專利名稱：GeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)在9種腦炎相關(guān)病毒檢測(cè)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及各級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)，哨點(diǎn)醫(yī)院等用于腦炎相關(guān)疾病患者血液及腦脊液標(biāo)本的9種腦炎相關(guān)病毒(包括版納病毒，GI乙腦病毒、GIII乙腦病毒，蜱傳腦炎病毒，Tahyna病毒，遼寧病毒，科薩努爾森林熱病毒，辛德畢斯病毒，及云南環(huán)狀病毒)感染的同時(shí)檢測(cè)和分型。具體在NCBI下載9種腦炎病毒代表株的核苷酸序列，通過查閱文獻(xiàn)和多序列比對(duì)，確定病原體相對(duì)保守區(qū)，設(shè)計(jì)多重特異性引物。進(jìn)行單管多重(13重)PCR檢測(cè)9種腦炎病毒保守區(qū)，整個(gè)反應(yīng)不到2個(gè)小時(shí)。本專利克服了病毒培養(yǎng)法、直接熒光抗體法、芯片檢測(cè)方法的操作繁瑣，時(shí)間較長，成本較高等缺點(diǎn)，為腦炎病毒分型技術(shù)提供了新的思路，其高特異性、高靈敏度、快速的特點(diǎn)為腦炎相關(guān)病毒的快速準(zhǔn)確篩查和分型提供了有力的技術(shù)支撐，對(duì)研究我國腦炎癥候群的病原譜和分子流行病學(xué)調(diào) 查有重要意義。
背景技術(shù)：
病毒性腦炎(virus encephalitis)是指由各種病毒感染所引起的腦實(shí)質(zhì)炎癥。其主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、意識(shí)障礙、抽搐和腦膜刺激癥狀等。目前報(bào)道全世界約有100余種病毒可以引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。其中蟲媒病毒包括乙型腦炎病毒(JEV)、蜱傳腦炎病毒(TBEV)及科薩努爾森林熱病毒(KFDV)、西尼羅病毒(WNV)等；非蟲媒病毒包括單純皰疹病毒I型(HSVl)和2型(HSV2)、腸道病毒的柯薩奇病毒(COXV)、腸道病毒71型(EV-71)、風(fēng)疹病毒，和其它病毒如朊病毒、登革熱病毒等。目前病毒性腦炎的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依靠病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)方法。病毒分離培養(yǎng)是診斷病毒性腦炎的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于腦組織標(biāo)本難收集，腦脊液中病毒含量低，因此陽性率很低，且耗時(shí)耗力。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)病毒特異抗體是目前較常用的方法，其操作簡(jiǎn)單，敏感性和特異性高，但由于缺乏理想的診斷試劑因此只能對(duì)十余種病毒性腦炎做出實(shí)驗(yàn)室診斷。近幾年，以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的各種分子生物學(xué)診斷方法得到廣泛應(yīng)用和發(fā)展，其中包括SYBR Green I實(shí)時(shí)PCR及TaqMan PCR等，但基本都是用于單種病毒檢測(cè)(如乙型腦炎病毒)而難以對(duì)未知病原感染病例做出準(zhǔn)確診斷。本研究基于GeXP多基因遺傳表達(dá)分析系統(tǒng)及多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)建立了一種多重檢測(cè)方法，同時(shí)檢測(cè)國內(nèi)常見能引起病毒性腦炎的九種蟲媒病毒版納病毒，GI乙腦病毒、GIII乙腦病毒，蜱傳腦炎病毒，Tahyna病毒，遼寧病毒，科薩努爾森林熱病毒，辛德畢斯病毒，及云南環(huán)狀病毒。

發(fā)明內(nèi)容
I.在 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nucleotide/)下載上述 9 種腦炎相關(guān)病毒代表株的核苷酸序列，通過查閱文獻(xiàn)和多序列比對(duì)，確定病原體相對(duì)保守區(qū)，輸入GeXPeXpress Profiler軟件設(shè)計(jì)多重特異性引物(Specific-Primer, SP-Primer)。將設(shè)計(jì)的引物通過NCBI Primer-Blast, Primer Premier5. O分析評(píng)價(jià)，使各引物具有相對(duì)一致的Tm值。在全部正向引物和反向引物的5’端分別加入一段非同源性序列作為通用引物(Tag)，構(gòu)成特異性嵌合引物。上游通用引物標(biāo)簽的5’端標(biāo)記熒光染料Cy5(Cy5-Tag_F)。在整個(gè)引物體系中加入一對(duì)擴(kuò)增人類RNase P基因的引物Rnasep(F/R)，以檢驗(yàn)人源樣品質(zhì)量。引物信息見表I。2.建立了如下的檢測(cè)過程，詳見如下(I)合成引物引物均由上海Invitrogen公司合成，除Cy5-Tag_F采用HPLC純化夕卜，其余引物均PAGE純化。(2)使用QIAamp Viral RNAMini Kit提取病毒RNA，洗脫體積為30 μ 1，分裝置于-80°C保存。(3)建立同時(shí)檢測(cè)9種腦炎相關(guān)病毒的多重RT-PCR反應(yīng)體系，并對(duì)其特異性和靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證。·(4)用該13重RT-PCR檢驗(yàn)臨床標(biāo)本，對(duì)體系進(jìn)行驗(yàn)證評(píng)估。表IGeXP 13重RT-PCR檢測(cè)9種腦炎相關(guān)病毒引物信息表
權(quán)利要求
1.一種單管13重PCR同時(shí)檢測(cè)9種腦炎相關(guān)病毒，包括用于檢測(cè)腦炎相關(guān)病毒版納病毒，G I乙腦病毒、GIII乙腦病毒,蝶傳腦炎病毒，Tahyna,遼寧病毒,科薩努爾森林熱病毒，辛德畢斯病毒及云南環(huán)狀病毒的型特異性引物。
2.權(quán)力要求I所述的13重PCR技術(shù)的引物和通用引物包括核酸序列表所列的基因序列及其每種序列的互補(bǔ)序列或變體。
3.權(quán)力要求I所述的13重PCR檢測(cè)技術(shù)包括腦炎相關(guān)病毒版納病毒，GI乙腦病毒、GIII乙腦病毒，蜱傳腦炎病毒，Tahyna，遼寧病毒，科薩努爾森林熱病毒，辛德畢斯病毒及云南環(huán)狀病毒。
4.權(quán)力要求I所述的本發(fā)明的應(yīng)用范圍包括各級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)，哨點(diǎn)醫(yī)院用于腦 炎相關(guān)病毒版納病毒，G I乙腦病毒、GIII乙腦病毒,蝶傳腦炎病毒，Tahyna,遼寧病毒,科薩努爾森林熱病毒，辛德畢斯病毒及云南環(huán)狀病毒同時(shí)檢測(cè)。
5.權(quán)力要求I所述的同時(shí)檢測(cè)腦炎相關(guān)病毒版納病毒，GI乙腦病毒、GIII乙腦病毒，蜱傳腦炎病毒，Tahyna,遼寧病毒，科薩努爾森林熱病毒，辛德畢斯病毒及云南環(huán)狀病毒的多重PCR技術(shù)的反應(yīng)程序和檢測(cè)程序。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及各級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)、哨點(diǎn)醫(yī)院等用于病毒性腦炎病患標(biāo)本的9種腦炎病毒(包括版納病毒，G I乙腦病毒、GIII乙腦病毒，蜱傳腦炎病毒，Tahyna，遼寧病毒，科薩努爾森林熱病毒，辛德畢斯病毒及云南環(huán)狀病毒)感染的同時(shí)檢測(cè)和分型。具體在NCBI下載9種腦炎相關(guān)病毒代表株的核苷酸序列，通過查閱文獻(xiàn)和多序列比對(duì)，確定病原體相對(duì)保守區(qū)，設(shè)計(jì)多重特異性引物。進(jìn)行單管多重(13重)PCR檢測(cè)9種腦炎病毒保守區(qū)，整個(gè)反應(yīng)不到2個(gè)小時(shí)。本專利既克服了常規(guī)單管多重?zé)晒舛ㄐ訮CR檢測(cè)不能分型的缺點(diǎn)，也克服了常規(guī)芯片檢測(cè)方法的操作繁瑣，時(shí)間較長，成本較高等缺點(diǎn)，為腦炎病毒分型技術(shù)提供了新的思路，其高特異性、高靈敏度、快速的特點(diǎn)為腦炎病毒的快速準(zhǔn)確篩查和分型提供了有力的技術(shù)支撐，對(duì)研究我國腦炎癥候群患者感染病原譜和分子流行病學(xué)調(diào)查有重要意義。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102952893SQ20111024205
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2011年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月23日
發(fā)明者馬學(xué)軍, 何玢, 梁國棟, 王環(huán)宇, 秦萌 申請(qǐng)人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所