專利名稱：一種肝素黃桿菌軟骨素酶b和軟骨素酶ac的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種軟骨素酶B和軟骨素酶AC的制備方法，尤其涉及一種由氯化鈣全程保護之下、并含肝素和硫酸皮膚素緩沖液洗脫的特殊層析分離技術(shù)制備軟骨素酶B和軟骨素酶AC的方法。
背景技術(shù)：
軟骨素(⑶)是糖胺聚糖的一類，由已糖醛酸-乙酰化半乳糖胺重復(fù)組成長鏈骨架。依糖鏈硫酸化程度可分成7小類未硫酸化軟骨素(無硫酸基)、多硫酸軟骨素(完全硫酸化)、硫酸軟骨素A-E，后5種在硫酸化位點和硫酸化程度上各有不同。其中軟骨素A、 B、C是最常見的3種，而軟骨素B又被稱作硫酸皮膚素(此)。這些軟骨素類可能參與調(diào)節(jié)多種生理環(huán)節(jié)如細胞分化、細胞結(jié)合、激素作用等。軟骨素酶是一類能特異性降解軟骨素多糖鏈的酶，可以由此探索軟骨素在胞內(nèi)的生理作用并研究開發(fā)用于臨床治療的藥物。軟骨素酶最早的研究大概起自1957年，Korn等從肝素黃桿菌(FlavcAac terium heparinum)中分離出可降解硫酸軟骨素的活性部分。1975年，日本學(xué)者Manabu等從自然生境中篩選出253種產(chǎn)軟骨素酶的細菌，分別歸屬于七個屬Aeromonas (氣單胞菌屬)，Vibrio (弧菌屬)，F(xiàn)lavobacterium (黃桿菌屬)， Beneckea, Proteus, Micrococcus (微球菌屬),Arthrobacter (節(jié)桿菌屬)。發(fā)現(xiàn)其中一禾中氣單胞菌產(chǎn)軟骨素酶AC的能力遠高于肝素黃桿菌，純化后比活為99. 7U/mg。Takegawa等(1991)報道了一種分離自金色細菌的可降解CS A、C的酶，分子量約 82000，銅離子是其抑制劑。Linn等(1985)報道兩種可降解CS A、C的酶，分離自Bacteroides thetaiotaomicron，分子量分別為 104000 和 108000。加拿大IBEX公司是近些年研究、開發(fā)、銷售肝素黃桿菌軟骨素酶的主要機構(gòu)。1995年IBEX的一篇文章中披露一種純化工藝通過魚精蛋白沉淀、QAE柱層析、 HA-HPLC, Gel-HPLC等步驟純化出軟骨素AC酶，可降解軟骨素A、C，分子量77000，比活 68-lllU/mg，純化倍數(shù)1900-3700倍；通過陽離子交換層析、硫酸纖維素柱層析、HA柱層析、強陽離子交換柱層析、凝膠過濾層析等步驟純化出軟骨素B酶，可降解軟骨素B，分子量 55000，比活278U/mg，純化倍數(shù)471倍。在2000年的一篇專利中，IBEX將前一種純化工藝做修改，采用細胞破碎、陽離子交換層析、親和層析、HA柱層析、高效離子交換柱層析和凝膠過濾層析等一套步驟純化出兩種軟骨素酶，軟骨素AC酶比活提高到211. 4U/mg,軟骨素B酶比活278. 7U/mg。本發(fā)明給出一種同時制備純化出軟骨素酶B和軟骨素酶AC的方法，在氯化鈣保護之下、并含肝素和硫酸皮膚素緩沖液洗脫的多步層析分離技術(shù)，最終制備軟骨素AC酶比活提高到220. 8U/mg，軟骨素B酶比活為724. 2U/mg，均高于已有報道。方法高效、可重復(fù)，所得酶純度極高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種軟骨素酶B和軟骨素酶AC的制備方法，該方法可同時純化出2種酶，制備的軟骨素AC酶比活提高到220. 8U/mg,軟骨素B酶比活為 724. 2U/mg,。與已報道方法相比，軟骨素B酶比活增加近兩倍，軟骨素AC酶比活也高于最高報道。本發(fā)明包括下述順序的步驟(1)肝素黃桿菌的發(fā)酵將肝素黃桿菌從平板或斜面上刮取兩環(huán)菌接到50ml種子培養(yǎng)基中，23°C， 150rpm，培養(yǎng)1天。然后按5 %接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，23°C，150rpm，培養(yǎng)2-3天。菌液 10000rpm，4°C離心15-30分鐘，收集沉淀，懸浮在100ml、50mM Tris-HCl①緩沖液中，冰浴超聲1小時(150W，5s，5s)。4°C，10000rpm，離心30min，上清即為粗酶液。(2)粗酶液的硫酸銨沉淀法粗純化向粗酶液中加硫酸銨至45%飽和度，4°C沉淀1小時，lOOOOrpm，離心30min，向上清繼續(xù)加硫酸銨至65%飽和度，4°C沉淀1小時，lOOOOrpm，離心30min，取沉淀溶于含硫酸銨45%飽和度的Tris-HCl@緩沖液；得粗純化液。(3)粗純化液的OCITL柱分離將步驟⑵所得粗純化液上一根用含硫酸銨45%飽和度的Tris-HCl 緩沖液平衡過的OCTYL柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，然后以緩沖液中含硫酸銨線形梯度45% -0 飽和度，分別收集洗脫液中具有軟骨素酶B活性和軟骨素酶AC活性的洗脫液，該兩個洗脫液呈兩個活性峰I、II ；(4)軟骨素酶B的純化步驟( 活性峰I的洗脫液透析后上一根用50mM Tris-HCl@緩沖液平衡過的SP 柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度 0-0. 5M洗脫，收集洗脫液中具有軟骨素酶B活性的組分，透析后上一根用TriS-HCl@緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl 緩沖液中含氯化鈉線形梯度 0-0. 5M洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；上一根用50mM Tris-HCl@緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液中具有肝素酶活性的組分，以截留分子量IOkd的超濾離心管濃縮，得到軟骨素酶B。(5)軟骨素酶AC的純化活性峰II洗脫液透析后上一根用50mM Tris-HCl@緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫， 收集洗脫液中具有軟骨素酶AC活性的組分，透析后上一根用Tris-HCl 緩沖液平衡過的SP 柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl 緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；上一根用50mM Tris-HClc^l沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液中具有硫酸乙酰肝素酶活性的組分以截留分子量IOkd的超濾離心管濃縮， 得到軟骨素酶AC。其中，步驟⑴所述的種子培養(yǎng)基的組成為牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，酵母粉0. 5%, NaCl 為 0. 5%, pH7. 0。步驟(1)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L)為硫酸皮膚素8，K2HP042. 5，NaH2P042. 5， NH4Cl 2. 0，MgCl2 0. 5，組氨酸 0. 5，甲硫氨酸 0. 5，微量元素(NaMoO3, CuCl2, FeCl2, CoCl2, MnCl2, CaCl2, IX IO^4M) ο步驟(1)、(2)、(3)、(4)、(5)所述Tris-HCl@②緩沖液含 IOmM CaCl2, ρΗ6· 5-8. 0， 優(yōu)選ρΗ范圍為7. 0-7.5。步驟(4)所述Tri s_HCl 緩沖液含氯化鈉5_75mM、含肝素0. 01-0. 5%，氯化鈉含量的優(yōu)選范圍為25-45mM，肝素含量的優(yōu)選范圍為0. 1-0. 2%，肝素的種類優(yōu)選為高純度肝
ο步驟( 所述Tris-HCl④緩沖液含氯化鈉5_75mM、含硫酸皮膚素0. 01-0. 5%，氯化鈉含量的優(yōu)選范圍為25-45mM，硫酸皮膚素含量的優(yōu)選范圍為0.01-0. 1%，硫酸皮膚素的種類優(yōu)選為高純度硫酸皮膚素。本發(fā)明還包括以下內(nèi)容(6)軟骨素酶B活性測定在5ml石英比色皿中加入在30°C預(yù)熱過的2. 5ml硫酸皮膚素濃度為 lmg/ml 的 Tris-HCl@ (50mM，含 CaCl2 IOmM, pH7. 0)緩沖液，移取 5-20 μ 1 酶液，搖勻后在232nm測定吸光值，讀取每分鐘的變化量。根據(jù)摩爾消光系數(shù)計算單位時間產(chǎn)生的雙鍵的摩爾數(shù)，并由此計算酶液的單位活性(IU/ml)。(7)軟骨素酶AC活性測定在5ml石英比色皿中加入在30°C預(yù)熱過的2. 5ml硫酸軟骨素濃度為 lmg/ml 的 Tris-HCl@ (50mM，含 CaCl2 IOmM, pH7. 0)緩沖液，移取 5-20 μ 1 酶液，搖勻后在232nm測定吸光值，讀取每分鐘的變化量。根據(jù)摩爾消光系數(shù)計算單位時間產(chǎn)生的雙鍵的摩爾數(shù)，并由此計算酶液的單位活性(IU/ml)。(8)蛋白質(zhì)測定向5ml考馬斯亮藍溶液中加蛋白0. 1ml，搖勻，測定A595，根據(jù)標準曲線換算蛋白濃度本發(fā)明所述制備方法中，所有純化步驟都含有CaCl2,這在純化過程中有助于保持酶的穩(wěn)定。軟骨素酶B經(jīng)過純化最終得到比活高達724. 2IU/ml的酶，整個過程活性收率為 32%，提純了 568倍，從IL發(fā)酵液的菌體中得到189IU的軟骨素酶B純酶。軟骨素酶AC經(jīng)過純化最終得到比活高達220.8IU/ml的酶，整個過程活性收率為46%，提純了 204倍，從 IL發(fā)酵液的菌體中得到231IU的軟骨素酶AC純酶。與已報道方法相比，兩種酶尤其是軟骨素酶B比活都有提高，兩種酶純化工藝活性收率也遠高于已有報道的最高值。本發(fā)明所述制備方法，還具有工藝簡單、結(jié)果易重復(fù)的特點，可放大后用于工業(yè)大規(guī)模制備高純度軟骨素酶B、AC。
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。實施例1 a、將肝素黃桿菌接到50ml種子培養(yǎng)基中，23°C，150rpm，培養(yǎng)1天；b、按5%接種量接入IL發(fā)酵培養(yǎng)基，23°C，150rpm，培養(yǎng)2-3天，4°C，10000rpm，離心15-30分鐘，收集沉淀；C、沉淀懸浮在100ml、50mM的1~1^8-!1(1@緩沖溶液中，冰浴超聲1小時，4°C，
6IOOOOrpm,離心30min，將上清以硫酸銨做45% -65 %飽和度區(qū)段沉淀，沉淀溶于含硫酸銨 45%飽和度的Tris-HCl@緩沖液；d、上一根用含硫酸銨45%飽和度的Tris-HCl @緩沖液平衡過的OCITL柱，以同樣的緩沖液平衡3個柱體積，以Tris-HCl@緩沖液中含硫酸銨線形梯度45% -0飽和度洗脫， 收集洗脫液中具有軟骨素酶B活性和軟骨素酶AC活性，呈兩個活性峰(I、II)分布的若干管；e、活性峰I洗脫液透析后上一根用50mM Tris-HCl 緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫， 收集洗脫液中具有軟骨素酶B活性的組分，透析后上一根用Tris-HCl @緩沖液平衡過的SP 柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl@緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；上一根用50mM Tris-HClc^l沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液中具有肝素酶活性的組分，以截留分子量IOkd的超濾離心管濃縮，冷凍保藏。f、活性峰II洗脫液透析后上一根用50mM Tris-HCl@緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M 洗脫，收集洗脫液中具有軟骨素酶AC活性的組分，透析后上一根用Tris-HCl 緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl 緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M 洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；上一根用50mM Tris-HCl②緩沖液平衡過的 SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度 0-0. 5M洗脫，收集洗脫液中具有硫酸乙酰肝素酶活性的組分以截留分子量IOkd的超濾離心管濃縮，冷凍保藏。其中，所述步驟a中所述種子培養(yǎng)基的組成為牛肉膏0. 5%、蛋白胨1%、酵母粉 0. 5%, NaCl 為 0. 5%,pH7. 0。步驟b中所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為硫酸皮膚素8，K2HPO4 2. 5，NaH2PO4 2. 5，NH4Cl 2. 0，MgCl2 0. 5，組氨酸 0. 5，甲硫氨酸 0. 5，微量元素 NaMo03、CuCl2, FeCl2, CoCl2, MnCl2, CaCl2 各 1 X 1(Γ4Μ，單位為 g/L。所述Tri-s-HCl @緩沖液含 IOmM CaCl2、ρΗ6· 5-8. 0。所述Tri-s-HCl ②緩沖液含 IOmM CaCl2、ρΗ6· 5-8. 0。所述Tri-s-HCl 緩沖液含氯化鈉5_75mM、含肝素0. 01-0. 5%，肝素的種類為高純
度肝素。所述Tri-s-HCl 緩沖液含氯化鈉5_75mM、含硫酸皮膚素0. 01-0. 5%，硫酸皮膚素的種類為高純度肝素。
權(quán)利要求
1.一種肝素黃桿菌軟骨素酶的制備方法，所述方法包括下述步驟(1)肝素黃桿菌的發(fā)酵將肝素黃桿菌從平板或斜面上刮取兩環(huán)菌接到50ml種子培養(yǎng)基中，23°C，150rpm，培養(yǎng)1天。然后按5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，23°C，150rpm，培養(yǎng)2-3天。菌液lOOOOrpm，4°C 離心15-30分鐘，收集沉淀，懸浮在100ml、50mM Tris-HCl①緩沖液中，冰浴超聲1小時， 4°C，lOOOOrpm，離心30min，上清即為粗酶液；(2)粗酶液的硫酸銨沉淀法粗純化向粗酶液中加硫酸銨至45%飽和度，4°C沉淀1小時，lOOOOrpm，離心30min，向上清繼續(xù)加硫酸銨至65%飽和度，4°C沉淀1小時，lOOOOrpm，離心30min，取沉淀溶于含硫酸銨 45%飽和度的Tris-HCl①緩沖液；得粗純化液；(3)粗純化液的OCITL柱分離將步驟( 所得粗純化液上一根用含硫酸銨45%飽和度的Tris-HCl①緩沖液平衡過的OCTYL柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，然后以緩沖液中含硫酸銨線形梯度45% -0飽和度，分別收集洗脫液中具有軟骨素酶B活性和軟骨素酶AC活性的洗脫液，該兩個洗脫液呈兩個活性峰I、II ；(4)軟骨素酶B的純化步驟( 活性峰I的洗脫液透析后上一根用50mM Tris-HCl①緩沖液平衡過的SP柱， 以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M 洗脫，收集洗脫液中具有軟骨素酶B活性的組分，透析后上一根用Tris-HCl @緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl 緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M 洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；上一根用50mM Tris-HCl②緩沖液平衡過的 SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度 0-0. 5M洗脫，收集洗脫液中具有肝素酶活性的組分，以截留分子量IOkd的超濾離心管濃縮，得到軟骨素酶B;(5)軟骨素酶AC的純化活性峰II洗脫液透析后上一根用50mM Tris-HClt^l沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液中具有軟骨素酶AC活性的組分，透析后上一根用Tris-HCl 緩沖液平衡過的SP柱， 以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl④緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；上一根用50mM Tris-HClc^l沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液中具有硫酸乙酰肝素酶活性的組分以截留分子量IOkd的超濾離心管濃縮， 得到軟骨素酶AC。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟a中所述種子培養(yǎng)基的組成為牛肉膏 0. 5%、蛋白胨 1%、酵母粉 0. 5%, NaCl 為 0. 5%,pH7. 0。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟b中所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為硫酸皮膚素 8，K2HPO4 2. 5，NaH2PO4 2. 5，NH4Cl 2. 0，MgCl2 0. 5，組氨酸 0. 5，甲硫氨酸 0. 5，微量元素 NaMo03、CuCl2, FeCl2, CoCl2, MnCl2, CaCl2 各 1 X 1(Γ4Μ，單位為 g/L。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述Tris-HCl@緩沖液含IOmMCaCl2,pH6. 5-8. O。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述Tris-HCl@緩沖液含IOmMCaCl2, ρΗ6· 5-8. O。
6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述Tris-HClc^l沖液含氯化鈉 5-75mM、含肝素0. 01-0. 5%，肝素的種類為高純度肝素。
7.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述Tris-HCl 緩沖液含氯化鈉 5-75mM、含硫酸皮膚素0. 01-0. 5 %，硫酸皮膚素的種類為高純度肝素。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種肝素黃桿菌軟骨素酶B和軟骨素酶AC的制備方法，以肝素黃桿菌為原料，將肝素黃桿菌接到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)、再接到發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵、離心收集沉淀、沉淀超聲破碎、離心得到肝素黃桿菌軟骨素酶B和軟骨素酶AC的粗酶液，先將粗酶液通過一次硫酸銨沉淀去除部分雜質(zhì)，然后通過OCTYL-Sepharose FF層析分離為酶B和酶AC兩部分，再將酶B和酶AC分別各過三次SP-Sepharose FF純化，得到高純度的軟骨素酶B和軟骨素酶AC。
文檔編號C12R1/20GK102277345SQ201110241259
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月22日
發(fā)明者史紹鵬, 李鋰, 馬小來 申請人:深圳市海普瑞藥業(yè)股份有限公司