專利名稱：一種t載體及其構(gòu)建方法與其前t載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基因工程操作中的DNA片段克隆方法。具體地，本發(fā)明涉及一種T載體及其構(gòu)建方法與其前T載體。
背景技術(shù)：
DNA的重組技術(shù)，也就是基因克隆技術(shù)，是現(xiàn)代分子生物學(xué)發(fā)展中最重要的成就之一，也是基因工程的核心技術(shù)。廣義來說，DNA的重組技術(shù)是指利用供體生物的遺傳物質(zhì)， 或人工合成的DNA分子，經(jīng)過體外的分離純化、PCR擴(kuò)增、限制酶切割等處理后與適當(dāng)?shù)妮d體連接起來形成新的重組DNA分子，然后將重組DNA分子導(dǎo)入受體生物中，從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo) DNA分子的保存、擴(kuò)增和分析等操作?？梢宰鳛镈NA載體的有質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、人工染色體等，其中質(zhì)粒載體是應(yīng)用最為廣泛的分子克隆載體。一個(gè)完整的基因工程質(zhì)粒載體包括復(fù)制子(用于控制質(zhì)粒分子在宿主體內(nèi)的復(fù)制與擴(kuò)增)、篩選基因(如抗性基因、報(bào)告基因，或兩者都有，用于確認(rèn)、跟蹤或分離帶目標(biāo)質(zhì)粒的宿主)、多克隆位點(diǎn)(便于DNA分子的切割與連接)以及用于控制質(zhì)粒行為(如拷貝數(shù))或用于分析的一些特別的DNA序列(如用于質(zhì)粒測序的一些引物互補(bǔ)序列等)。DNA分子的切割與連接可以通過限制性內(nèi)切酶和連接酶來完成，即分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割目標(biāo)DNA分子和載體DNA分子，使其兩端分別獲得含有部分單鏈突出的末端(粘性末端)，含有互補(bǔ)序列的末端(由同一個(gè)酶或同尾酶切割獲得)在DNA連接酶的作用下形成一條完整的DNA鏈。PCR技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展使得利用PCR技術(shù)獲得待克隆的DNA分子成為一種方便而高效的手段，但對于利用PCR方法獲得的片段而言，采用限制酶切割的方法獲得與載體匹配的末端有諸多不便首先，需要在PCR產(chǎn)物兩端引入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，增加了引物的成本；其次，當(dāng)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)位于DNA片段的末端時(shí)，其切割效率受影響；再次，用限制性內(nèi)切酶處理后，正確切割或未切割的DNA分子難以分離，這將影響后續(xù)DNA片段與載體的連接效率。因此，一種針對PCR片段的克隆技術(shù)——TA克隆——得到發(fā)展并被廣泛使用。TA克隆技術(shù)是指把PCR片段與一個(gè)具有單個(gè)3’ -dT突出的載體DNA分子連接起來的方法。其原理在于，在PCR反應(yīng)中所使用的如Taq等DNA聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移的活性， 該活性使得其能在PCR擴(kuò)增得到的DNA分子末端的3’端添加一個(gè)突出的dA,從而可以與具有3’-dT突出的載體DNA分子互補(bǔ)連接。與限制性內(nèi)切酶切割后連接的方法相比，TA克隆使得通過PCR獲得的DNA片段可以直接克隆到載體中，大大簡化了克隆過程，提高了效率。 經(jīng)過特別設(shè)計(jì)和加工制備的兩端具有3’ -dT突出的線性DNA載體則稱為T載體。T載體是TA克隆技術(shù)的核心，目前常用的T載體制備方法有兩種一種是平末端添T法，即在環(huán)狀的質(zhì)粒載體(T載體前體)預(yù)設(shè)位置處用合適的限制性內(nèi)切酶(如EcoR V, Sma I等)切割，形成兩端為平末端的線性DNA分子，隨后用帶有末端轉(zhuǎn)移酶活性的酶在合適的條件下在線性DNA分子的兩端添加一個(gè)3’-dT，經(jīng)過進(jìn)一步純化，獲得制備好的T載
3體；另一種制備T載體的方法是酶切法，該方法利用某些限制性內(nèi)切酶(如km I， Eaml 105 I等)切割后在3’留下單個(gè)核苷酸的特性，經(jīng)過精心設(shè)計(jì)，使得該位置的核苷酸為T，因此，在載體上設(shè)計(jì)兩個(gè)串聯(lián)的該酶的識(shí)別位點(diǎn)，則切割后在載體的兩端分別獲得一個(gè)突出的3’ -dT，回收該線性DNA分子即為T載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種T載體及其構(gòu)建方法與其前T載體。本發(fā)明首先公開了一種T載體，為兩個(gè)末端均帶有3’_dT突出的線性載體，所述兩個(gè)3’ -dT突出末端的旁側(cè)序列滿足當(dāng)經(jīng)所述T載體與兩端帶3’ -dA的PCR產(chǎn)物相連后，在插入片段兩端能形成兩個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)；所述兩個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)為同一種限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。所述限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)可以是，但不局限于Hind III酶切位點(diǎn)。所述T載體中還應(yīng)當(dāng)帶有其他T載體常用的必須元件。所述T載體常用的必須元件包括復(fù)制子、抗性基因(如氨芐青霉素基因表達(dá)盒) 和篩選標(biāo)記(如lacZ’標(biāo)記基因等)。T載體中還可選擇性地包括下列元件用于控制質(zhì)粒行為(如拷貝數(shù))或用于分析的一些特別的DNA序列等。較佳的，所述T載體與兩端帶3’_dA的PCR產(chǎn)物相連后，除PCR產(chǎn)物自帶的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)外，僅含有兩個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。T載體中沒有其他常用的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，可以用通用引物進(jìn)行DNA序列測定。本發(fā)明的T載體可采用以下任一方法制備獲得方法一用產(chǎn)生平末端的酶酶切前T載體后，產(chǎn)生帶有平末端的線性分子，隨后在所述線性分子的末端添T后獲得。產(chǎn)生平末端的酶可以是，但不局限于EcoR V。線性分子末端添T的酶可以是，但不局限于Taq DNA polymerase0具體的，線性分子末端添T的方法可以為在dTTP存在的情況下，利用Taq DNApolymerase的作用下添加一個(gè)dT突出到DNA的3’末端。方法二 用產(chǎn)生3’ -dT突出末端的酶酶切前T載體后獲得。所述產(chǎn)生3’ -dT突出的酶可以是，但不局限于km I。本發(fā)明還進(jìn)一步公開了一種前T載體，可用于制備所述T載體。本發(fā)明的前T載體為環(huán)狀的質(zhì)粒載體，包括多克隆位點(diǎn)，其中所述多克隆位點(diǎn)包含一段共有下列五個(gè)酶切位點(diǎn)的DNA片段，兩個(gè)產(chǎn)生3’ -dT突出末端的酶切位點(diǎn)，兩個(gè)鑒定用酶切位點(diǎn)和一個(gè)產(chǎn)生平末端的酶切位點(diǎn)；所述產(chǎn)生平末端的酶切位點(diǎn)位于兩個(gè)產(chǎn)生 3’ -dT突出末端的酶切位點(diǎn)之間；所述產(chǎn)生3’ -dT突出末端的酶切位點(diǎn)經(jīng)產(chǎn)生3’ -dT突出末端的酶酶切后在載體上能產(chǎn)生兩個(gè)3’-dT突出末端；所述兩個(gè)3’-dT突出末端的旁側(cè)序列滿足當(dāng)經(jīng)產(chǎn)生3’ -dT突出末端的酶酶切后的所述載體與帶3’ -dA的PCR產(chǎn)物相連后，在插入片段兩端能形成兩個(gè)鑒定用酶切位點(diǎn)；所述兩個(gè)鑒定用酶切位點(diǎn)為同一種酶的酶切位點(diǎn)ο所述產(chǎn)生3’ -dT突出末端的酶切位點(diǎn)可以是，但不局限于km I酶切位點(diǎn)。
所述鑒定用酶切位點(diǎn)可以是，但不局限于Hind III酶切位點(diǎn)。所述產(chǎn)生平末端的酶切位點(diǎn)可以是，但不局限于EcoR V酶切位點(diǎn)。優(yōu)選的，所述產(chǎn)生3’_dT突出末端的酶切位點(diǎn)為km I酶切位點(diǎn)，所述鑒定用酶切位點(diǎn)為Hind III酶切位點(diǎn)，所述產(chǎn)生平末端的酶切位點(diǎn)為EcoR V。所述前T載體的多克隆位點(diǎn)中，除此上述五個(gè)酶切位點(diǎn)外，不含其它常見的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。進(jìn)一步的，所述DNA片段的序列為SEQ IN NO :1。所述前T載體應(yīng)當(dāng)與其他常用質(zhì)粒載體一樣，包括一些必須的元件，如復(fù)制子、抗性基因(如氨芐青霉素基因表達(dá)盒)和篩選標(biāo)記。還可選擇性地包括用于控制質(zhì)粒行為 (如拷貝數(shù))或用于分析的一些特別的DNA序列等。進(jìn)一步的，所述前T載體可由為將現(xiàn)有的質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)采用前述DNA片段替換獲得?，F(xiàn)有的質(zhì)粒載體可選自pUC19、pUC18、pUC119、pUC118、pUC57、pBlueSciptll SK(+/-)>pBlueScript II KS(+/-)、pGEX_2T、pGEX_4T、pGEX_6p、pGEM-Z、pTZ19u、pTZ19r、 pTZ18u、pTZ18r、pBR322及其衍生載體、pACYC及其衍生載體、pSClOl及其衍生載體等。進(jìn)一步的，所述前T載體為將pUC19經(jīng)Hind III和EcoR I酶切后連入下列序列的片段獲得5 ‘ -AGCTCGCACGCCAAGCTTCGCTTGGGATATCCAAGCGAAGCTTGGATCGTACCGTCA-3‘I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I3 ‘ -GCGTGCGGTTCGAAGCGAACCCTATAGGTTCTCTTCGAACCTAGCATGGCAGTTTAA-5‘上述片段可按照設(shè)計(jì)好的序列，人工合成兩條互補(bǔ)的DNA單鏈分子，經(jīng)過退火后獲得。本發(fā)明的前T載體經(jīng)過處理后，可以獲得兩端帶有3’ -dT突出的線性載體(即T 載體)，該載體可以直接與帶有3’-dA突出的PCR產(chǎn)物進(jìn)行高效連接，而且連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，可以用藍(lán)白斑和單酶切的方法鑒定轉(zhuǎn)化子，極大地簡化了檢測流程。采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的TA克隆載體(T載體)具有如下優(yōu)點(diǎn)1、與目前商業(yè)上通常使用的T載體相比，去除了載體上多余的酶切位點(diǎn)，避免載體上存在的位點(diǎn)和插入片段中設(shè)計(jì)的位點(diǎn)發(fā)生干擾；2、在兩個(gè)km I位點(diǎn)之間插入一段較短的DNA序列，增大兩個(gè)km I位點(diǎn)之間的距離，避免生產(chǎn)過程中由于兩個(gè)km I位點(diǎn)過近帶來的酶切不完全等問題，同時(shí)，該km I 雙酶切后掉下的片段為20bp，可以使用PCR產(chǎn)物純化的方法清除，簡化了生產(chǎn)步驟，而且避免膠回收過程對DNA的損傷；3、在兩個(gè)km I位點(diǎn)之間引入一個(gè)EcoR V酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)的引入，使得該載體對于兩種生產(chǎn)方法均適用(Xcm I酶切法和EcoR V酶切后平末端添T法)；4、在T突出兩端設(shè)計(jì)兩個(gè)Hind III位點(diǎn)，可以用單一的酶Hind III進(jìn)行插入子鑒定，該位點(diǎn)的設(shè)計(jì)使得載體具有如下特點(diǎn)A、對于有插入片段的載體，Hind III酶切后將切下和插入片段大小一致的片段；B、對于掉T自連的載體，Hind III不能切割；C、對于酶切不完全自連的載體，Hind III酶切后掉下25bp片段，大小可以在瓊脂糖凝膠上分開；
5、經(jīng)過序列優(yōu)化，使得無論是由于km I酶切不完全或者因?yàn)閮啥说鬞的情況，載體自連所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子均為藍(lán)斑，從而降低假陽性率；6、插入位點(diǎn)兩側(cè)的距離經(jīng)過優(yōu)化，如使用M13通用引物進(jìn)行測序，在獲得良好的序列讀取的同時(shí)，盡量減少載體序列殘留。


圖1是載體核心序列及其酶切位點(diǎn)位置示例圖2是DNA單鏈互補(bǔ)退火形成的雙鏈分子示意圖
具體實(shí)施例方式本發(fā)明首先設(shè)計(jì)了一段DNA序列，使之具有如下特點(diǎn)1、該DNA片段可以被克隆至目標(biāo)載體的多克隆位點(diǎn)中，比如pUC19 ；2、該片段不打斷原來載體上編碼IacZa蛋白的編碼區(qū)，從而不破壞藍(lán)白斑篩選的功能；3、該片段中含有兩個(gè)km I酶切位點(diǎn)，兩個(gè)Hind III酶切位點(diǎn)以及一個(gè)EcoRV酶切位點(diǎn)，除此之外不含其它常見的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)；4、兩個(gè)km I酶切割后，留下的末端為3’ _dT突出；5、酶切位點(diǎn)之間的距離以及序列結(jié)果特別優(yōu)化使之能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述的功能。進(jìn)一步，本發(fā)明按照上述思路合成了 DNA片段并將其克隆至pUC19載體中，經(jīng)過 DNA序列測定，確認(rèn)實(shí)際載體序列與預(yù)期設(shè)計(jì)序列一致；然后，對該載體進(jìn)行處理，獲得兩端帶有3’_dT突出的線性載體。此處有兩種方法可以完成該步驟，第一種方法是平末端添T法，首先用EcoR V酶對載體進(jìn)行切割，獲得兩端帶有平末端的線性DNA分子，接下來采用DNA聚合酶在dTTP存在的條件下將dT添加到DNA 末端；第二種方法是，用km I酶對載體進(jìn)行切割，兩個(gè)km I位點(diǎn)處分別留下兩個(gè)3’-dT 突出。具體地，本發(fā)明包括如下步驟(1)按照如前所述的思路設(shè)計(jì)DNA序列；(2)采用化學(xué)合成的方法獲得兩條單鏈DNA分子并通過退火的方法獲得如前所述 DNA雙鏈，該雙鏈具有與載體通過酶切位點(diǎn)切割后留下的末端相匹配的末端；(3)對載體用相應(yīng)的內(nèi)切酶進(jìn)行切割；(4)將步驟⑵中得到的DNA片段與步驟(3)中得到的酶切后的線性化載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選擇陽性轉(zhuǎn)化子并經(jīng)過DNA測序確認(rèn)序列；(5)將步驟(4)中得到的載體，采用平末端添T法或km I酶切法制備帶有3’_dT 突出的線性DNA分子；(6)用不同長度和來源的PCR產(chǎn)物驗(yàn)證步驟(5)中所獲得的載體的連接效率。所述化學(xué)合成是指，采用有機(jī)合成的方法，將核苷酸單體按照所要求的序列依次連接，形成具有特定堿基排列順序的DNA分子的過程；所述限制性內(nèi)切酶是指，生物體內(nèi)的一類可以識(shí)別并且切割特定雙鏈DNA序列的內(nèi)切核酸酶，帶有該限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的DNA分子經(jīng)過處理后，留下固定的，特異的DNA末端序列；所述具有3’-dT突出的線性DNA分子是指，一種線性化的載體，在該載體的兩個(gè)末端的3’端具有一個(gè)并且只有一個(gè)突出的T堿基，可以用于TA克隆，也被稱為T載體；下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，旨在進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明所要保護(hù)的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook 等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1載體核心序列設(shè)計(jì)示例及其構(gòu)建1.1核心序列的設(shè)計(jì)根據(jù)本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路，該載體的核心序列如SEQ ID NO. 1所示，具體的酶切位點(diǎn)以及其位置如圖1所示。該核心序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。1. 2骨架載體的選擇與制備為了簡便起見，在本實(shí)施例中，采用pUC19載體作為骨架載體。將帶有PUC19質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 α菌株接種于含有50ng/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37°C搖床中振蕩培養(yǎng)過夜。利用生工生物工程(上海)有限公司所生產(chǎn)的“Sanft·印柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒”按照其操作說明提取PUC19質(zhì)粒DNA。用限制性內(nèi)切酶Hind III和EcoR I對pUC19質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切，Hind III和 EcoR I均購自富酶泰斯生物技術(shù)(深圳)有限公司，反應(yīng)體系如下
Buffer R (10 χ)5 yL
Η η III (10 U/μ L)IyL
EcoR I (10 U/μ L)1 yL
pUC19 Plasmid (50 ng/μ L) 10 μ L ddH20_33 μ L
Total volume50 μ L反應(yīng)條件為37°C，3小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，分離得到大小為2. 6kb的片段，利用膠回收的方法，用生工生物工程(上海)有限公司生產(chǎn)的“Sarfrep柱式DNA膠回收試劑盒” 按照其提供的步驟回收該條帶。1. 3插入DNA片段的制備根據(jù)所設(shè)計(jì)的DNA序列，設(shè)計(jì)兩條寡核苷酸DNA分子如下 pSGTSIF 5’-AGCTCGCACGCCAAGCTTCGCTTGGGATATCCAAGCGAAGCTTGGATCGTACCGTCA-3，(SEQ ID NO 3)pSGTSIR 5’-AATTTGACGGTACGATCCAAGCTTCGCTTGGATATCCCAAGCGAAGCTTGGCGTGCG-3，(SEQ ID NO 4)這兩條DNA分子由生工生物工程(上海)有限公司采用固相亞磷酰胺三酯法合
7成，用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法進(jìn)行純化，并且用質(zhì)譜檢測分子量與純度。將兩條DNA分子按照合成的量和其分子量計(jì)算，用TE buffer (IOmM Tris, ImM EDTA，pH 8.0)將其稀釋至濃度為100 μ mol/L，等比例混合后，按照如下程序進(jìn)行退火處理反應(yīng)程序94°Cfor 2min，94°C down to 25°C at 0. 2°C per sec, 25°C for 8min。反應(yīng)完畢后，獲得互補(bǔ)的DNA雙鏈，該DNA雙鏈具有如圖二中所示的結(jié)構(gòu)，兩端的突出分別于Hind III以及EcoR I酶切后的序列互補(bǔ)。1. 4DNA分子連接與轉(zhuǎn)化將上述1.3中得到的DNA片段與1.2中得到的載體片度以摩爾比5 1的比例混合，在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素抗性LB平板培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，獲得陽性轉(zhuǎn)化子。挑取陽性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)，提取DNA，在生工生物工程(上海)有限公司用Sanger 法在3730型DNA序列分析儀上鑒定轉(zhuǎn)化子的序列，挑取與預(yù)期序列完全一致的轉(zhuǎn)化子用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，該正確的載體亦稱為前T載體。實(shí)施例2 T載體制備方法一(平末端添T法)2. 1前T載體的準(zhǔn)備將帶有前T載體的大腸桿菌DH5 α菌株接種至含有50mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37°C搖床振蕩過夜。采用凱杰生物技術(shù)(上海)有限公司提供的“Qiagen Plasmid Maxi Kit”試劑盒按照廠商說明書提取質(zhì)粒。2. 2載體線性化用EcoR V限制性內(nèi)切酶對載體進(jìn)行酶切，形成兩端為平末端的線性化載體，反應(yīng)體系如下
Buffer R (10 χ)20 μ L
EcoR V (10 U/μ L)5 μ LPre-T Vector (50 ng/μ L)50 μ L
ddH20_125 μ L
Total volume200 μ L酶切反應(yīng)條件為37°C，3小時(shí)。酶切反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切完全，然后用生工生物工程(上海)有限公司生產(chǎn)的“Sarfrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒”對酶切反應(yīng)體系進(jìn)行純化，獲得約為2. 61Λ的線性化DNA片段。2. 3 末端添 T首先配制10倍添T緩沖液(10x T-Tailing Buffer)，成分如下KCl150 mM
(NH4)2S04 150 mM MgCl220 mM
Trifon X-100 1% Tris-Cl100 mM
pH8.6按照以下反應(yīng)體系進(jìn)行添T反應(yīng)
IOx T-Tailing Buffer20 μ L
dTTP (10 mM)5 μ L
lined DNA (50 ng/μ L)50 μ L
Taq DNA polymerase (5 U/μ L) 5 μ L ddH20_120 μ L
Total volume200 μ L反應(yīng)條件為72°C，2小時(shí)反應(yīng)結(jié)束后，用生工生物工程(上海)有限公司生產(chǎn)的“Sarfr印柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒”進(jìn)行純化，獲得純的DNA片段，該DNA片段末端帶有3，-dT突出。實(shí)施例3T載體制備方法二(Xcm I酶切法)3.1前T載體的準(zhǔn)備將帶有前T載體的大腸桿菌DH5 α菌株接種至含有50mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37°C搖床振蕩過夜。采用凱杰生物技術(shù)(上海)有限公司提供的“Qiagen Plasmid Maxi Kit”試劑盒按照廠商說明書提取質(zhì)粒。3. 2XcmI 酶切對3. 1中獲得的前T載體進(jìn)行酶切，如前所述，該前T載體中含有兩個(gè)km I酶切位點(diǎn)，每個(gè)酶切位點(diǎn)將在最終線性化后的載體末端留下一個(gè)帶3’-dT的突出。km I購自 NEB (北京)有限公司，反應(yīng)條件如下
NEB Buffer 2 (IOx)20 μ L
Pre-T plasmid DNA (50 ng/μ L) 50 μ LXcm I (5 U/μ L)5 μ L
ddH20_125 μ L
Total volume200 μ L反應(yīng)條件為37°C，3小時(shí)。酶切反應(yīng)結(jié)束后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否完全。3. 3T載體的回收與純化用生工生物工程(上海)有限公司生產(chǎn)的“Sarfr印柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒”進(jìn) 9行純化，獲得純的DNA片段，該DNA片段末端帶有3，-dT突出。實(shí)施例4新型T載體的應(yīng)用4. 1新型T載體連接效果測定設(shè)計(jì)3對引物，以Lambda DNA為模板，分別擴(kuò)增長度為11Λ，2kb和51Λ的DNA片段，在PCR反應(yīng)中使用Taq DNA聚合酶得到DNA分子末端的3’端添加一個(gè)突出的dA的擴(kuò)增產(chǎn)物。所述引物序列如下
引物名稱引物序列(5’ -3’ )產(chǎn)物大小LlOOOFtaaattcgcacagcagcaac(SEQ ID N0:5)1000 bpLlOOORacgttttcaggttggcattc(SEQ ID NO:6)L2000Fcgcaaacttgtcacgctaaa(SEQ ID NO:7)2000 bpL2000Rtcggttgtatttccctccag(SEQ ID NO :8)L5000Fcatcggggtaaaaccgtcta(SEQ ID NO:9)5000 bpL5000Raacagtgcaccatgcaacat(SEQ ID NO:10) 反應(yīng)體系如下
PCR Buffer (10 χ)5 μ L
MgCl2 (25 mM)3 μ L
L1000F/L2000F/L5000F (10 μ Μ)IyL
L1000R/L2000R/L5000R (10 μ Μ)IyL
Taq DNA Polymerase (5 U/μ L)2 yL
Lambda DNA (50 ng/ μ L)IyL
ddH20_37μ L
Total volume50 μ L反應(yīng)程序94°Cfor 2min, (94°C for 30sec，58°C for 30sec,72°C for 3min)x 33 cycles,72°C for 8min。反應(yīng)結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳顯示在目標(biāo)位置有明顯的條帶，用生工生物工程 (上海)有限公司生產(chǎn)的“Sarfrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒”純化該片段，分別與實(shí)施例 2和3所制備的T載體以摩爾比3 1的比例，在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后用含有50mg/L氨芐青霄素，0. ImM IPTG (Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside,異丙基一β-D-iit 代半乳糖苷)禾口 40mg/L X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoIyI-D-Galactopyranoside, 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖)的LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選，轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)經(jīng)活
10化后涂布與上述平板上，于37°C倒置培養(yǎng)過夜。對平板進(jìn)行藍(lán)白斑計(jì)數(shù)確定藍(lán)白斑比例，并用M13+/M13-引物(M13+ 5 ‘-GTAAAACGACGGCCAGT-3，(SEQ ID NO :11)，M13-:5，-CAGGAAACAGCTATGACC-3，(SEQID NO 12))對白斑進(jìn)行PCR檢測，測定白斑中含有正確插入片段的轉(zhuǎn)化子的比例。結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.一種τ載體，為兩個(gè)末端均帶有3’ -dT突出的線性載體，所述兩個(gè)3’ -dT突出末端的旁側(cè)序列滿足當(dāng)所述τ載體與兩端帶3’ -dA的PCR產(chǎn)物相連后，在插入片段兩端能形成兩個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)；所述兩個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)為同一種限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。
2.如權(quán)利要求1所述T載體，其特征在于，所述限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)為HindIII酶切位點(diǎn)。
3.如權(quán)利要求1所述T載體，其特征在于，所述T載體與兩端帶3’-dA的PCR產(chǎn)物相連后，除PCR產(chǎn)物自帶的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)外，僅含有兩個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。
4.如權(quán)利要求1所述T載體的制備方法，為用產(chǎn)生平末端的酶酶切前T載體后，產(chǎn)生帶有平末端的線性分子，隨后在所述線性分子的末端添T后獲得。
5.如權(quán)利要求4所述T載體的制備方法，其特征在于，所述產(chǎn)生平末端的酶為EcoRV。
6.如權(quán)利要求4所述T載體的制備方法，其特征在于，所述線性分子末端添T時(shí)所用的 81 Taq DNA polymerase
7.如權(quán)利要求1所述T載體的制備方法，為用產(chǎn)生3’-dT突出末端的酶酶切前T載體后獲得。
8.如權(quán)利要求7所述T載體的制備方法，其特征在于，所述產(chǎn)生3’-dT突出的酶為XcmI。
9.一種前T載體，為環(huán)狀的質(zhì)粒載體，包括多克隆位點(diǎn)，其中所述多克隆位點(diǎn)包含一段共有下列五個(gè)酶切位點(diǎn)的DNA片段，兩個(gè)產(chǎn)生3’ -dT突出末端的酶切位點(diǎn)，兩個(gè)鑒定用酶切位點(diǎn)和一個(gè)產(chǎn)生平末端的酶切位點(diǎn)；所述產(chǎn)生平末端的酶切位點(diǎn)位于兩個(gè)產(chǎn)生3’ -dT 突出末端的酶切位點(diǎn)之間；所述產(chǎn)生3’-dT突出末端的酶切位點(diǎn)經(jīng)產(chǎn)生3’-dT突出末端的酶酶切后在載體上能產(chǎn)生兩個(gè)3’-dT突出末端；所述兩個(gè)3’-dT突出末端的旁側(cè)序列滿足當(dāng)經(jīng)產(chǎn)生3’ -dT突出末端的酶酶切后的所述載體與帶3’ -dA的PCR產(chǎn)物相連后，在插入片段兩端能形成所述的兩個(gè)鑒定用酶切位點(diǎn)；所述兩個(gè)鑒定用酶切位點(diǎn)為同一種酶的酶切位點(diǎn)ο
10.如權(quán)利要求9所述前T載體，其特征在于，所述產(chǎn)生3’-dT突出末端的酶切位點(diǎn)為 Xcm I酶切位點(diǎn)，所述鑒定用酶切位點(diǎn)為Hing III酶切位點(diǎn)，所述產(chǎn)生平末端的酶切位點(diǎn)為 EcoR V。
11.如權(quán)利要求9所述前T載體，其特征在于，所述前T載體由現(xiàn)有的質(zhì)粒載體中的多克隆位點(diǎn)采用所述DNA片段替換后獲得。
12.如權(quán)利要求9或11所述前T載體，其特征在于，所述DNA片段的序列為SEQINNO.1。
13.如權(quán)利要求9所述前T載體，其特征在于，所述前T載體為將pUC19經(jīng)HingIII和 EcoR I酶切后連入下列序列的片段獲得.5 ‘ -AGCTCGCACGCCAAGCTTCGCTTGGGATATCCAAGCGAAGCTTGGATCGTACCGTCA-3‘IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII.3 ‘ -GCGTGCGGTTCGAAGCGAACCCTATAGGTTCTCTTCGAACCTAGCATGGCAGTTTAA-5‘。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種T載體及其構(gòu)建方法與其前T載體。本發(fā)明的T載體為兩個(gè)末端均帶有3’-dT突出的線性載體，兩個(gè)3’-dT突出末端的旁側(cè)序列滿足當(dāng)所述T載體與兩端帶3’-dA的PCR產(chǎn)物相連后，在插入片段兩端能形成兩個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)；所述兩個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)為同一種酶的酶切位點(diǎn)。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了可產(chǎn)生所述T載體的前T載體。本發(fā)明構(gòu)建的T載體可用于TA克隆，具有很高的克隆效率，且可以用單酶切的方法對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定。
文檔編號C12N15/66GK102311968SQ201110242359
公開日2012年1月11日 申請日期2011年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月22日
發(fā)明者李威 申請人:生工生物工程(上海)有限公司