專利名稱：一種制備飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
飼養(yǎng)層細(xì)胞是用特定的細(xì)胞(如皮膚成纖維細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞等)經(jīng)射線照射或絲裂霉素-C等阻斷有絲分裂處理后制備的單層細(xì)胞，飼養(yǎng)層細(xì)胞能分泌成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子等促有絲分裂因子，促進(jìn)胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell, ES細(xì)胞)的增殖，同時(shí)也能分泌白血病抑制因子(Leukemia inhibitory {actor, LIF)等細(xì)胞分化抑制因子，抑制ES細(xì)胞的分化。ES細(xì)胞是從胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖嵴中分離，經(jīng)體外抑制分化培養(yǎng)獲得的一種高度未分化的具有多發(fā)育潛能性的細(xì)胞系。ES細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)條件要求極為嚴(yán)格，飼養(yǎng)層的質(zhì)量好壞直接關(guān)系到ES細(xì)胞的分離成功與否。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層能有效促進(jìn)胚胎干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞增殖并維持其未分化特性和多潛能性，故而常用于ES 細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)，是各實(shí)驗(yàn)室開展干細(xì)胞研究的前提，是干細(xì)胞研究不可缺少的環(huán)節(jié)。 目前小鼠胚胎成纖維細(xì)胞fmouse embryonic fibroblast，MEF)制備飼養(yǎng)層主要使用的方法有、射線照射或者使用絲裂霉素C處理。、射線的優(yōu)點(diǎn)是可大批處理MEF細(xì)胞，但是一些小的實(shí)驗(yàn)室不具備實(shí)驗(yàn)條件。因此多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究均采用絲裂霉素C處理MEF來制備飼養(yǎng)層。但是，目前分離培養(yǎng)飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法大多數(shù)屬于經(jīng)驗(yàn)性，制備過程繁瑣，工作量大，細(xì)胞處理的方法、條件尚無確切的規(guī)程和報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法。本發(fā)明提供的制備飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法，包括如下步驟(1)將離體的成纖維細(xì)胞用10 μ g/ml絲裂霉素C處理，分別收集培養(yǎng)液上清和貼壁細(xì)胞；(2)將離體的成纖維細(xì)胞用前一步驟收集的培養(yǎng)液上清處理，收集貼壁細(xì)胞；在所述步驟(1)和所述步驟( 之間還包括0至2次的如下步驟將離體的成纖維細(xì)胞用前一步驟收集的培養(yǎng)液上清處理，分別收集培養(yǎng)液上清和貼壁細(xì)胞；以上每一步驟得到的貼壁細(xì)胞均為飼養(yǎng)層細(xì)胞。所述步驟(1)中，所述成纖維細(xì)胞(離體的)具體可在含10 μ g/ml絲裂霉素C的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行所述處理。所述完全培養(yǎng)基可為任何市售的用于細(xì)胞培養(yǎng)的完全培養(yǎng)基，具體可由DMEM培養(yǎng)基和如下溶質(zhì)組成10% (體積比)FBS，2mmol/Lglutamine。所述步驟(1)，和/或所述步驟O)，和/或所述步驟⑴和所述步驟⑵之間的步驟中，所述處理的條件具體可為37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.證。在進(jìn)行所述方法前，所述成纖維細(xì)胞可先進(jìn)行傳代；用傳代后的成纖維細(xì)胞(離體的)進(jìn)行所述步驟(1)，和/或所述步驟O)，和/或所述步驟(1)和所述步驟( 之間的步驟。所述傳代的方法具體如下將所述成纖維細(xì)胞(離體的)進(jìn)行消化后培育2-4天 (如2-3天)，然后進(jìn)行(1 3)-(1 幻傳代。所述傳代的次數(shù)具體可為2-5次(如3-5 次)，優(yōu)選為3次。所述成纖維細(xì)胞(離體的)進(jìn)行所述消化后培育2-4天后達(dá)到的細(xì)胞密度具體可為 80-90% ο所述方法還可包括將所述貼壁細(xì)胞進(jìn)行消化的步驟。所述方法優(yōu)選包括如下步驟將每一步驟得到的所述貼壁細(xì)胞消化后立即于4°C 放置30分鐘，然后置于-80°C。進(jìn)行所述4°C放置之前，所述貼壁細(xì)胞具體可用完全培養(yǎng)基重懸并與4°C預(yù)冷的2X凍存液等體積混合。所述完全培養(yǎng)基具體可由DMEM培養(yǎng)基和如下溶質(zhì)組成10% (體積比)FBS，2mmol/L glutamine。所述2X凍存液具體可由DMEM培養(yǎng)基和如下溶質(zhì)組成10% (體積比)DMS0，10% (體積比)FBS，2mmol/Lglutamine。所述成纖維細(xì)胞(離體的)具體可為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(離體的)。所述飼養(yǎng)層細(xì)胞具體可為用于培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的飼養(yǎng)層細(xì)胞以上任一所述方法得到的飼養(yǎng)層細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述飼養(yǎng)層細(xì)胞可用于培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞，如人胚胎干細(xì)胞。本發(fā)明提供一種較為簡(jiǎn)捷易掌握的飼養(yǎng)層制備方法，為培養(yǎng)ESC、iPS細(xì)胞并開展相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。利用該方法制備成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層，既簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，又節(jié)省了實(shí)驗(yàn)費(fèi)用。絲裂霉素C作為一種細(xì)胞分裂抑制劑，同時(shí)也屬于劇毒化學(xué)藥品，應(yīng)盡量減少用量。本發(fā)明提供的方法中，絲裂霉素C可重復(fù)利用2-4次，節(jié)約了成本，減少了劇毒藥品的用量。本發(fā)明提供的方法中，細(xì)胞傳代不用計(jì)數(shù)，通過比例及細(xì)胞狀態(tài)來控制，克服計(jì)數(shù)主觀性及不準(zhǔn)確性，每次傳代及絲裂霉素C處理細(xì)胞都處于最好狀態(tài)，傳代間隔2-4天，細(xì)胞狀態(tài)不好及時(shí)丟棄，不再進(jìn)行絲裂霉素C處理及凍存，防止浪費(fèi)試劑耗材，同時(shí)減小對(duì)后期實(shí)驗(yàn)的影響。本發(fā)明提供的方法中，凍存細(xì)胞時(shí)盡量減少常溫狀態(tài)凍存液與細(xì)胞接觸時(shí)間， 這對(duì)得到的飼養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)量至關(guān)重要。本發(fā)明提供的制備飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法流程簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、效果可靠。經(jīng)人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，利用本方法制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞能夠長(zhǎng)期長(zhǎng)活，并能有效的支持人胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)并使其保持未分化狀態(tài)。


圖1為實(shí)施例1中內(nèi)細(xì)胞團(tuán)接種后第7天的照片(尼康倒置顯微鏡(TS-100_F)40 倍)。圖2為實(shí)施例1中人胚胎干細(xì)胞第5次傳代后第5天的照片(尼康倒置顯微鏡 (TS-100-F)40 倍)。圖3為實(shí)施例1中人胚胎干細(xì)胞第5次傳代后第5天的堿性磷酸酶染色結(jié)果(尼康倒置顯微鏡(TS-100-F) 40倍)。圖4為實(shí)施例1中人胚胎干細(xì)胞第5次傳代后第5天檢測(cè)細(xì)胞全能型相關(guān)細(xì)胞因子的(nanog，Oct-4, SSEA-3)表達(dá)情況。
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圖5為實(shí)施例1中人胚胎干細(xì)胞第10次傳代后第5天檢測(cè)細(xì)胞染色體核型。圖6為實(shí)施例2中將步驟(7)得到的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，人胚胎干細(xì)胞第5次傳代后第5天的照片(尼康倒置顯微鏡(TS-100-F) 40倍)。圖7為實(shí)施例2中將步驟⑶得到的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，人胚胎干細(xì)胞第5次傳代后第5天的堿性磷酸酶染色結(jié)果(尼康倒置顯微鏡(TS-100-F) 40倍)。圖8為實(shí)施例2中人胚胎干細(xì)胞第5次傳代后第5天檢測(cè)細(xì)胞全能型相關(guān)細(xì)胞因子的(nanog，Oct-4, SSEA-3)表達(dá)情況。圖9為實(shí)施例2中人胚胎干細(xì)胞第10次傳代后第5天檢測(cè)細(xì)胞全能型相關(guān)細(xì)胞因子的(nanog，Oct-4, SSEA-3)表達(dá)情況。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。絲裂霉素C 液(MitomycinC)購(gòu)自 Sigma，貨號(hào)為 M^87。PBS 緩沖液購(gòu)自 GIBC0，貨號(hào) 14190-144。完全培養(yǎng)基由DMEM培養(yǎng)基(購(gòu)自Invitrogen，貨號(hào)11960-044)和如下溶質(zhì)組成10% (體積比)FBS (購(gòu)自 Invitrogen,貨號(hào) 12484028)，2mmol/L glutamine (購(gòu)自 Chemicon，貨號(hào) TMS-002-C)。人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液由Knockout DMEM(Invitrogen，10829018)DMEM 培養(yǎng)基和如下溶質(zhì)組成15% (體積比)Knockout Serum R 印 lacer (KOSR) (Invitrogen ；貨號(hào) 0828-028) ,5 % (體積比)FBS (購(gòu)自 Hyclone,貨號(hào) SH30070-03)，2mmol/Lglutamine， 4ng/ml basic fibroblast growth factor(bFGF)(Invitrogen,貨號(hào) 13256029),0. ImM 2-Mercaptoethanol (β JflSZiII ；Chemicon, ^ES-007-E) ,0. ImMNonessential Amino acids (Chemicon，貨號(hào) TMS-001-C)。2 X凍存液由DMEM培養(yǎng)基和如下溶質(zhì)組成10 % (體積比)DMSO (購(gòu)自Sigma，貨 D2650), 10% (體積比)FBS，2mmol/L glutamine。ICR孕鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。消化液Trypsin-EDTA(0. 05% Trypsin with EDTA 4Na ；IX)購(gòu)自 Gibco，貨號(hào) 25300054。用于檢測(cè)細(xì)胞因子nanog的一抗購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology,貨號(hào)為 sc-30332。用于檢測(cè)細(xì)胞因子Oct-4的一抗購(gòu)自(Santa Cruz Biotechnology，貨號(hào)為 sc-8629。用于檢測(cè)細(xì)胞因子SSEA-3的一抗購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology,貨號(hào)為 sc-21703。實(shí)施例1、飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備和應(yīng)用效果—、飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備
1、制備小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(原代細(xì)胞)(1)取13.5天ICR孕鼠，斷頸處死，在酒精中浸泡數(shù)秒消毒，控干酒精后置于一個(gè)無菌的培養(yǎng)皿中；無菌條件下暴露子宮，用鑷子提起近子宮頸端，分離子宮系膜，剪斷子宮角；取出整個(gè)子宮，置于有PBS緩沖液的平皿內(nèi)，用PBS緩沖液洗滌三次，棄除表面殘余血跡。(2)沿子宮系膜側(cè)剪開子宮，取出帶有胎膜的胚胎，置于另一盛有PBS緩沖液的平皿內(nèi)，充分洗滌，棄除表面紅細(xì)胞；用小鑷子撕破胎膜，取出胎鼠，棄除胎膜，用PBS緩沖液洗滌三次；剪去胎鼠頭部、四肢和腹部以及內(nèi)臟，將軀干部置于另一盛有PBS緩沖液的平皿內(nèi)，用PBS緩沖液至少洗滌三次，充分棄除紅細(xì)胞。(3)將步驟( 的胚胎組織盡量剪碎，加入5ml消化液37°C消化十分鐘，間隔三分鐘搖晃一次；lOOOrpm/min離心5min，棄上清，收集細(xì)胞沉淀(P0代)。(4)用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀(P0代)，接種至IOOmm培養(yǎng)皿中(一個(gè)胎鼠獲得的細(xì)胞沉淀接種一個(gè)IOOmm皿)。也可采用市售的成纖維細(xì)胞(如小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，可以得到相同的實(shí)驗(yàn)效果。 2、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的傳代傳代過程中細(xì)胞培養(yǎng)均采用完全培養(yǎng)基，傳代均在IOOmm培養(yǎng)皿中進(jìn)行。(1)觀察步驟1的PO代細(xì)胞的貼壁情況，3天后細(xì)胞密度達(dá)到90%左右。(2)將步驟⑴的細(xì)胞進(jìn)行消化后1 3傳代，即為Pl代，培養(yǎng)2天后細(xì)胞密度達(dá)到90%左右。(3)將步驟⑵的細(xì)胞進(jìn)行消化后1 3傳代，即為P2代，培養(yǎng)2天后細(xì)胞密度達(dá)到90%左右。(4)將步驟⑶的細(xì)胞進(jìn)行消化后1 3傳代，即為P3代，培養(yǎng)2天后細(xì)胞密度達(dá)到90%左右。(5)收集10皿步驟(4)的細(xì)胞，加入含10 μ g/ml絲裂霉素C的完全培養(yǎng)基，37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2. 5h ；收集培養(yǎng)液上清(含絲裂霉素C)；貼壁細(xì)胞用PBS緩沖液沖洗 5次，消化后離心，細(xì)胞沉淀重懸于完全培養(yǎng)基，每個(gè)IOOmm培養(yǎng)皿的細(xì)胞用1. 5ml培養(yǎng)液重懸，分裝到凍存管內(nèi)(每只0.5毫升)，然后加入0.5ml預(yù)冷的2 X凍存液，迅速混勻，立即放到4°C冰箱30分鐘，然后放到_80°C冰箱過夜，轉(zhuǎn)入液氮罐中長(zhǎng)期保存。(6)收集10皿步驟(4)的細(xì)胞，加入步驟(5)收集的培養(yǎng)液上清，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2. ;收集培養(yǎng)液上清(含絲裂霉素C)；貼壁細(xì)胞用PBS緩沖液沖洗5次，消化后離心，細(xì)胞沉淀重懸于完全培養(yǎng)基，每個(gè)IOOmm培養(yǎng)皿的細(xì)胞用1. 5ml培養(yǎng)液重懸，分裝到凍存管內(nèi)(每只0. 5毫升)，然后加入0. 5ml預(yù)冷的2 X凍存液，迅速混勻，立即放到4°C 冰箱30分鐘，然后放到_80°C冰箱過夜，轉(zhuǎn)入液氮罐中長(zhǎng)期保存。(7)收集10皿步驟(4)的細(xì)胞，加入步驟(6)收集的培養(yǎng)液上清，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2. ;收集培養(yǎng)液上清(含絲裂霉素C)；貼壁細(xì)胞用PBS緩沖液沖洗5次，消化后離心，細(xì)胞沉淀重懸于完全培養(yǎng)基，每個(gè)IOOmm培養(yǎng)皿的細(xì)胞用1. 5ml培養(yǎng)液重懸，分裝到凍存管內(nèi)(每只0. 5毫升)，然后加入0. 5ml預(yù)冷的2 X凍存液，迅速混勻，立即放到4°C 冰箱30分鐘，然后放到_80°C冰箱過夜，轉(zhuǎn)入液氮罐中長(zhǎng)期保存。
(8)收集10皿步驟(4)的細(xì)胞，加入步驟(7)收集的培養(yǎng)液上清，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2. 5h ；棄培養(yǎng)液上清；貼壁細(xì)胞用PBS緩沖液沖洗5次，消化后離心，細(xì)胞沉淀重懸于完全培養(yǎng)基，每個(gè)IOOmm培養(yǎng)皿的細(xì)胞用1.5ml培養(yǎng)液重懸，分裝到凍存管內(nèi)(每只0. 5毫升)，然后加入0. 5ml預(yù)冷的2X凍存液，迅速混勻，放到4°C冰箱30分鐘，然后放到_80°C冰箱過夜，轉(zhuǎn)入液氮罐中長(zhǎng)期保存。二、飼養(yǎng)層細(xì)胞的應(yīng)用效果分別檢測(cè)步驟( 保存的細(xì)胞、步驟(6)保存的細(xì)胞、步驟(7)保存的細(xì)胞和步驟 (8)保存的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞的應(yīng)用效果，具體步驟如下1、用0.丨“^明膠處理培養(yǎng)板力？！力^ CO2培養(yǎng)箱中孵育半小時(shí)備用。2、將保存的飼養(yǎng)層細(xì)胞解凍，每只凍存管解凍后，細(xì)胞可接種至6個(gè)4孔板(或6 個(gè)35mmDish)中，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時(shí)，備用。3、吸棄培步驟2的培養(yǎng)液上清，用人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液漂洗一次，然后每孔加入 500微升人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)。4、利用離體人囊胚期胚胎，用機(jī)械法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，將其接種至步驟3的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，培養(yǎng)7天后用機(jī)械法進(jìn)行第一次傳代，之后每5天傳代一次，每次原孔留10個(gè)切割消化后的小克??；每天更換新的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液；連續(xù)觀察培養(yǎng)過程中的細(xì)胞克隆形態(tài)。采用步驟(8)保存的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞(人胚胎干細(xì)胞)接種后第7天的照片見圖1，克隆周圍的細(xì)胞是飼養(yǎng)層細(xì)胞。采用步驟(5)保存的細(xì)胞、步驟(6) 保存的細(xì)胞或步驟(7)保存的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞(人胚胎干細(xì)胞)接種后第7天的照片與圖1 一致。采用步驟(8)保存的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，人胚胎干細(xì)胞第5次傳代后第5天的照片見圖2，可見細(xì)胞邊界清晰。采用步驟(5)保存的細(xì)胞、步驟(6)保存的細(xì)胞或步驟(7) 保存的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，人胚胎干細(xì)胞第5次傳代后第5天的照片與圖2 —致。采用步驟(8)保存的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，人胚胎干細(xì)胞第5次傳代后第5天進(jìn)行堿性磷酸酶染色的照片見圖3，可見細(xì)胞染色陽(yáng)性。采用步驟( 保存的細(xì)胞、步驟(6)保存的細(xì)胞或步驟(7)保存的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，人胚胎干細(xì)胞第5次傳代后第5天進(jìn)行堿性磷酸酶染色的照片與圖3 —致。采用步驟(8)保存的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，人胚胎干細(xì)胞第5次傳代后第5天檢測(cè)細(xì)胞全能型相關(guān)細(xì)胞因子的(nanOg，0ct-4，SSEA-3)表達(dá)情況，照片見圖 4，各個(gè)細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。采用步驟( 保存的細(xì)胞、步驟(6)保存的細(xì)胞或步驟(7)保存的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，人胚胎干細(xì)胞第5次傳代后第5天檢測(cè)細(xì)胞全能型相關(guān)細(xì)胞因子的(nanog，Oct-4, SSEA-3)表達(dá)情況，照片與圖4 一致。采用步驟(8)保存的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，人胚胎干細(xì)胞第10次傳代后第5天檢測(cè)細(xì)胞核型，見圖5，細(xì)胞核型正常，為46XX。采用步驟(5)保存的細(xì)胞、步驟(6)保存的細(xì)胞或步驟(7)保存的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，人胚胎干細(xì)胞第10次傳代后第5天檢測(cè)細(xì)胞核型，圖片與圖5—致。采用本發(fā)明提供的飼養(yǎng)層細(xì)胞，人胚胎干細(xì)胞經(jīng)傳代五十次后，所得到的干細(xì)胞仍然保持良好的全能性。也可用所述飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)其它現(xiàn)有的人胚胎干細(xì)胞，同樣可以長(zhǎng)時(shí)間的維持細(xì)胞全能型。
實(shí)施例2、飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備和應(yīng)用效果一、飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備小鼠胚胎成纖維細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)sciencell公司，貨號(hào)為M7M0。2、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的傳代傳代過程中細(xì)胞培養(yǎng)均采用完全培養(yǎng)基，傳代均在IOOmm培養(yǎng)皿中進(jìn)行。(1)培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(P0代細(xì)胞)，觀察貼壁情況，3天后細(xì)胞密度達(dá)到 90%左右。(2)將步驟到80%左右。(3)將步驟到80%左右。(4)將步驟到80%左右。(5)將步驟到80%左右。(6)將步驟到80%左右。(7)收集10皿步驟(6)的細(xì)胞，加入含10 μ g/ml絲裂霉素C的完全培養(yǎng)基，37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2. 5h ；收集培養(yǎng)液上清(含絲裂霉素C)；貼壁細(xì)胞用PBS緩沖液沖洗 5次，消化后離心，細(xì)胞沉淀重懸于完全培養(yǎng)基，每個(gè)IOOmm培養(yǎng)皿的細(xì)胞用1. 5ml培養(yǎng)液重懸，分裝到凍存管內(nèi)(每只0.5毫升)，然后加入0.5ml預(yù)冷的2 X凍存液，迅速混勻，立即放到4°C冰箱30分鐘，然后放到_80°C冰箱過夜，轉(zhuǎn)入液氮罐中長(zhǎng)期保存。(8)收集10皿步驟(6)的細(xì)胞，加入步驟(7)收集的培養(yǎng)液上清，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2. ;收集培養(yǎng)液上清(含絲裂霉素C)；貼壁細(xì)胞用PBS緩沖液沖洗5次，消化后離心，細(xì)胞沉淀重懸于完全培養(yǎng)基，每個(gè)IOOmm培養(yǎng)皿的細(xì)胞用1. 5ml培養(yǎng)液重懸，分裝到凍存管內(nèi)(每只0.5毫升)，然后加入0.5ml預(yù)冷的2 X凍存液，迅速混勻，立即放到4°C 冰箱30分鐘，然后放到_80°C冰箱過夜，轉(zhuǎn)入液氮罐中長(zhǎng)期保存。二、飼養(yǎng)層細(xì)胞的應(yīng)用效果分別檢測(cè)步驟(7)保存的細(xì)胞和步驟(8)保存的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞的應(yīng)用效果，具體步驟如下1、用0. !^明膠處理培養(yǎng)板力了！力^ CO2培養(yǎng)箱中孵育半小時(shí)備用。2、將保存的飼養(yǎng)層細(xì)胞解凍，每只凍存管解凍后，細(xì)胞可接種至6個(gè)4孔板(或6 個(gè)35mmDish)中，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時(shí)，備用。3、吸棄培步驟2的培養(yǎng)液上清，用人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液漂洗一次，然后每孔加入 500微升人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)。4、利用離體人囊胚期胚胎，用機(jī)械法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，將其接種至步驟3的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，培養(yǎng)7天后用機(jī)械法進(jìn)行第一次傳代，之后每5天傳代一次，每次原孔留10個(gè)切割消化后的小克隆；每天更換新的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液；連續(xù)觀察培養(yǎng)過程中的細(xì)胞克隆形態(tài)。
(1)的細(xì)胞進(jìn)行消化后1 5傳代，即為Pl代，培養(yǎng)3天后細(xì)胞密度達(dá)
(2)的細(xì)胞進(jìn)行消化后1 5傳代，即為P2代，培養(yǎng)3天后細(xì)胞密度達(dá)
(3)的細(xì)胞進(jìn)行消化后1 5傳代，即為P3代，培養(yǎng)3天后細(xì)胞密度達(dá)
(4)的細(xì)胞進(jìn)行消化后1 5傳代，即為P4代，培養(yǎng)3天后細(xì)胞密度達(dá)
(5)的細(xì)胞進(jìn)行消化后1 5傳代，即為P5代，培養(yǎng)3天后細(xì)胞密度達(dá)
采用步驟(7)保存的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞(人胚胎干細(xì)胞)第5 次傳代后第5天的照片見圖6，可見細(xì)胞邊界清晰。采用步驟(8)保存的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞(人胚胎干細(xì)胞)第5次傳代后第5天的照片見圖7，可見細(xì)胞邊界清晰。 采用步驟(7)保存的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，人胚胎干細(xì)胞第5次傳代后第5天檢測(cè)細(xì)胞全能型相關(guān)細(xì)胞因子的(nanog，Oct-4, SSEA-3)表達(dá)情況，照片見圖8，各個(gè)細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。采用步驟(8)保存的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，人胚胎干細(xì)胞第5次傳代后第 5天檢測(cè)細(xì)胞全能型相關(guān)細(xì)胞因子的(nanog，Oct-4, SSEA-3)表達(dá)情況，照片與圖8 一致。采用步驟(7)保存的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，人胚胎干細(xì)胞第10次傳代后第5天檢測(cè)細(xì)胞全能型相關(guān)細(xì)胞因子的(nanog，Oct-4, SSEA-3)表達(dá)情況，照片見圖9，各個(gè)細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。采用步驟(8)保存的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，人胚胎干細(xì)胞第10次傳代后第5天檢測(cè)細(xì)胞全能型相關(guān)細(xì)胞因子的(nanog，Oct-4，SSEA-3)表達(dá)情況，照片與圖 9 一致。采用本發(fā)明提供的飼養(yǎng)層細(xì)胞，人胚胎干細(xì)胞經(jīng)傳代五十次后，所得到的干細(xì)胞仍然保持良好的全能性。
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權(quán)利要求
1.一種制備飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法，包括如下步驟(1)將離體的成纖維細(xì)胞用10μ g/ml絲裂霉素C處理，分別收集培養(yǎng)液上清和貼壁細(xì)胞；(2)將離體的成纖維細(xì)胞用前一步驟收集的培養(yǎng)液上清處理，收集貼壁細(xì)胞；在所述步驟⑴和所述步驟⑵之間還包括0至2次的如下步驟將離體的成纖維細(xì)胞用前一步驟收集的培養(yǎng)液上清處理，分別收集培養(yǎng)液上清和貼壁細(xì)胞； 以上每一步驟得到的貼壁細(xì)胞均為飼養(yǎng)層細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中，所述成纖維細(xì)胞在含 10 μ g/ml絲裂霉素C的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行所述處理。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟(1)，和/或所述步驟O)，和 /或所述步驟(1)和所述步驟( 之間的步驟中，所述處理的條件為37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2. 5h。
4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于在進(jìn)行所述方法前，所述成纖維細(xì)胞先進(jìn)行傳代；用傳代后的成纖維細(xì)胞進(jìn)行所述步驟(1)，和/或所述步驟0)，和/或所述步驟(1)和所述步驟( 之間的步驟。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述傳代的方法如下將所述成纖維細(xì)胞進(jìn)行消化后培育2-4天，然后進(jìn)行(1 3)-(1 幻傳代。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述成纖維細(xì)胞進(jìn)行所述消化后培育2-4 天后達(dá)到的細(xì)胞密度為80-90%。
7.如權(quán)利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括將所述貼壁細(xì)胞進(jìn)行消化的步驟；所述方法優(yōu)選包括如下步驟將每一步驟得到的所述貼壁細(xì)胞消化后立即于4°C放置30分鐘，然后置于_80°C。
8.如權(quán)利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于所述成纖維細(xì)胞為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞；所述飼養(yǎng)層細(xì)胞為用于培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的飼養(yǎng)層細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1至8中任一所述方法得到的飼養(yǎng)層細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9所述飼養(yǎng)層細(xì)胞在培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟(1)將離體的成纖維細(xì)胞用10μg/ml絲裂霉素C處理，分別收集培養(yǎng)液上清和貼壁細(xì)胞；(2)將離體的成纖維細(xì)胞用前一步驟收集的培養(yǎng)液上清處理，收集貼壁細(xì)胞；在所述步驟(1)和所述步驟(2)之間還包括0至2次的如下步驟將離體的成纖維細(xì)胞用前一步驟收集的培養(yǎng)液上清處理，分別收集培養(yǎng)液上清和貼壁細(xì)胞；以上每一步驟得到的貼壁細(xì)胞均為飼養(yǎng)層細(xì)胞。本發(fā)明提供的制備飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法流程簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、效果可靠。經(jīng)人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，利用本方法制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞能夠長(zhǎng)期傳代，并能有效的支持人胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)并使其保持未分化狀態(tài)。
文檔編號(hào)C12N5/0735GK102277329SQ20111023737
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月18日
發(fā)明者嚴(yán)杰, 喬杰, 于洋, 張妍, 李蓉, 閆麗盈, 靳紅艷 申請(qǐng)人:北京大學(xué)第三醫(yī)院