為克隆該基因奠定了基礎(chǔ)；Mi_l，2基因該基因來(lái)源于茄科植物番茄中，全長(zhǎng)14. 7kb，編碼由1257個(gè)氨基酸組成的蛋白，該基因?qū)儆趎ucleotide-binding leucine rich repeat (NBLRR)家族，即富含亮氨酸的核苷酸結(jié)合家族，后來(lái)Rossi等(1998)進(jìn)行了進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)其位于番茄的第6號(hào)染色體上，并且該基因具有高度的種屬特異性，對(duì)轉(zhuǎn)該基因的馬鈴薯分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯只對(duì)Wu3型的蚜蟲(chóng)起作用，將該基因轉(zhuǎn)入茄子發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因茄子只針對(duì)于線(xiàn)蟲(chóng)起作用，而對(duì)蚜蟲(chóng)不起作用(Rossi, Μ. , Goggin, F. L. , Milligan, S. B. ,Kaloshian, I. ,UlIman,D.Ε.,and Williamson,V. Μ. , The nematode resistance gene Mi of tomato confers resistance against thepotato aphid. Proc Natl Acad Sci U S A 1998.95 :9750-9754)。另一種是廣譜性的抗蚜基因如細(xì)胞分裂素基因=Smigocki等(1993)將細(xì)胞分裂素基因ipt (異戊烯基轉(zhuǎn)移酶細(xì)胞分裂素合成的關(guān)鍵酶)基因轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性植株能夠抑制綠桃姆(Myzuspersicae)的發(fā)育，經(jīng)后續(xù)試驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)是植物激素的過(guò)量表達(dá)從而干擾了昆蟲(chóng)正常的生理代謝而使桃蟲(chóng)牙的發(fā)育受到抑制(Smigocki, A.，Neal, J. ff.，Jr.，McCanna, I.，and Douglass, L.，Cytokinin-mediated insect resistance in Nicotiana plants transformed with theipt gene. Plant Mol Biol 1993. 23 =325-335);蛋白酶抑制劑基因由于同翅目昆蟲(chóng)體內(nèi)缺乏蛋白酶，因而目前常見(jiàn)的蛋白酶抑制劑基因抑制蚜蟲(chóng)的效果，但是一些小的蛋白酶抑制齊U，如胃蛋白酶抑制劑(pepstain)和抑糜酶素(chymostain)對(duì)蟲(chóng)牙蟲(chóng)有致死作用；凝集素基因具有對(duì)多種單糖和寡聚糖專(zhuān)一性結(jié)合的能力，因而使這類(lèi)基因在抗蚜基因工程育種方面具有很大的潛力，該基因也是迄今為止研究最為深入、廣泛的抑制蚜蟲(chóng)發(fā)育、繁殖比較明顯的基因(郭洪年，侯漢娜，歐陽(yáng)青，吳家和，抗蚜基因及其轉(zhuǎn)基因植物.中國(guó)生物工程雜志 2008. 28 :118-124)。植物凝集素是一種存在于許多植物的種子和營(yíng)養(yǎng)器官中具有一個(gè)或多個(gè)能夠與單糖或寡聚糖特異可逆結(jié)合的非免疫蛋白。到目前為止，已對(duì)雪花蓮、石蒜(Zhao，X.，Yao，J., Sun,X. , and Tang,K. ,Molecular cloning and characterization of a novel lectingene from Lycoris radiata. DNA Seq 2003. 14 :223-226)、觀音蓮、紅豆杉、掌葉半夏、小麥、扁豆等植物凝集素基因進(jìn)行了克隆、序列及功能分析。按照植物凝集素亞基結(jié)構(gòu)特征的不同，將其分為四種類(lèi)型部分凝集素(merolectins):部分凝集素是具有單一的糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一種小分子蛋白，它不具有凝集細(xì)胞或沉淀糖綴合物的能力。目前發(fā)現(xiàn)僅有很少的凝集素屬于該類(lèi)型，如克隆自橡膠樹(shù)的幾丁質(zhì)結(jié)合橡膠素和蘭科的單子葉甘露糖結(jié)合凝集素；全凝集素(hololectins)全凝集素是至少具有兩個(gè)糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一種植物蛋白，這些糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域相同或高度同源，該類(lèi)型的凝集素具有凝集細(xì)胞或沉淀糖綴合物的能力，目前發(fā)現(xiàn)的大部分植物凝集素屬于該類(lèi)型，如抗蚜效果明顯的單子葉甘露糖凝集素就屬于該類(lèi)；嵌合凝集素(chimerolectins):嵌合凝集素是具有至少一個(gè)單一糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域和另一種結(jié)構(gòu)域組成的一種融合蛋白質(zhì)，后一結(jié)構(gòu)域一般具有催化等生物活性，該區(qū)域功能的發(fā)揮 與糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合糖功能的發(fā)揮是相對(duì)獨(dú)立的，兩個(gè)功能域功能的發(fā)揮互不影響；超凝集素(superlectins):超凝集素是由兩個(gè)在結(jié)構(gòu)和糖結(jié)合種類(lèi)上都不一樣的糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成的融合蛋白，兩個(gè)糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互獨(dú)立，超凝集素也可看做一類(lèi)特殊的嵌合凝集素。按照氨基酸序列相似性及其在進(jìn)化上關(guān)系的不同，可將其分為7個(gè)家族豆科凝集素家族、木菠蘿素家族、葫蘆科韌皮部凝集素、莧科凝集素、幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素家族、單子葉甘露糖結(jié)合凝集素和II型核糖體失活蛋白。目前用于抗蚜蟲(chóng)研究的主要是單子葉植物甘露糖結(jié)合的凝集素，對(duì)于單子葉植物甘露糖特異結(jié)合的植物凝集素，利用基于結(jié)構(gòu)注解的序列分析可以看到，它們的同源性非常高。它們形成了一個(gè)共同的識(shí)別糖環(huán)的不連續(xù)表位，即Gln-X-Asp-X-Asn-X-X-X-Tyr (QDNY結(jié)構(gòu)域)，該區(qū)域?yàn)槟刈饔梦稽c(diǎn)。凝集素在植物的防御體系中起著非常重要的地位，目前已經(jīng)有多種證據(jù)證明了凝集素在植物保護(hù)方面起到的地位，一個(gè)重要的證據(jù)即是植物凝集素具有單糖或寡聚糖特異可逆結(jié)合的能力，尤其是對(duì)于在植物中不常見(jiàn)或壓根不存在的寡糖具有更高的親和性(Lam, S.K. , and Ng, Τ.B. , Lectins !production and practical applications. ApplMicrobiol Biotechnol 2011.89:45-55)。例如，幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素能夠識(shí)別并結(jié)合真菌細(xì)胞壁成分中的幾丁質(zhì)或無(wú)脊椎動(dòng)物外骨骼成分中的寡糖，從而防止真菌對(duì)植物的感染或害蟲(chóng)對(duì)植物的蠶食；另外植物凝集素的保護(hù)作用可以從提取的植物蛋白人工飼喂蚜蟲(chóng)及轉(zhuǎn)凝集素基因的植物具有良好的抗蚜蟲(chóng)效果方面得到了充分的證明，下面幾個(gè)直接證據(jù)進(jìn)一步說(shuō)明植物凝集素的防御作用(1)植物凝集素的抗細(xì)菌活性。豆科凝集素中的幾種同細(xì)菌肽聚糖的組成成分N-乙酰氨基葡糖，N-乙酰胞壁酸及胞壁酰二肽能強(qiáng)烈作用，防止細(xì)菌對(duì)植物的侵害。(2)植物凝集素抗真菌性。幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素可結(jié)合真菌細(xì)胞壁，體外研究表明麥胚凝集素可抑制某些真菌孢子的出芽及綠色木霉菌的生長(zhǎng)，蕁麻凝集素可以通過(guò)牽連真菌的內(nèi)生菌絲從而控制核糖體的定位，繼而導(dǎo)致菌體結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生改變，并且Chrispeels (1991)通過(guò)研究表明蕁麻凝集素具有抑制灰霉病菌生長(zhǎng)的作用(Chrispeels,M. J.，and Raikhelb, N. V.，Lectins，Lectin Genes，and Their Role in Plant Defense.The Plant Cell 1991.3:1-9)。(3)植物凝集素對(duì)高等動(dòng)物抗性。II型核糖體失活蛋白對(duì)所有真核生物具有普遍毒性。原則上，II型核糖體失活蛋白到達(dá)胞質(zhì)后對(duì)所有真核生物有極毒性，II型核糖體失活蛋白由A鏈和B鏈組成，B鏈可以結(jié)合到細(xì)胞的受體上，然后促進(jìn)A鏈的進(jìn)入，A鏈能夠切割核糖體RNA的單一腺苷殘基，最后核糖體的失活，因此，該蛋白可保護(hù)植物免受動(dòng)物或昆蟲(chóng)的蠶食。(4)植物凝集素對(duì)昆蟲(chóng)的抗性作用。某些凝集素可以識(shí)別并結(jié)合到昆蟲(chóng)消化道上皮細(xì)胞的糖蛋白上，從而對(duì)昆蟲(chóng)產(chǎn)生局部或系統(tǒng)的影響，繼而對(duì)昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生抑制作用，使昆蟲(chóng)的蟲(chóng)口密度下降，例如單子葉甘露糖凝集素對(duì)蚜蟲(chóng)的抗性；而且某些凝集素(如Mi-L 2基因)表現(xiàn)出了抗植物病原性線(xiàn)蟲(chóng)活性。(5)植物凝集素的抗病毒性。很多單子葉甘露糖凝集素對(duì)動(dòng)物(包括人類(lèi))的反轉(zhuǎn)錄病毒具有有效的抑制作用，如蘭科植物單子葉甘露糖凝集素可抑制HIV靶細(xì)胞的結(jié)合過(guò)程；許多凝集素具有間接防治病毒作用，例如，單子葉甘露糖凝集素防治蚜蟲(chóng)從而防止病毒的傳播；并且II型核糖體失活蛋白具有對(duì)植物病毒的抑制活性，但其機(jī)理正在進(jìn)一步研究之中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供與植物抗蚜蟲(chóng)能力相關(guān)的蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的與植物抗蚜蟲(chóng)能力相關(guān)的蛋白，名稱(chēng)為AmLec，來(lái)源于海芋 (Alocasia macrorrhiza),是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列I的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗蚜蟲(chóng)相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的序列I由270個(gè)氨基酸殘基組成。所述與植物抗蚜蟲(chóng)能力相關(guān)蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述與植物抗蚜蟲(chóng)能力相關(guān)蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-4)中任一所述的基因I)序列表中序列2自5'末端起第39位-第851位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的基因；4)與I)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC，O. I % SDS 和 I X SSC, O. I % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列2由1093個(gè)堿基組成，自5'末端起第39位-第851位為其編碼序列，編碼具有序列表中序列I所不的氣基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。含有所述與植物抗姆蟲(chóng)能力相關(guān)蛋白的編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組表達(dá)載體是在載體p2300-35S的多克隆位點(diǎn)間插入所述編碼基因得到的重組表達(dá)載體；所述載體p2300-35S是通過(guò)包括如下步驟的方法得到的(I)將pCAMBIA2300載體經(jīng)過(guò)EcoRI和HindIII雙酶切，回收8. 7kb的載體大片段；(2)將pBI121載體經(jīng)過(guò)EcoRI和HindIII雙酶切，回收3kb的片段；(3)將步驟(I)中回收8. 7kb的載體大片段與步驟(2)中回收的3kb的片段連接，得到重組載體P2300-35S。所述pCAMBIA2300載體購(gòu)自澳大利亞CAMBIA公司；所述pBI 121載體購(gòu)自Biovector Co.，LTD。擴(kuò)增所述與植物抗蚜蟲(chóng)能力相關(guān)蛋白的編碼基因全長(zhǎng)或其任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述引物對(duì)中，一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述與植物抗蚜蟲(chóng)能力相關(guān)蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到與所述目的植物相比抗蚜蟲(chóng)能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。所述與植物抗蚜蟲(chóng)能力相關(guān)蛋白的編碼基因是通過(guò)所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的 植物中。所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物為煙草。本發(fā)明將包含Amlec基因的重組植物表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草，獲得了轉(zhuǎn)基因煙草，通過(guò)PCR檢測(cè)，結(jié)果表明目的基因已整合到煙草基因組中。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行蚜蟲(chóng)抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草與對(duì)照煙草相比，對(duì)蚜蟲(chóng)的抗性明顯提高，對(duì)蚜蟲(chóng)種群的平均抑制率為35. 5%。Amlec基因能夠提高植物的抗蚜蟲(chóng)能力，在植物抗蚜蟲(chóng)基因工程中具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖I為植物表達(dá)載體p2300-35S_AmLec示意圖。圖2為轉(zhuǎn)p2300-35S_PtLec載體獲得的煙草無(wú)菌苗PCR檢測(cè)圖。圖3為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株RT-PCR檢測(cè)圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、與植物抗蚜蟲(chóng)能力相關(guān)相關(guān)的蛋白及其編碼基因的獲得及功能驗(yàn)證一、與植物抗蚜蟲(chóng)能力相關(guān)的蛋白及其編碼基因的獲得I、Amlec基因片段的克隆利用RNA提取試劑盒(Andybio)提取海芋(Alocasia macrorrhiza)(購(gòu)自大森林花卉市場(chǎng))葉片RNA，同時(shí)根據(jù)已知lectin基因的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物p-Fl (5，-CTTKRTCATGCAGGAHGACTGCA-3，)，p-Rl (5，-CCTGCATSACSAGCHKRTGGTT-3’ )，通過(guò) PCR 擴(kuò)增基因片段。PCR 反應(yīng)條件為94°C變性 5min ;94°C 30sec，53°C 30sec，72°C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 lOmin。將得到的目的片段克隆到PMD18-T載體，熱擊法轉(zhuǎn)化DH5 α，篩選鑒定陽(yáng)性克隆，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，得到基因片段。2、Amlec基因cDNA 3’末端的獲得根據(jù)得到的基因片段設(shè)計(jì)特異引物primerF2(5’ -ACTGCAACGCCGTCCTGTACAATGG-3’)。利用RNA提取試劑盒(Andybio)提取海芋的葉片RNA。參考3’RACE(TaKaRa，Japan)試劑盒說(shuō)明書(shū)，以 3Sites Adaptor Primer (5，GTTTTCCCAGTCACGAC 3，)和 p_F2 為引物，以海芋RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到Amlec3’末端產(chǎn)物。PCR反應(yīng)條件為94°C 變性 5min ;94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 lOmin。將得到的目的片段克隆到PMD18-T載體，熱擊法轉(zhuǎn)化DH5 α，篩選鑒定陽(yáng)性克隆，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，得到基因的3’端序列。3、Amlec基因cDNA 5’末端的獲得根據(jù)得到的基因序列設(shè)計(jì)并合成引物p_RT(5’ -CTTATGGTTCTTCGCGGTGAGC-3’ )、p-R2(5， -GTGAGCATGCCGTCTTCGTAG-3，)和 p-R3(5， -TGCCGTCTTCGTAGAGGACTTGTTC-3，)，根據(jù) 5，RACE 試劑盒(5，RACE Systemfor Rapid Amplification of cDNA Ends, Version
2.0, Invitrogen, USA)說(shuō)明書(shū)，首先利用p_RT引物和反轉(zhuǎn)錄酶Superscript II RT對(duì)葉片RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后去除包含在cDNA中的蛋白、dNTPs、引物、DNA，在cDNA5’末端加上TdT，最后以 5’ RACE 引物(5，-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3’ )和 p-R2(5’-GTGAGCATGCCGTCTTCGTAG-3’)，巢式引物(5，-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’)和 p-R3 (5，-TG CCGTCTTCGTAGAGGACTTGTTC-3’ )進(jìn)行嵌套PCR得到5’末端產(chǎn)物。PCR反應(yīng)條件為94°C變性 4min;94°C 45s, 57°C 30s, 72°C lmin，32 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 lOmin。RACE 得到的產(chǎn)物連接到pMD18T-VeCtor(TaKaRa，Japan)上，篩選鑒定陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行序列測(cè)定，得到基因的5’端序列。4、Amlec基因全長(zhǎng)cDNA的獲得用DNAMAN軟件分析組裝5’和3’序列獲得AmLec全長(zhǎng)cDNA，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，自5'末端起第39位-第851位為其編碼序列，編碼具有序列表中序列I所不的氣基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。序列表中序列I由270個(gè)氣基酸殘基組成。將該基因命名為AmLec，將其編碼的蛋白命名為AmLec。二、植物表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)獲得的Amlec基因全長(zhǎng)cDNA序列，分別設(shè)計(jì)引物p_F3 (5’ -TCTAGAATGGCCAAGCTCCTCCTCTTC-3’ )和 p-R4(5’ -CCCGGGTTATTTCGCTTTCACCTTCTC-3，)。為方便載體構(gòu)建，在p-F3的5’端和p-R4的3’端分別引入Xba I和SmaI酶切位點(diǎn)。以海芋葉片RNA反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C變性4min ；94°C 45s，58°C30s, 72°C lmin，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。目的基因片段連接到pMD18-T_Vector (購(gòu)自Takara公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為D101A)中，獲得Τ-AmLec,進(jìn)行測(cè)序,保證AmLec蛋白cDNA的閱讀框及酶切位點(diǎn)的正確。用Xba I和SmaI酶切T-AmLec質(zhì)粒，回收AmLec基因片段備用。將pBI121 載體(購(gòu)自 Biovector Co. , LTD,產(chǎn)品目錄號(hào)為 Biovector008)經(jīng)過(guò)EcoRI和HindIII雙酶切，回收3kb的片段；將pCAMBIA2300載體(購(gòu)自CAMBIA公司)經(jīng)過(guò)EcoRI和HindIII雙酶切，回收8. 7kb的載體大片段；將回收的8. 7kb的載體大片段與回收的3kb的片段連接，得到中間載體P2300-35S。用Xba I和Sma I酶切此中間載體p2300_35S，回收11. 7kb大小的條帶，與回收的AmLec基因片段重組成目的質(zhì)粒。將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明在載體P2300-35S的Xba I和SmaI酶切位點(diǎn)間插入了序列表中序列2第39到851位所示的AmLec基因片段，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將重組載體命名為植物表達(dá)載體p2300-35S-AmLec。AmLec基因由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，3’末端為NOS終止子(見(jiàn)圖I ;圖中35S P =CaMV 35S啟動(dòng)子；AmLec 海芋凝集素基因AUS β -葡萄糖苷酸酶；Nos 35S 35S的終止子；35S P =CaMV 35S啟動(dòng)子；kan (R):卡那抗性基因；35S PloyA 35S的終止子；RB :T-DNA右邊界；LB :T-DNA左邊界)。三、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得雙價(jià)轉(zhuǎn)基因煙草采用的煙草受體材料為煙草品種NC89(公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所獲得，記載過(guò)該材料的非專(zhuān)利文獻(xiàn)是姚斌，范云六，曾勤，趙榮敏.表達(dá)昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素AalT基因的轉(zhuǎn)基因煙草的抗蟲(chóng)性.生物工程學(xué)報(bào)，1996，12 (2) :113-118)，農(nóng)桿菌為L(zhǎng)BA4404(北京鼎國(guó)生 物技術(shù)有限公司)，具體操作步驟如下I)根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)的制備(I)從平板上挑取單菌落，接種到5ml YEB液體培養(yǎng)基(含鏈霉素Str印125mg/L)，28°C、250rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；(2)取 2ml 菌液，加入 50ml YEB 液體培養(yǎng)基(含 Str印l25mg/L)中，28°C、250rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltl約O. 6左右；(3)將菌液轉(zhuǎn)至50ml無(wú)菌離心管中，冰浴30min。5000rpm離心5min ；(4)棄上清，沉淀用2ml 20mM CaCl2重懸，每份100 μ I分裝到I. 5ml離心管中，液
氣中保存?zhèn)溆谩?2)重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(I)將約 I μ g 的重組質(zhì)粒 p2300-35S-AmLec DNA 加入到 100 μ I LBA4404 感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴5min ；(2)將離心管置液氮中冷凍8min，迅速轉(zhuǎn)至37°C水浴中溫浴5min ；(3)加入Iml YEB液體培養(yǎng)基，在28°C搖床上250rpm復(fù)蘇4_5h ；(4)取適量菌液涂布到含Str印(鏈霉素)250_300mg/L、Rif (利福平)250_300mg/L和Kan (卡那霉素)100mg/L的YEB固體培養(yǎng)基上，置28°C培養(yǎng)24_48h。同時(shí)，按照上述方法，得到轉(zhuǎn)空載體P2300-35S對(duì)照的農(nóng)桿菌菌液。3)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草品種NC89(I)農(nóng)桿菌的活化從平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落，接種到5ml YEB液體培養(yǎng)基中(Kan 100mg/L, Strep100mg/L，Rif 300mg/L)，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；取Iml菌液接種到50ml YEB液體培養(yǎng)基(Kan100mg/L，Strep 100mg/L, Rif 300mg/L)中，劇烈振蕩培養(yǎng)至 OD6tltl 為 0· 4_0· 5 (約 3_4h)；5，OOOrpm離心5min，菌體用MSO培養(yǎng)基(不含激素)重懸，使OD6tltl為O. 1-0. 2。(2)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化a)侵染將煙草葉片切成Icm左右的小圓盤(pán)，在步驟(I)獲得的菌液中放置10分鐘，然后晾干。b)共培養(yǎng)將侵染過(guò)的葉塊擺放在鋪有2層濾紙的煙草芽分化培養(yǎng)基(MS+IAA
O.5mg/L+6-BA 2mg/L)上，25°C暗培養(yǎng)4天，得到經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)的煙草外植體。c)抗性芽的篩選將經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)的煙草外植體轉(zhuǎn)移到抗性芽篩選培養(yǎng)基(MS+IAAO. 5mg/L+6-BA 2mg/L+Kan 100mg/L+Cef (喔抱霉素)500mg/L)上，2 3 周后即可生芽。生根待抗性芽長(zhǎng)到Icm左右時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(MS+Kan IOOmg/L+Cef500mg/L)上，I 2周后即有不定根形成。同時(shí)，用上述方法得到轉(zhuǎn)空載體對(duì)照煙草植株。設(shè)未轉(zhuǎn)化的煙草NC89為野生型對(duì)照煙草。(3)轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè)通過(guò)CTAB 法提取轉(zhuǎn)基因煙草 DNA ，以 AmLec-F (ATGGCCAAGCTCCTCCTCTTC)和AmLec-R(TTATTTCGCTTTCACCTTCTC)為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；同時(shí)，設(shè)非轉(zhuǎn)基因煙草為陰性對(duì)照，質(zhì)粒p2300-35S-AmLec DNA為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果如圖2所示(圖2中Marker為MarkerIII ；泳道I-泳道7為轉(zhuǎn)化獲得煙草苗；泳道8為陰性對(duì)照；泳道9為陽(yáng)性對(duì)照)，從圖中可見(jiàn)，7株轉(zhuǎn)化煙草苗均擴(kuò)增到813bp的目的片段)。利用Trizol提取PCR擴(kuò)增陽(yáng)性植株的RNA，同樣以 AmLec-F (ATGGCCAAGCTCCTCCTCTTC)和 AmLec-R (TTATTTCGCTTTCACCTTCTC)為引物，以煙草RNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；同時(shí)設(shè)非轉(zhuǎn)基因煙草為陰性對(duì)照，質(zhì)粒p2300-35S-AmLeCDNA為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果如圖3所示(圖3中Marker為MarkerIII ;泳道I-泳道5為陽(yáng)性煙草苗(從左向右為圖2中的2、3、4、6和7號(hào)煙草);泳道6為陰性對(duì)照；泳道7為陽(yáng)性對(duì)照)，從圖中可見(jiàn)，陽(yáng)性煙草苗均擴(kuò)增得到813bp的目的基因片段。以上結(jié)果表明目的基因已整合到煙草基因組中?！?4)將PCR和RT-PCR均為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行繼代繁殖，并進(jìn)行編號(hào)，編號(hào)方式為母體號(hào)-1，-2，等依次類(lèi)推，分別得到的轉(zhuǎn)基因煙草植株為2-1、2-2、3-1、3-2、3-3和6。同時(shí)，分別設(shè)野生型對(duì)照植株CK-UCK-2和CK-3和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株K-I和K-2進(jìn)行轉(zhuǎn)基因煙草的抗蚜蟲(chóng)鑒定。四、轉(zhuǎn)基因煙草的抗蚜蟲(chóng)鑒定本實(shí)驗(yàn)委托河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所進(jìn)行,測(cè)試煙姆(Myzus persicaeSulzer)(公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所獲得，記載過(guò)該材料的非專(zhuān)利文獻(xiàn)是尹翔宇；朱信寧；李鑫；馬麗；聞培俊；鄧小成.煙蚜及天敵種群動(dòng)態(tài)的模糊聚類(lèi)分析.中國(guó)煙草科學(xué)，2000，(I) 33-37)為河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所殺蟲(chóng)劑組養(yǎng)蟲(chóng)室內(nèi)飼養(yǎng)在煙草上的煙蚜，飼養(yǎng)條件為溫度23-25°C，相對(duì)濕度50%-80%，光照周期L D =16 8。實(shí)驗(yàn)過(guò)程為用毛筆將2頭煙蚜成蚜接于煙草植株頂部的嫩葉上，置于光周期L D=16 8、溫度23-25°C的養(yǎng)蟲(chóng)室內(nèi)，不同處理間罩上紗網(wǎng)相互隔離以避免煙蚜在不同處理的煙苗上轉(zhuǎn)移，待成蚜產(chǎn)下若蚜后，每株留下10頭若蚜，其余若蚜和成蚜抹去。然后每3天調(diào)查一次煙草上的蚜蟲(chóng)數(shù)量，并統(tǒng)計(jì)11天后蚜蟲(chóng)種群數(shù)量。以轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)蚜蟲(chóng)的種群抑制率作為指標(biāo)，來(lái)評(píng)價(jià)各轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)蚜蟲(chóng)的毒力效果種群抑制率)=(野生型對(duì)照株存活蚜蟲(chóng)數(shù)-轉(zhuǎn)基因煙草株存活蚜蟲(chóng)數(shù))/野生型對(duì)照株存活蚜蟲(chóng)數(shù)*100% )。檢測(cè)結(jié)果如表I所示從表中可看出，2-1、2-2、3-1、3-2、3-3和6號(hào)轉(zhuǎn)Amlec基因煙草都表現(xiàn)出了蚜蟲(chóng)抑制能力，平均抑制率為35. 5%，6號(hào)轉(zhuǎn)基因煙草抑制能力最強(qiáng)，達(dá)到了 48. 4%。而轉(zhuǎn)空載體對(duì)照煙草接蟲(chóng)Ild每個(gè)株系平均頭數(shù)與野生型對(duì)照無(wú)顯著差異。表I陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)煙蚜繁殖的抑制率
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì) (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列I的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗蚜蟲(chóng)相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求I所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-4)中任一所述的基因 1)序列表中序列2自5'末端起第39位-第851位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的基因； 4)與I)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述編碼基因全長(zhǎng)或其任一片段的引物對(duì)，所述引物對(duì)中，一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。
6.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到與所述目的植物相比抗蚜蟲(chóng)能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述的編碼基因是通過(guò)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物為煙草。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了與植物抗蚜蟲(chóng)能力相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種與植物抗蚜蟲(chóng)能力相關(guān)的蛋白。本發(fā)明所提供的與植物抗蚜蟲(chóng)能力相關(guān)的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與抗蚜蟲(chóng)相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明將包含Amlec基因的重組植物表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草，獲得了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行蚜蟲(chóng)抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草與對(duì)照煙草相比，對(duì)蚜蟲(chóng)的抗性明顯提高，對(duì)蚜蟲(chóng)種群的平均抑制率為35.5％。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102952183SQ201110236588
公開(kāi)日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月17日
發(fā)明者王志興, 苗猛猛, 王旭靜, 唐巧玲 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所