專利名稱：一種適用于轉(zhuǎn)人乙肝表面抗原基因山羊的快速簡便檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因成分的檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及適用于轉(zhuǎn)人乙肝表面抗原基因轉(zhuǎn)基因山羊的快速簡便檢測方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因生物的安全評價是轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品市場化和商品化的前提，在安全評價中轉(zhuǎn)基因成分的檢測是一項重要內(nèi)容，建立轉(zhuǎn)基因生物快速、簡便、準確的檢測方法為安全評價和管理奠定基礎(chǔ)。乙型肝炎Ofepatitis B)是世界上分布最廣泛的傳染病之一，是由乙 型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)引起的。而乙肝表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)是HBV包膜蛋白的組分，具有良好的免疫原性，且HBV的保護性抗原表位主要集中于HBsAg,目前所研制的所有乙肝基因工程疫苗都是由HbsAg組成。我國已經(jīng)研制出了轉(zhuǎn)人乙肝表面抗原轉(zhuǎn)基因山羊，轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品市場化是將來發(fā)展的必然趨勢，因此建立一種快速、簡便的檢測轉(zhuǎn)人乙肝表面抗原的轉(zhuǎn)基因檢測的方法，具有必要性和緊迫性。綜合目前各國對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測技術(shù)，根據(jù)檢測目標，可將其分為以下三個水平插入的外源基因的檢測；插入外源基因的表達產(chǎn)物(RNA或者蛋白質(zhì))的檢測；插入的外源基因?qū)κ荏w生物基因表達的影響(外源基因的插入對位點附近的基因的影響從而對整個生物體的代謝的影響)的研究，而其中核酸水平的檢測應(yīng)用更為廣泛。核酸水平的檢測，主要采用的方法是PCR擴增，即依據(jù)轉(zhuǎn)入外源基因的啟動子、目的基因、終止子及表達(重組)載體信息，設(shè)計特異性引物，進行聚合酶鏈式反應(yīng)，依據(jù)產(chǎn)物的有無或多少判斷是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。PCR檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，通常涉及以下技術(shù)定性PCR、定量PCR、巢式PCR、多重PCR、熱不對稱交錯PCR等。PCR反應(yīng)具有高靈敏度、高特異性、高效性的特點，是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品初篩階段的主要檢測方法，需要進行PCR擴增和電泳檢測兩個環(huán)節(jié)，但必須依賴PCR儀和電泳儀等儀器設(shè)備，檢測費用高，對檢測人員有較高的技術(shù)要求，無法在條件較差的基層或現(xiàn)場進行。研發(fā)一種不需要設(shè)備，是與基層和現(xiàn)場快速檢測轉(zhuǎn)基因動物的方法具有重要意義和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的局限性，提供適用于轉(zhuǎn)人乙肝表面抗原基因山羊的快速簡便檢測方法，利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法原理建立外源基因的快速檢測方法，能準確快速檢測出轉(zhuǎn)基因山羊中人乙肝表面抗原基因。本發(fā)明不需要特殊設(shè)備，為基層檢測人員提供一種快速簡便的方法，本發(fā)明的方法同時也為轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品安全評價和管理提供借鑒。實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下(I)引物設(shè)計及合成根據(jù)人乙肝表面抗原(HBsAg)基因(登錄號Genbank:AF223961)設(shè)計特異性引物，所述引物的DNA序列如下所示FIP 5/ -CGAAAGCCCAGGATGATGGGAT-(AAGCTT)-TGCTGTACAAAACCTTCGGA-3'，BIP 5/ -AGATTCCTATGGGAGTGGGCCT-(AAGCTT)-CGAACCACTGAACAAATGGC—3'；F3 5/ -TCCTGCTCAAGGAACCTCTA-3'，B3 5/ -AAACAGTGGGGGAAAGCC-3'；
(2)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)以FIP、BIP為內(nèi)引物，F(xiàn)3、B3為外引物對人乙肝表面抗原基因進行恒溫擴增，其反應(yīng)體系為IM甜菜堿，400 μ M dNTPs,2. 5μ I IOXBst Buffer,Mg2+ lmM,6. 4U Bst DNA聚合酶，1μ I模板，外引物F3和Β3各0.2 μ Μ，內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μ Μ，補雙蒸水至25 μ 1，將上述除酶以外的所有試劑混勻置于200 μ IEP管中，于90°C反應(yīng)5min，反應(yīng)后立即冰浴l-2min，再加入6. 4U Bst DNA聚合酶，于63°C反應(yīng)60min，80°C下反應(yīng)5min后終止反應(yīng)；(3)環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增產(chǎn)物分析 I)瓊脂糖凝膠電泳取2. 5 μ I擴增產(chǎn)物，加入I μ I上樣緩沖液(濃度為40 %的甘油，O. 2%溴酚藍，59. 8% O. 25Μ Tris-HCl)，混勻，再于2%瓊脂糖凝膠中電泳30min,得到凝膠成像，觀察是否有階梯型條帶，若有階梯型條帶則判定為含有人乙肝表面抗原基因(即含有轉(zhuǎn)基因成分)，若沒有階梯型條帶則判定為不含人乙肝表面抗原基因。2)熒光染料染色將SYBR Green I熒光染料稀釋100倍(按體積計)后作為工作液，取5μ I的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增產(chǎn)物，再加O. 5 μ ISYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼觀察結(jié)果。若加入SYBR Green I工作液后，擴增產(chǎn)物變?yōu)辄S綠色，則判定為含有人乙肝表面抗原基因，若加入SYBR Green I工作液后，擴增產(chǎn)物為棕黃色則判定為不含有人乙肝表面抗原基因。本發(fā)明成功建立了對轉(zhuǎn)人乙肝表面抗原基因快速、靈敏、特異而又簡單實用的檢測方法。與其它傳統(tǒng)PCR方法相比該發(fā)明有以下優(yōu)點I.本發(fā)明經(jīng)濟實用反應(yīng)是在恒溫的條件下進行，所以不需要昂貴的PCR儀，只需要一臺可以提供恒溫的設(shè)備，例如水浴鍋即可。2.本發(fā)明的靈敏度高采用本方法可以檢測下限至10個拷貝的轉(zhuǎn)人乙肝表面抗原基因，比普通的PCR的靈敏度高10倍。3.本發(fā)明的特異性強本發(fā)明采用設(shè)計了 4條引物，可識別6個特異性區(qū)域，增加了與目的基因結(jié)合的特異性。4.本發(fā)明的檢出率高對5頭轉(zhuǎn)人乙肝表面抗原基因的轉(zhuǎn)基因山羊進行檢測，均檢測出轉(zhuǎn)基因成分，檢出率為100%，對15個人的DNA樣品進行了 LAMP擴增，結(jié)果表示，檢出率為100%。5.本發(fā)明檢測簡單直接肉眼觀察反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)SYBR Green I染色后的顏色變化來定性判斷靶序列擴增與否。


序列表SEQ ID NO :I是擴增的人乙肝表面抗原(HBsAg)基因(登錄號=Genbank AF223961)的部分核苷酸序列，序列長度為194bp。序列表SEQ ID NO :2_5分別是設(shè)計的引物序列(序列編號依次為FIP ；BIP ；F3和B3)。
圖I :本發(fā)明擴增的人乙肝表面抗原基因的特異片段，片段全長為194p，序列線條標記部分為引物所處位置，序列中方框所示位置為限制性內(nèi)切酶HaeIII識別的酶切位點。圖2 :PCR擴增人乙肝表面抗原基因電泳圖，圖中M DL2000 DNA marker ;1_3 :模板為人基因組DNA ；4 :模板為非轉(zhuǎn)基因山羊基因組DNA ；5 :水。圖3 :LAMP擴增人乙肝表面抗原基因電泳圖，圖中M DL2000 DNA marker ;1_3 :模板為人基因組DNA ；4 :模板為非轉(zhuǎn)基因山羊基因組DNA ；5 :水。圖4 =LAMP擴增人乙肝表面抗原基因可視化結(jié)果，圖中1_3 :模板為人基因組DNA ；4 :模板為非轉(zhuǎn)基因山羊基因組DNA ；5 :水。圖5 :LAMP擴增人乙肝表面抗原基因產(chǎn)物酶切組成圖，圖中方框所示部分為酶切后產(chǎn)物組成。圖6 =LAMP擴增人乙肝表面抗原基因產(chǎn)物酶切驗證電泳圖，圖中M DL2000 DNA marker ；1 =LAMP擴增產(chǎn)物；2 :酶切后的LAMP擴增產(chǎn)物。圖7 :是本發(fā)明構(gòu)建的pMD18T-HbsAg的結(jié)構(gòu)圖，圖中顯示了插入HBsAg(人乙肝表面抗原)基因片段。圖8 :LAMP與PCR擴增人乙肝表面抗原基因檢出限比較，圖中M :DL2000 DNAmarker ;1_7 :pMD18T_HBsAg 質(zhì)?？截悢?shù)依次 106，105，104，103，102，10、5 拷貝；8 :非轉(zhuǎn)基因山羊；9 :水。圖9 =LAMP擴增人乙肝表面抗原基因檢出限試驗可視化結(jié)果，圖中1_7 :pMD18T-HBsAg質(zhì)?？截悢?shù)依次106，105，104，103，102，10、5拷貝；8 :非轉(zhuǎn)基因山羊；9 :水。圖10 :LAMP檢測轉(zhuǎn)人乙肝表面抗原基因轉(zhuǎn)基因山羊，圖中M:DL2000 DNAmarker ;1_5 :轉(zhuǎn)人乙肝表面抗原基因轉(zhuǎn)基因山羊；6 :陽性對照，pMD18T-HBsAg質(zhì)粒；7 :陰性對照，非轉(zhuǎn)基因山羊基因組DNA ;8 :水。圖11 :LAMP檢測轉(zhuǎn)人乙肝表面抗原基因轉(zhuǎn)基因山羊可視化結(jié)果，圖中1_5 :轉(zhuǎn)人乙肝表面抗原基因轉(zhuǎn)基因山羊；6 :陽性對照，pMD18T-HBsAg質(zhì)粒；7 :陰性對照，非轉(zhuǎn)基因山羊基因組DNA ；8 :水。圖12 :LAMP擴增人乙肝表面抗原基因電泳圖，圖中M DL2000 DNA marker ;1_15 模板為人基因組DNA ；16 :模板為陽性對照質(zhì)粒；17 :模板為非轉(zhuǎn)基因山羊基因組DNA ；18 水。圖13 :LAMP擴增人乙肝表面抗原基因可視化結(jié)果，圖中1_15 :模板為人基因組DNA ；16 :模板為陽性對照質(zhì)粒；17 :模板為非轉(zhuǎn)基因山羊基因組DNA ；18 :水。
具體實施例方式實施例I :對人乙肝表面抗原基因目的片段進行擴增I、樣品的獲得I)轉(zhuǎn)人乙肝表面抗原(簡稱HBsAg)轉(zhuǎn)基因山羊基因組DNA的耳組織樣品由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室提供。按照TIANGEN的血液、細胞、組織基因組DNA提取試劑盒及其說明書操作(試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司)進行提取轉(zhuǎn)基因山羊DNA。2)人的血液樣品(采自中國湖北省武漢市)，用于提取基因組DNA，構(gòu)建陽性質(zhì)粒，驗證檢出率。按照常規(guī)方法采集人血樣，采用報道的酚-氯仿抽提法(參照薩姆布魯克，黃培堂譯.分子克隆實驗指南[M].科學(xué)出版社.北京2005版方法)抽提人基因組DNA，得到人基因組DNA。2.常規(guī)PCR擴增用常規(guī)的PCR擴增方法(薩姆布魯克，黃培堂譯.分子克隆實驗指南[M].科學(xué)出版社.北京2005)以兩條外引物即編號為F3、B3的引物擴增人基因組DNA中人乙肝表面抗原基因的目的片段(其核苷酸序列見SEQ ID N0:1和圖I所示，序列全長194bp)。同時以非轉(zhuǎn)基因山羊樣品作為陰性對照。I)反應(yīng)體系上游引物 F3 O. 2μΜ，下游引物 B3 O. 2 μ Μ，I μ I PCR buffer, I. 5mMMgCl2, 75 μ M dNTPs，0. 5UDNA聚合酶，人基因組DNA I μ L，用雙蒸水補齊至10 μ L。2)反應(yīng)程序95°C,5min ;34 個循環(huán)95°C lmin,58°C lmin,72°C 20s ；72°C,5min03)結(jié)果判定取2· 5μ I擴增產(chǎn)物，加入I μ I上樣緩沖液(配方濃度為40 %的(ν/ν)甘油，60% (v/v)0. 25MTris-HCl,0. 2% (w/v)溴酚藍)，混勻，然后在2%的瓊脂糖凝膠中電泳30min后，通過凝膠成像系統(tǒng)成像，可見長度為194bp大小的擴增片段，結(jié)果如圖2所示。3、LAMP 擴增以引物FIP、引物BIP的核苷酸序列為內(nèi)引物，以引物F3、引物B3所示的引物為外引物對人基因組DNA進行恒溫擴增，同時以非轉(zhuǎn)基因山羊基因組DNA作為陰性對照。I)反應(yīng)體系試劑組成如下1M 甜菜堿，400μΜ dNTPs, 2. 5μ I IOXBst Buffer,Mg2+ lmM,6. 4U BstDNA聚合酶，I μ I模板，外引物F3和Β3各O. 2 μ Μ，內(nèi)引物FIP和BIP各I. 6 μ Μ,補雙蒸水至25 μ I02)反應(yīng)程序?qū)⑸鲜龇磻?yīng)體系中除酶以外的所有試劑混勻置于200 μ I EP管中，于95°C反應(yīng)5min，立即冰浴l-2min，再加入6. 4U Bst DNA聚合酶，于63°C反應(yīng)60min ;然后置80°C下5min終止反應(yīng)。3)結(jié)果分析與判定①瓊脂糖凝膠電泳取2. 5 μ I擴增產(chǎn)物，加入I μ I上樣緩沖液(配方40 % (ν/V)甘油，60% (V/V)0. 25MTris-HCl,0. 2% (w/v)溴酚藍)，混勻，再于2%瓊脂糖凝膠中電泳30min，在凝膠系統(tǒng)下成像，觀察是否有階梯型條帶出現(xiàn)，若有階梯型條帶則判定為含有人乙肝表面抗原基因，若沒有階梯型條帶則判定不含有人乙肝表面抗原基因。②熒光染料染色SYBR Green I熒光染料稀釋100倍后作為工作液，取5 μ I的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增產(chǎn)物，再加O. 5 μ ISYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼觀察結(jié)果。若加ASYBR Green I工作液后，擴增產(chǎn)物變?yōu)辄S綠色，則判定含有人乙肝表面抗原基因，若加入SYBR Green I工作液后，擴增產(chǎn)物為棕黃色則判定為不含有人乙肝表面抗原基因。③結(jié)果判定在上述分析方法①中，在凝膠成相系統(tǒng)的紫外燈下，模板為人基因組DNA，即含有人乙肝表面抗原基因時，可以觀察到階梯型條帶，而模板為非轉(zhuǎn)基因山羊基因組DNA時，則觀察不到階梯型條帶，其結(jié)果如圖3所示。在上述分析步驟②中，當(dāng)模板為人的基因組DNA，即含有人乙肝表面抗原基因時，擴增產(chǎn)物變?yōu)辄S綠色，當(dāng)模板為非轉(zhuǎn)基因山羊基因組DNA時，擴增產(chǎn)物為棕黃色，其結(jié)果如4所示。
4) LAMP擴增產(chǎn)物特異性檢驗對LAMP擴增產(chǎn)物進行酶切驗證LAMP擴增產(chǎn)物在電泳檢測不是呈現(xiàn)一條帶，而是呈現(xiàn)出由多條帶組成的階梯型條帶，這是因為這種方法在擴增過程中形成以目的片段，連接在一起的長短不一的開環(huán)產(chǎn)物所造成。本發(fā)明中人乙肝表面抗原基因目的片段(其核苷酸序列見圖I所示)大小為194bp，在120bp處存在限制性內(nèi)切酶HaeIII所識別的酶切位點，在酶切位點處切開的產(chǎn)物分別由圖5中所示方框部分組成，酶切后的兩段長度應(yīng)分別是55bp和106bp。因此可使用HaeIII對LAMP擴增產(chǎn)物進行酶切，驗證LAMP擴增得到的階梯型條帶是否由人乙肝表面抗原基因目的片段所組成，①酶切反應(yīng)體系取3μ ILAMP擴增產(chǎn)物，加入O. 8μ I限制性內(nèi)切酶HaeIII (購自Fermentas 公司)和 1μ lbuffer,雙蒸水補至 10 μ I。②反應(yīng)程序于37°C恒溫培養(yǎng)箱中酶切6小時。 ③結(jié)果判定取2. 5 μ I擴增產(chǎn)物，加入I μ I上樣緩沖液(配方濃度為40% (ν/ν)甘油，60% (ν/ν) O. 25MTris-HCl,0. 2% (w/v)溴酚藍)，混勻，再于2%瓊脂糖凝膠中電泳30min，在凝膠系統(tǒng)下成像，觀察到酶切以后的LAMP擴增產(chǎn)物不再有階梯型條帶，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果說明本發(fā)明中LAMP擴增所得到的產(chǎn)物是人乙肝表面抗原基因。實施例2 :人乙肝表面抗原基因LAMP檢測方法靈敏度試驗用含目的基因的質(zhì)粒pMD18T-HBsAg作模板，驗證基因LAMP檢測方法的檢出限，并與PCR方法的檢出限作對比。具體步驟如下I、質(zhì)粒 pMD18T_HBsAg 的構(gòu)建I)人乙肝表面抗原基因目的片段PCR產(chǎn)物的回收純化用PCR方法以兩條外引物即引物F3(其序列見SEQ ID NO :4)、引物B3 (其序列見SEQ ID NO :5)擴增人基因組DNA。反應(yīng)體系上游引物F3 0.2μΜ，下游引物B3 O. 2 μ Μ，I μ I PCR buffer, I. 5mMMgcl2, 75 μ M dNTPs, 0. 5U DNA 聚合酶，人基因組 DNA I μ L，用雙蒸水補齊至 10 μ L。反應(yīng)程序95°C，5min ;34 個循環(huán)95°C lmin,58°C lmin，72°C 20s，72°C，5min。取50uL PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳30min，凝膠成相系統(tǒng)上成像?？梢钥吹?94bp大小的片段，結(jié)果如圖2所示。將擴增的目的基因從瓊脂糖凝膠上切下，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購自北京原平皓生物技術(shù)有限公司)回收DNA。2)目的片段PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接將回收產(chǎn)物與pMD18_T載體(購自武漢大風(fēng)生物科技有限公司)連接，連接體系為0· 5μ L PMD-18T載體，3· 5μ L solution I，3 μ L回收產(chǎn)物，將上述試劑混勻后4°C連接過夜。pMD18T-HbsAg的結(jié)構(gòu)圖如圖7所示。3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、pMD18T-HBsAg質(zhì)粒的鑒定及提取取5yL連接產(chǎn)物加Λ IOOyL大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞中，冰浴30min，42°C循環(huán)水中熱擊90s，快速冰浴l-2min使細胞冷卻，加入500 μ L LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床上培育45min，在4000rpm離心5min，棄去500 μ L上清液，將余下液體吹打均勻，吸取100 μ L涂布于含氨芐青霉素(100yg/ml)的LB瓊脂平皿上，37°C培養(yǎng)12h。用經(jīng)高壓蒸汽滅菌(121°C，滅菌30min)的10 μ L移液器頭挑取菌落置于800 μ L含氨芐青霉素(lOOyg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床震蕩培養(yǎng)4h，然后通過菌液PCR挑選陽性菌液，然后送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果經(jīng)比對確認以后，用質(zhì)粒小提試劑盒(購自TIANGEN公司，按照試劑盒的說明書介紹的方法操作)提取質(zhì)粒，并測定質(zhì)粒濃度。4)計算質(zhì)?？截悢?shù)計算質(zhì)粒拷貝數(shù)，其公式為(6. 23 X IO23拷貝/mol) X (濃度g/ml) + [堿基數(shù)X (660道爾頓/堿基)]=拷貝數(shù)/ml用雙蒸水將質(zhì)粒pMD18T-HBsAg進行倍比稀釋，使其終濃度為IO6拷貝/ μ 1，IO5拷貝 /μ 1，IO4 拷貝 /μ 1，IO3 拷貝 /μ 1，IO2 拷貝 /μ 1,101 拷貝 /μ 1，5 拷貝 /μ I。
2、LAMP方法檢測檢出限試驗利用本實施例中所稀釋好的質(zhì)粒pMD18T-HBsAg為模板，采用LAMP方法和PCR方法進行檢測的靈敏度試驗。I)LAMP方法擴增不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒pMD18T_HbsAg以引物FIP、BIP為內(nèi)引物，以引物F3、B3為外引物對本實施例中步驟I得到的質(zhì)粒pMD18T-HBsAg進行LAMP擴增，使體系中含質(zhì)?？截悢?shù)依次為106個，IO5個，IO4個，IO3個，IO2 個，10，5 個。①反應(yīng)體系試劑組成如下IM甜菜堿，400μ M dNTPs，2· 5μ I IOXBst Buffer,Mg2+ lmM,6. 4U Bst DNA聚合酶，I μ I模板，外引物F3和B3各0. 2 μ M，內(nèi)引物FIP和BIP各
I.6 μ M,補雙蒸水至25 μ I0②反應(yīng)程序?qū)⑸鲜龇磻?yīng)體系中除酶以外的所有試劑混勻置于200 μ I EP管中，于95°C反應(yīng)5min，立即冰浴l-2min，再加入6. 4U Bst DNA聚合酶，于63°C反應(yīng)60min ;然后置80°C下5min終止反應(yīng)。2)PCR方法擴增不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒pMD18T_HBsAg同時以兩條外引物F3、B3進行PCR擴增，使體系中含質(zhì)?？截悢?shù)依次為106個，IO5 個，IO4 個，IO3 個，IO2 個，10 個，5 個.①反應(yīng)體系上游引物F3 O. 2μΜ，下游引物 B3 O. 2 μ Μ，I μ I PCR buffer, I. 5mMMgcl2, 75 μ MdNTPs，0. 5U DNA聚合酶，人基因組DNA I μ L，用雙蒸水補齊至10 μ L。②反應(yīng)程序95°C，5min；34 個循環(huán)95°C lmin, 58°C lmin, 72°C 20s ；72°C, 5min。2)結(jié)果分析經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后得到結(jié)果當(dāng)pMD18T-HBsAg質(zhì)粒為IO2個拷貝時，PCR方法能擴增出特異性條帶，當(dāng)pMD18T-HBsAg質(zhì)粒為10個拷貝時，PCR方法未能擴增出特異性條帶，因此判定PCR方法對pMD18T-HBsAg質(zhì)粒的擴增下限為IO2個拷貝；當(dāng)pMD18T-HBsAg質(zhì)粒為10個拷貝時，LAMP方法能擴增出階梯型條帶，而當(dāng)pMD18T-HBsAg質(zhì)粒為5個拷貝時，LAMP方法未能擴增出階梯型條帶，因此判定LAMP對pMD18T-HBsAg質(zhì)粒的擴增下限為10個拷貝，PCR與LAMP比較的結(jié)果如圖8所示。LAMP擴增產(chǎn)物中，取5μ I加入O. 5μ ISYBRGreen I工作液，在日光下用肉眼觀察結(jié)果，結(jié)果質(zhì)?？截悢?shù)依次為106個，IO5個，IO4個，IO3個，IO2個，10個時，擴增產(chǎn)物變?yōu)辄S綠色，而質(zhì)?？截悢?shù)為5時，擴增產(chǎn)物則為棕黃色，結(jié)果如圖9所示。本實施例中，LAMP方法靈敏度高，采用本方法可以檢測下限至10個拷貝的人乙肝表面抗原目的基因，是普通PCR靈敏度高10倍。
實施例3 :對轉(zhuǎn)人乙肝表面抗原基因的轉(zhuǎn)基因山羊及人基因組DNA進行LAMP檢測對5頭轉(zhuǎn)人乙肝表面抗原的轉(zhuǎn)基因山羊DNA樣品及15個人基因組DNA樣品進行LAMP檢測，試驗中所用轉(zhuǎn)基因山羊的基因組DNA以及人的基因組DNA樣品，均稀釋到20ng/μ I。I) LAMP 擴增過程以FIP、BIP為內(nèi)引物，F(xiàn)3、B3為外引物對人乙肝表面抗原基因進行恒溫擴增，其反應(yīng)體系為IM甜菜堿，400 μ M dNTPs, 2. 5 μ I IOXBst Buffer,Mg2+ lmM,6. 4U Bst DNA聚合酶，1μ I模板，外引物F3和Β3各0.2 μ Μ，內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μ Μ，補雙蒸水至25 μ 1，將上述除酶以外的所有試劑混勻置于200 μ I EP管中，于90°C反應(yīng)5min，反應(yīng)后立即冰浴l-2min，再加入6. 4U Bst DNA聚合酶，于63°C反應(yīng)60min，80°C下反應(yīng)5min后終止反應(yīng)； 2)結(jié)果分析①瓊脂糖凝膠電泳取2. 5 μ I擴增產(chǎn)物，加入I μ I上樣緩沖液(40% (ν/ν)甘油，60% (ν/ν) O. 25Μ Tris-HCl, O. 2% (w/v)溴酚藍)，混勻，再于2%瓊脂糖凝膠中電泳30min，得到凝膠成像，觀察是否有階梯型條帶，若有階梯型條帶則含有人乙肝表面抗原基因，若沒有階梯型條帶則不含人乙肝表面抗原基因。②熒光染料染色將SYBR Green I熒光染料稀釋100倍后作為工作液，取5 μ I的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增產(chǎn)物，再加O. 5 μ ISYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼觀察結(jié)果。若加入SYBR Green I工作液后，擴增產(chǎn)物變?yōu)辄S綠色，則判定為含有人乙肝表面抗原基因，若加入SYBR Green I工作液后，擴增產(chǎn)物為棕黃色則判定為不含有人乙肝表面抗原基因。③結(jié)果判定本實施例的LAMP檢測方法檢測出了轉(zhuǎn)人乙肝表面抗原基因山羊的人乙肝表面抗原基因成分，如圖10、圖11及人DNA樣品中的人乙肝表面抗原基因成分，如圖
12、圖 13。
權(quán)利要求
1. 一種適用于轉(zhuǎn)人乙肝表面抗原基因山羊的快速、簡便檢測方法，其步驟包括 (1)引物設(shè)計及合成根據(jù)人乙肝表面抗原基因的序列設(shè)計特異性引物，所述引物的DNA序列如下所示FIP :5’ -CGAAAGCCCAGGATGATGGGAT-(AAGCTT)-TGCTGTACAAAACCTTCGGA-3’，BIP :5’ -AGATTCCTATGGGAGTGGGCCT-(AAGCTT)-CGAACCACTGAACAAATGGC-3’ ；F3 :5’ -TCCTGCTCAAGGAACCTCTA-3’，B3 :5， -AAACAGTGGGGGAAAGCC-3，； (2)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng) 以FIP、BIP為內(nèi)引物，F(xiàn)3、B3為外引物對人乙肝表面抗原基因進行恒溫擴增，其反應(yīng)體系為IM 甜菜堿，400 μ M dNTPs,2. 5μ I IOXBst Buffer, Mg2+ lmM,6. 4U Bst DNA 聚合酶，1μ I模板，外引物F3和Β3各0·2μΜ，內(nèi)引物FIP和BIP各1·6μΜ，補雙蒸水至25μ 1，將上述除酶以外的所有試劑混勻置于200 μ I EP管中，于90°C反應(yīng)5min，反應(yīng)后立即冰浴l-2min，再加入6. 4U Bst DNA聚合酶，于63°C反應(yīng)60min，80°C下反應(yīng)5min后終止反應(yīng)； (3)環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增產(chǎn)物分析 1)瓊脂糖凝膠電泳取2μ I擴增產(chǎn)物，加入I μ I上樣緩沖液，該緩沖液包含濃度為40%的甘油、O. 2%溴酚藍和59. 8% O. 25Μ Tris-HCl，混勻，再按質(zhì)量體積計加2%瓊脂糖凝膠，于5V/cm下電泳30min,得到凝膠成像,觀察是否有梯形條帶出現(xiàn)； 2)將SYBRGreen I熒光染料稀釋100倍后作為工作液，取5μ I的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增產(chǎn)物，再加O. 5 μ ISYBRGreen I的工作液，在日光下用肉眼觀察結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因動物中轉(zhuǎn)基因成分的分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及提供一種適用于轉(zhuǎn)人乙肝表面抗原山羊的快速簡便檢測方法，本發(fā)明利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法原理，準確快速檢測出轉(zhuǎn)基因山羊中的人乙肝表面抗原基因。本發(fā)明不需要特殊設(shè)備，為基層檢測人員提供一種快速簡便的方法，本發(fā)明的方法同時也為轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品安全評價和管理提供了實用的分子檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK102952852SQ201110244530
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月25日
發(fā)明者劉榜, 翟珊莉, 陶晨雨, 張慶德 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)