專利名稱：一種用分子信標(biāo)快速檢測金黃色葡萄球菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子信標(biāo)，即熒光原位雜交信號經(jīng)流式細(xì)胞儀高靈敏識別，直接定量檢測到病人分泌物標(biāo)本中低含量的金黃色葡萄球菌，同時(shí)也適用于陽性血培養(yǎng)物中金黃色葡萄球菌的快速定量檢測。
背景技術(shù)：
目前國內(nèi)外金黃色葡萄球菌的檢測多采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法以及分子生物學(xué)技術(shù)[1]。 然而，培養(yǎng)法耗時(shí)長，需1-4天，不利于感染性疾病的早期診斷以及醫(yī)院或社區(qū)獲得性感染的預(yù)防與控制。盡管PCR方法能夠快速、特異性檢測金黃色葡萄球菌，但實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增產(chǎn)物污染以及病人標(biāo)本中可能存在有未知的酶抑制劑等問題難以克服，及時(shí)采用熒光原位雜交檢測方法也不能直接用于分泌物標(biāo)本中金黃色葡萄球菌的檢測，因此，分子生物學(xué)的方法在臨床試驗(yàn)室的應(yīng)用受到一定程度的限制。分子信標(biāo)(Molecular beacon,MB)由于其特異性強(qiáng)、靈敏度高并可在均相溶液中與靶核酸分子進(jìn)行雜交等特點(diǎn)而在熒光原位雜交技術(shù)中得到應(yīng)用M。文獻(xiàn)檢索披露PCR和FISH技術(shù)用于金黃色葡萄球菌的檢測已有多篇報(bào)道[1_6]，這些技術(shù)方法的建立能夠?qū)Σ∪朔置谖飿?biāo)本以及陽性血培養(yǎng)物中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行快速檢測。但是PCR方法容易造成擴(kuò)增產(chǎn)物污染，這使得金黃色葡萄球菌在臨床實(shí)驗(yàn)室的檢測受到了一定程度的限制。目前，在已報(bào)道的多種用于檢測金黃色葡萄球菌的FISH技術(shù)均是采用線形探針進(jìn)行雜交檢測，并且所檢測的標(biāo)本均來源于血培養(yǎng)瓶中的陽性培養(yǎng)物。這種情況存在2個(gè)缺點(diǎn)一是線形探針不能用于均相溶液中靶分子的檢測，因此，在雜交檢測時(shí)必須進(jìn)行標(biāo)本的固定或者對探針進(jìn)行固定，雜交反應(yīng)完成后必須進(jìn)行嚴(yán)格的沖洗以去除未雜交的探針，否則熒光背景信號高；二是病人分泌物標(biāo)本中的金黃色葡萄球菌的含量低， 不能對這樣的標(biāo)本進(jìn)行直接檢測，因此，F(xiàn)ISH的應(yīng)用受到了限制。本發(fā)明將分子信標(biāo)可在均相溶液中對靶分子進(jìn)行雜交檢測的特點(diǎn)與流式細(xì)胞儀高分辨、高靈敏度識別熒光染色細(xì)胞的特點(diǎn)相結(jié)合快速對病人分泌物標(biāo)本及陽性血培養(yǎng)物中金黃色葡萄球菌進(jìn)行熒光原位雜交檢測。分子信標(biāo)熒光原位雜交反應(yīng)體系的建立首先簡化了 FISH的操作步驟，無需對標(biāo)本或探針進(jìn)行固定，也不用對未雜交的探針進(jìn)行沖洗去除，雜交檢測可一步完成，最大限度地降低了干擾因素對實(shí)驗(yàn)的影響；其次流式細(xì)胞分析儀可以高靈敏度定量識別熒光染色的細(xì)胞，不但能直接定量檢測病人分泌物標(biāo)本中低含量細(xì)菌，而且能夠?qū)﹃栃匝囵B(yǎng)物中完整的活細(xì)胞進(jìn)行定量檢測，克服了目前FISH不能用于分泌物標(biāo)本中低含量細(xì)菌檢測的局限。本發(fā)明針對金黃色葡萄球菌特異性的16SrRNA片斷，設(shè)計(jì)、合成分子信標(biāo)探針，建立穩(wěn)定的分子信標(biāo)熒光原位雜交反應(yīng)體系，克服了培養(yǎng)法耗時(shí)長以及目前分子生物學(xué)技術(shù)檢測的諸多問題，為金黃色葡萄球菌感染性疾病的早期診斷以及醫(yī)院或社區(qū)獲得性感染的預(yù)防、控制提供新的快速檢測方法
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于利用熒光原位雜交-流式細(xì)胞術(shù)法，建立一種快速、靈敏、特異檢測病人分泌物標(biāo)本以及陽性血培養(yǎng)物中低含量金黃色葡萄球菌的方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種用分子信標(biāo)快速檢測金黃色葡萄球菌的方法， 包括以下步驟1)針對金黃色葡萄球菌ATCC25923的16SrRNA的片斷選擇靶序列，人工設(shè)計(jì)分子信標(biāo)探針MB，其堿基組成為5，-FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-DABCYL-3，；熒光基團(tuán)激發(fā)波長495nm，檢測波長520nm;同時(shí)設(shè)計(jì)出與分子信標(biāo)完全互補(bǔ)的寡核苷酸(P: 5’ -ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3’)；2)通過對分子信標(biāo)特性確定熒光原位雜交的溫度為 50°C，計(jì)算分子信標(biāo)S/B值；3)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光原位雜交，確定的反應(yīng)體系，即去離子甲酰胺的濃度為10%，金黃色葡萄球菌的菌液濃度為20xl05cfU/y 1，分子信標(biāo)的濃度為 10 ng/μ 1。本發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)或原理熒光原位雜交(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)技術(shù)是一種應(yīng)用非放射性熒光物質(zhì)標(biāo)記的核酸探針根據(jù)雜交原理檢測細(xì)胞或組織內(nèi)特定DNA或RNA的方法，1996年Tyagi和Kramer[1]首次報(bào)道了一種可以實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增過程的新型熒光標(biāo)記探針，即分子信標(biāo)，與眾多用于熒光原位雜交技術(shù)的核酸探針不同的是分子信標(biāo)具有獨(dú)特的空間“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，在未結(jié)合靶分子時(shí)，分子信標(biāo)呈“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，有一個(gè)環(huán)序列(loop)與一莖序列(stem)，其中環(huán)是與靶分子互補(bǔ)的核酸堿基序列，莖為兩列與靶分子雜交無關(guān)的互補(bǔ)堿基序列，在探針的兩端分別標(biāo)記有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，當(dāng)探針處于完整的“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)時(shí)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)由于莖序列的互補(bǔ)結(jié)合而彼此緊密相鄰，從而產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)效應(yīng)，導(dǎo)致熒光信號被有效淬滅而不能釋放出來，當(dāng)探針與互補(bǔ)的靶分子結(jié)合時(shí)，分子信標(biāo)的“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)被打開，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)彼此分離，熒光信號不能被淬滅而得以釋放，本發(fā)明中流式細(xì)胞儀能夠檢測到雜交后的熒光信號，從而檢測到金黃色葡萄球菌，彰顯技術(shù)進(jìn)步。


本發(fā)明對照附圖作進(jìn)一步的闡明附圖為分子信標(biāo)熱變性曲線如圖所示上曲線為分子信標(biāo)與完全互補(bǔ)的寡核苷酸雜交曲線，對應(yīng)熒光強(qiáng)度值即F open;中間曲線為分子信標(biāo)隨溫度變化的曲線，對應(yīng)熒光強(qiáng)度值即F closed;下曲線為緩沖液隨溫度變化的曲線，對應(yīng)熒光強(qiáng)度值即F buffer.
具體實(shí)施方式
實(shí)施例(1)分子信標(biāo)及寡核苷酸序列的設(shè)計(jì)與合成
針對金黃色葡萄球菌ATCC25923的16S rRNA序列，設(shè)計(jì)出能特異地檢測金黃色葡萄球菌的分子信標(biāo)(5’ -FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-DABCYL-3’ )及與其完全互補(bǔ)的寡核苷酸 (P :5，-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3，)。
(2)通過對分子信標(biāo)做熱變性曲線實(shí)驗(yàn)，確定熒光原位雜交的最佳溫度為5(TC， 計(jì)算分子信標(biāo) S/B (Signal-to-background ratio，S/B)值S/B =(F open-F buffer)/(F closed—F buffer)；
用流式豳進(jìn)行熒*原位雜交.病定纖_反應(yīng)體系；用正交設(shè)W敦件擴(kuò)
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(3)選擇出能特異性地檢測金黃色葡萄球菌的靶序列，在該段靶序列上用beacon designer〗· 1軟件設(shè)計(jì)與其完全互補(bǔ)的分子信標(biāo)探針(5，-FAM_cgctgaAGAAGCAAGCTTCTCGTC CGTtcagcg-DABCYL-3')，該分子信標(biāo)是由堿基組成的頸環(huán)結(jié)構(gòu)的特異序列，其中5，端用FAM 標(biāo)記，3，端用DABCTL標(biāo)記，熒光基團(tuán)要求激發(fā)波長495nm，檢測波長520nm ；人工設(shè)計(jì)合成分子信標(biāo)及與其完全互補(bǔ)的寡核苷酸。 (4) 3種溶液在PCR反應(yīng)管中配制后置于熒光定量PCR儀中，溫度從80°C下降到
530°C，溫度每降低1°C采集一次熒光；將3種溶液從80°C下降到30°C的熒光強(qiáng)度做散點(diǎn)圖即為MB的熱變性曲線；從熱變性曲線圖看出，溫度在45-55°C內(nèi)時(shí)，MB與完全互補(bǔ)的寡核苷酸雜交穩(wěn)定，熒光強(qiáng)度較高；MB隨溫度降低，曲線較平緩，說明熒光強(qiáng)度較穩(wěn)定；當(dāng)溫度在50°C時(shí)，MB與完全互補(bǔ)的寡核苷酸雜交的熒光強(qiáng)度最高，因此可確定最佳的雜交溫度為 500C ；并計(jì)算出S/B值，由表1可見實(shí)驗(yàn)6中S/B值最高，說明該組為最佳反應(yīng)體系。(5)按照表2配制雜交溶液，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光原位雜交，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果(陽性標(biāo)本的熒光值減去陰性對照的熒光值)，可確定最佳反應(yīng)體系是第2組，即去離子甲酰胺的濃度為10%，金黃色葡萄球菌的菌液濃度為20X105cfu/y 1，分子信標(biāo)的濃度為10 ng/ μ ；
(6)獲取金黃色葡萄球菌的菌液將金黃色葡萄球菌ATCC25923接種于哥倫比亞血瓊脂平板培養(yǎng)，挑取對數(shù)生長期的菌落，用無菌的20 mM Tris-HCl, pH 7. 2緩沖液調(diào)至 20xl05cfu/y 1 濃度；
其1菌體制備吸取20xl05cfu/y 1的金黃色葡萄球菌^il，10000 rpm離心5 min，收集菌體；加入6ml固定液，固定液為4%多聚甲醛+96% 20 mM Tris-HCl，pH 7. 2 ；4 °C固定 Ih ；離心10000 rpm, 5 min，除去殘留的多聚甲醛；用20 mM Tris-HCl，pH 7. 2緩沖液洗滌 1次，得菌體沉淀物；
其2酶處理向上述的菌體沉淀物中加入lmg/ml溶葡萄球菌酶100 μ 1，37°C，15 min ；收集菌體 10000 rpm, 5 min ；分別用 50%、80%、95% 乙醇脫水 3min ；用 20 μ 1 20 mM Tris-HCl緩沖液重懸菌體，平均加入2個(gè)管中備用；
其3配制雜交緩沖液在EP管中加入10 μ 1 100 ng/ μ 1的MB和10 μ 1100%的去離子甲酰胺后，用20 mM 1Tris-HCl補(bǔ)足至100 μ 1 ；對照緩沖液在EP管中加入10μ 1100%的去離子甲酰胺后，用20 mM Tris-HCl緩沖液補(bǔ)足至100μ 1，備用；
其4雜交經(jīng)酶處理的產(chǎn)物一管作為陽性，加入100 μ 1雜交緩沖液；另一管作為陰性對照，加入100 μ 1陰性對照緩沖液；2個(gè)管置于50 °C，避光雜交池，2個(gè)管分別收集菌體 10000 rpm, 5 min ;2個(gè)管分別加入不含探針的100 μ 1緩沖液，于48 °C洗滌15min ;2個(gè)管分別重懸于500μ 1緩沖液中，置于冰上，3h內(nèi)取樣，過濾后測定。(7)分子信標(biāo)的濃度為1 OD的分子信標(biāo)質(zhì)量數(shù)為32. 68ug，在管中加入327 μ 20 mM Tris-HCl, pH 7. 2緩沖液溶解，則配成濃度為100 ng/μ 1的母液貯存。(8)上述的分子信標(biāo)及寡核苷酸序列，由上海生工生物工程有限公司合成；多聚甲酸、20 mM Tris-HCl、去離子甲酰胺和溶葡萄球菌酶Iysostaphin 7386均購自Sigma ；哥倫比亞血瓊脂平板購自鄭州安圖綠科生物工程有限公司。
權(quán)利要求
1.一種用分子信標(biāo)快速檢測金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于1)針對金黃色葡萄球菌ATCC25923的16SrRNA的片斷選擇靶序列，人工設(shè)計(jì)分子信標(biāo)探針MB，其堿基組成為 5，-FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT -DABCYL-3，，其中 5，端用 FAM 標(biāo)記，3，端用 DABCYL 標(biāo)記，熒光基團(tuán)激發(fā)波長495nm，檢測波長520nm ；并設(shè)計(jì)出與分子信標(biāo)完全互補(bǔ)的寡核苷酸 (P :5’ -ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3’)；2)通過對分子信標(biāo)特性確定熒光原位雜交的溫度為 50°C，計(jì)算分子信標(biāo)S/B值；3)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光原位雜交，確定去離子甲酰胺的濃度為10%，金黃色葡萄球菌的菌液濃度為20xl05cfU/y 1，分子信標(biāo)的濃度為10 ng/μ ；其中將金黃色葡萄球菌ATCC25923接種于哥倫比亞血瓊脂平板培養(yǎng)，挑取對數(shù)生長期的菌落，用無菌的20 mM Tris-HCl，pH 7. 2緩沖液調(diào)至20X105Cfu/l·! 1濃度；其1菌體制備吸取20xl05cfu/y 1的金黃色葡萄球菌^il，10000 rpm離心5 min，收集菌體；加入6ml固定液，固定液為4%多聚甲醛+96% 20 mM Tris-HCl，pH 7. 2 ；4 °C固定 Ih ；離心10000 rpm, 5 min，除去殘留的多聚甲醛；用20 mM Tris-HCl，pH 7. 2緩沖液洗滌 1次，得菌體沉淀物；其2酶處理向上述的菌體沉淀物中加入lmg/ml溶葡萄球菌酶100 μ 1，37°C，15 min ；收集菌體 10000 rpm, 5 min ；分別用 50%、80%、95% 乙醇脫水 3min ；用 20 μ 1 20 mM Tris-HCl緩沖液重懸菌體，平均加入2個(gè)管中備用；其3配制雜交緩沖液在EP管中加入10 μ 1100 ng/μ 1的MB和10 μ 1100%的去離子甲酰胺后，用20 mM 1Tris-HCl補(bǔ)足至100 μ 1 ；對照緩沖液在EP管中加入10 μ 1100%的去離子甲酰胺后，用20 mM Tris-HCl緩沖液補(bǔ)足至100μ 1，備用；其4雜交經(jīng)酶處理的產(chǎn)物一管作為陽性，加入100 μ 1雜交緩沖液；另一管作為陰性對照，加入100 μ 1陰性對照緩沖液；2個(gè)管置于50 °C，避光雜交池，2個(gè)管分別收集菌體 10000 rpm, 5 min ;2個(gè)管分別加入不含探針的100 μ 1緩沖液，于48 °C洗滌15min ;2個(gè)管分別重懸于500μ 1緩沖液中，置于冰上，3h內(nèi)取樣，過濾后測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于分子信標(biāo)的濃度為1OD的分子信標(biāo)質(zhì)量數(shù)為32. 68ug，在管中加入327 μ 1 20 mM 1Tris-HCl，pH 7. 2緩沖液溶解，則配成濃度為 100 ng/μ 1的母液貯存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于分子信標(biāo)S/B值的計(jì)算S/B=F open-F buffer/F closed-F buffer。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所用的分子信標(biāo)及寡核苷酸序列，由上海生工生物工程有限公司合成；多聚甲醛、20 mM Tris-HCl、去離子甲酰胺和溶葡萄球菌酶 Iysostaphin 7386均購自Sigma ；哥倫比亞血瓊脂平板購自鄭州安圖綠科生物工程有限公司ο
全文摘要
本發(fā)明提供的一種用分子信標(biāo)快速檢測金黃色葡萄球菌的方法，1)針對金黃色葡萄球菌ATCC25923的16SrRNA的片斷選擇靶序列，人工設(shè)計(jì)分子信標(biāo)探針MB，其堿基組成為5’-FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-DABCYL-3’，其中5’端用FAM標(biāo)記，3’端用DABCYL標(biāo)記，熒光基團(tuán)激發(fā)波長495nm，檢測波長520nm；并設(shè)計(jì)出與分子信標(biāo)完全互補(bǔ)的寡核苷酸(P5’-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3’)；2)通過對分子信標(biāo)特性確定熒光原位雜交的溫度為50℃，計(jì)算分子信標(biāo)S/B值；3)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光原位雜交，確定去離子甲酰胺的濃度為10%，金黃色葡萄球菌的菌液濃度為20x105cfu/μl，分子信標(biāo)的濃度為10ng/μl。
文檔編號C12Q1/06GK102304571SQ20111023771
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月18日
發(fā)明者吳良, 唐金路, 張新, 苗書魁, 陳旭, 馬集云, 鹿新紅 申請人:新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)醫(yī)院