專利名稱：一種發(fā)酵生產(chǎn)尼莫克汀的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵生產(chǎn)抗生素技術領域，特別涉及尼莫克汀的發(fā)酵生產(chǎn)。更具體的，涉及通過向發(fā)酵液中連續(xù)補加或間歇補加高濃度單糖、二糖或多糖溶液來培養(yǎng)藍灰鏈霉菌，以達到生產(chǎn)高濃度尼莫克汀的方法。
背景技術：
尼莫克汀(Nemadectin)是一種十六元大環(huán)內酯類抗生素，由藍灰鏈霉菌(Streptomycescyaneogriseus sp. Noncyanogenus)經(jīng)發(fā)酵過程生產(chǎn)。作為米爾貝霉素族的一員，尼莫克汀主要用于合成活性更強的農(nóng)藥獸藥莫西克汀(Moxidectin)。莫西克汀20世紀80年代中期以來開始作為獸用驅蟲藥使用，能夠高效的殺滅線蟲和體表寄生蟲，同時對動物有很好的安全性，是目前被廣泛用于獸醫(yī)臨床的廣譜、高效、新型大環(huán)內酯類驅蟲抗 生素。尼莫克汀結構式
H3CX11^CH3
H3C0P ￥ γΛ/ 3
hAi ^
Η OH尼莫克汀的制備主要通過藍灰鏈霉菌菌株生物發(fā)酵制得。目前的發(fā)酵生產(chǎn)工藝初始糖濃度較高，菌種進入次級代謝過程較慢，發(fā)酵產(chǎn)物合成過程易受到阻遏，且發(fā)酵中后期菌絲裂解過快，發(fā)酵結束時的產(chǎn)量還有待提高(朱皖宜，羅紅瑜，張賽萍，等.尼莫克丁產(chǎn)生菌的誘變育種[J].生物學雜志，2008，25 (2) :62)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于，針對現(xiàn)有尼莫克汀發(fā)酵工藝存在的不足，基于微生物生長動力學基礎，提供一種能夠提高尼莫克汀收率的液體發(fā)酵過程的補糖方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人提供了如下發(fā)酵生產(chǎn)尼莫克汀的方法，即在發(fā)酵生產(chǎn)尼莫克汀的過程中補加糖類物質，包括單糖、二糖或多糖。發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，當在發(fā)酵生產(chǎn)尼莫克汀的過程中補加糖類物質，包括單糖、二糖或多糖后，其發(fā)酵水平具有顯著的提高。為此，發(fā)明人作了進一步研究并得出了更為改進的生產(chǎn)方法。其技術方案如下
一種發(fā)酵生產(chǎn)尼莫克汀的方法，在發(fā)酵生產(chǎn)尼莫克汀的過程中，當發(fā)酵液中的總糖濃度低于30g/L時，通過向發(fā)酵液間歇或連續(xù)補加糖類物質，使發(fā)酵液中的總糖濃度維持在10-40g/L進行發(fā)酵。所述糖類物質可以是單糖、二糖或多糖，或者是它們的混合物。所述單糖如葡萄糖、果糖；所述二糖為代謝能夠產(chǎn)生葡萄糖的二糖，如乳糖、蔗糖、麥芽糖等；所述多糖為分解能產(chǎn)生單糖的可溶性淀粉、糊精、麥芽糊精等(注麥芽糊精為以淀粉為原料，經(jīng)控制水解DE值在20%以下的產(chǎn)品；糊精為淀粉在受到加熱、酸或淀粉酶作用下將大分子轉化成為小分子的中間物質，行業(yè)內通常將兩者區(qū)分開來作為不同的原材料)。優(yōu)選地，上述發(fā)酵生產(chǎn)尼莫克汀的方法中，補糖的形式可以是將糖類物質配制為300-600g/L單糖、二糖和/或多糖的單一或混合溶液，然后間歇補加或連續(xù)補加到發(fā)酵液中。優(yōu)選地，上述發(fā)酵生產(chǎn)尼莫克汀的方法中，將發(fā)酵液的初始溶氧設定為100%，則在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液溶氧會先下降然后回升，當發(fā)酵液溶氧回升至70%以上且總糖濃度低于30g/L時開始進行補糖。優(yōu)選地，上述發(fā)酵生產(chǎn)尼莫克汀的方法中，發(fā)酵使用的菌株為藍灰鏈霉菌(Streptomycescyaneogriseus sp. Noncyanogenus)。本發(fā)明優(yōu)選的發(fā)酵實施過程是，在發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)藍灰鏈霉菌，控制發(fā)酵罐的溫度為27-29°C，壓力為O. 04-0. 06Mpa ;根據(jù)發(fā)酵液的溶氧狀況控制通氣與轉速，設發(fā)酵液初始溶氧為100%，在培養(yǎng)過程中要確保發(fā)酵液溶氧在30%以上(例如通氣為O. 5-1VVM,轉速為120-250rpm);并在培養(yǎng)過程中流加氨水和稀硫酸以控制pH在6. 0-7. 5 ;溶氧在發(fā)酵培養(yǎng)開始后持續(xù)下降，然后開始回升，當發(fā)酵液溶氧回升至70%以上且總糖濃度低于30g/L時，開始間歇或連續(xù)補加糖類物質，使總糖濃度維持在10-40g/L，同時溶氧恢復并介于40-70%之間，發(fā)酵280h之后且當菌濃(PMV，取IOml發(fā)酵液3000rpm離心20min，計算固形物體積占發(fā)酵液體積的比例)降至15%以下時停止補糖，當溶氧升至90%以上且總糖降至10g/L以下即可停止發(fā)酵，收獲產(chǎn)物。現(xiàn)有技術在發(fā)酵生產(chǎn)尼莫克汀的程中普遍沒有連續(xù)補糖或間歇補糖操作。本發(fā)明的方法在發(fā)酵過程中連續(xù)補加或間歇補加高濃度單糖、二糖或多糖溶液，與目前工藝相比可提高發(fā)酵產(chǎn)量50%以上，且操作方法簡單易行，原材料來源廣泛，價格低廉，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，能夠很大程度提高生產(chǎn)水平，降低成本。
具體實施例方式下面通過實施例進一步詳細說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。以下具體實施例中所需補加的糖溶液的配制方法、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基的配制方法均如下補加糖溶液的配制配制300_600g/L的單糖、二糖或多糖單獨或混合溶液，118°C滅菌20min待用。種子培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，糊精10g/L，黃豆餅粉20g/L，棉籽餅粉15g/L，蛋白胨8g/L，硫酸鎂 lg/L，磷酸氫二鉀 O. 5g/L，pH6. 5。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖45g/L，乳糖20g/L，黃豆餅粉20g/L，棉籽餅粉15g/L，硝酸鈉O.5g/L,硫酸鎂lg/L,硫酸亞鐵氨0. 66g/L,氯化鎳O. 03g/L,碳酸韓4g/L, pH6. 8。葡萄糖和乳糖與其他不含碳源的物質分開滅菌。實施例I 500L發(fā)酵罐發(fā)酵過程中的間歇補料在50L種子罐中配制30L種子培養(yǎng)基，120°C滅菌30min后冷卻至27_29°C，按O. 5% (體積比)接種量接入48h種齡的搖瓶種子，然后27-29°C培養(yǎng)28_36h。在500L發(fā)酵罐中配制350L發(fā)酵培養(yǎng)基，120°C滅菌30min后冷卻至27-29°C，按5% (體積比)接種量接入培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基，發(fā)酵過程中控制溫度在27-29°C，控制壓力在O. 04-0. 06Mpa，根據(jù)溶氧狀況控制通氣與轉速，以確保溶氧在30%以上(設發(fā)酵罐初 始溶氧為100% )，通氣控制在O. 5-1VVM，轉速控制在120-250rpm，培養(yǎng)過程中流加氨水和10%稀硫酸控制pH在6. 0-7. 5之間。將發(fā)酵罐初始溶氧設定為100%，溶氧在發(fā)酵培養(yǎng)開始后持續(xù)下降，8_16h左右降至最低點，24h-48h左右開始回升，當發(fā)酵液溶氧回升至70%以上且總糖濃度低于30g/L時，每次補加相當于葡萄糖溶液與發(fā)酵液質量體積比為2%的500g/L葡萄糖溶液使總糖維持在10-40g/L，同時溶氧恢復并介于40-70%之間。發(fā)酵300h左右停止補糖，當溶氧升至90%以上且總糖降至10g/L以下即可放罐，測定最后發(fā)酵單位在 2. 95g/L。實施例2 5000L發(fā)酵罐發(fā)酵過程中的連續(xù)補料在500L種子罐中配制300L種子培養(yǎng)基，120°C滅菌30min后冷卻至27-29°C，按O. 5% (體積比)接種量接入48h種齡的搖瓶種子，然后27-29°C培養(yǎng)28_36h。在5000L發(fā)酵罐中配制3500L發(fā)酵培養(yǎng)基，120°C滅菌30min后冷卻至27-29°C，按5% (體積比)接種量接入種子培養(yǎng)基，發(fā)酵過程中控制溫度在27-29°C，控制壓力在
O.04-0. 06Mpa，根據(jù)溶氧狀況控制通氣與轉速以確保溶氧在30%以上(設發(fā)酵罐初始溶氧為100% )，通氣控制在O. 5-1VVM，轉速控制在90-180rpm，培養(yǎng)過程中流加氨水和10 %稀硫酸控制pH在6. 0-7. 5之間。將發(fā)酵罐初始溶氧設定為100%，溶氧在發(fā)酵培養(yǎng)開始后持續(xù)下降，8-16h左右降至最低點，24h-48h左右開始回升，當發(fā)酵液溶氧回升至70%以上且總糖濃度低于30g/L時，以適當流速流加500g/L乳糖與麥芽糖比例I : I混合溶液使總糖維持在10-40g/L，同時溶氧恢復并介于40-70%之間。發(fā)酵300h左右停止補糖，當溶氧升至90%以上且總糖降至10g/L以下即可放罐，測定最后發(fā)酵單位在3. 24g/L。
權利要求
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)尼莫克汀的方法，在發(fā)酵生產(chǎn)尼莫克汀的過程中，當發(fā)酵液中的總糖濃度低于30g/L時，通過向發(fā)酵液間歇或連續(xù)補加糖類物質，使發(fā)酵液中的總糖濃度維持在10-40g/L進行發(fā)酵。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述糖類物質選自單糖、二糖和多糖中一種或多種。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述單糖是葡萄糖和/或果糖。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述二糖是乳糖、蔗糖和/或麥芽糖。
5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述多糖是可溶性淀粉、糊精和/或麥芽糊不目ο
6.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述糖類物質配制為300-600g/L的糖溶液，然后間歇補加或連續(xù)補加到發(fā)酵液中。
7.如權利要求I所述的方法，其特征在于，設定發(fā)酵液的初始溶氧為100%，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液溶氧先下降然后回升，當發(fā)酵液溶氧回升至70%以上且總糖濃度低于30g/L時開始補加糖類物質。
8.如權利要求I所述的方法，其特征在于，發(fā)酵使用的菌株為藍灰鏈霉菌。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，在發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)藍灰鏈霉菌，控制發(fā)酵罐的溫度為27-29°C，壓力為O. 04-0. 06Mpa ;根據(jù)發(fā)酵液的溶氧狀況控制通氣與轉速，設發(fā)酵液初始溶氧為100%，在培養(yǎng)過程中要確保發(fā)酵液溶氧在30%以上；并在培養(yǎng)過程中流加氨水和稀硫酸控制PH在6. 0-7. 5 ;溶氧在發(fā)酵培養(yǎng)開始后持續(xù)下降，然后開始回升，當發(fā)酵液溶氧回升至70%以上且總糖濃度低于30g/L時，開始間歇或連續(xù)補加糖類物質，使總糖濃度維持在10-40g/L，同時溶氧恢復并介于40-70%之間，發(fā)酵280h之后當菌濃降至15%以下時停止補糖，當溶氧升至90%以上且總糖降至10g/L以下停止發(fā)酵，收獲產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種發(fā)酵生產(chǎn)尼莫克汀的方法。在發(fā)酵生產(chǎn)尼莫克汀的過程中，當發(fā)酵液中的總糖濃度低于30g/L時，通過向發(fā)酵液間歇或連續(xù)補加糖類物質，使發(fā)酵液中的總糖濃度維持在10-40g/L進行發(fā)酵生產(chǎn)。該方法使尼莫克汀發(fā)酵單位提高50％以上，同時，生產(chǎn)操作簡單，對設備要求低，成本較低，是一種適用于工業(yè)化生產(chǎn)的工藝。
文檔編號C12R1/465GK102952832SQ20111024285
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月23日 優(yōu)先權日2011年8月23日
發(fā)明者別一, 趙德, 劉會明 申請人:北大方正集團有限公司, 北大國際醫(yī)院集團重慶大新藥業(yè)股份有限公司, 北大國際醫(yī)院集團有限公司