專利名稱：羽毛角蛋白厭氧降解菌株18d-ta的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對天然角蛋白具有降解作用的微生物菌株，尤其是一種羽毛角蛋白厭氧降解菌株18D-TA。屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著家禽養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；?、集約化的飛速發(fā)展，帶來兩方面主要問題一方面是產(chǎn)生大量羽毛廢棄物，按傳統(tǒng)的填埋、焚燒或產(chǎn)氣等方法去處理，嚴(yán)重污染環(huán)境；另一方面是加劇飼料原料特別是蛋白飼料短缺的嚴(yán)峻形勢。面對這兩方面的壓力，世界各國對一些非常規(guī)資源，如魚粉、羽毛粉的關(guān)注度越來越大。家禽羽毛中粗蛋白含量在80%以上，富含動物所需的多種必需氨基酸，但羽毛中90%非常穩(wěn)定的角蛋白很難被胃腸道內(nèi)的消化酶消化， 因此長期以來并未被高效利用，從而造成可利用資源的浪費。雖然國內(nèi)外很早就開展了羽毛廢棄物的資源化利用，但采用的方法主要是高溫高壓法、酸堿水解法、膨化法。這些物理化學(xué)方法具有較多的缺點，如設(shè)備要求高，投資大，耗能巨大，污染環(huán)境，羽毛粉營養(yǎng)價值低，質(zhì)量不穩(wěn)定，蛋白質(zhì)的消化率低，嚴(yán)重制約了技術(shù)的應(yīng)用與普及。自然界存在某些特殊的微生物，因其分泌角蛋白酶能將難降解的羽毛角蛋白分解，這一研究領(lǐng)域受到科學(xué)家們越來越多的關(guān)注。目前已分離純化出多個來自好氧微生物的角蛋白酶，但因其成本昂貴，不能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。而直接利用微生物發(fā)酵降解羽毛角蛋白，具有很多優(yōu)點，如反應(yīng)條件溫和，耗能少，不污染環(huán)境，所得蛋白質(zhì)或氨基酸產(chǎn)品營養(yǎng)價值高，消化率高，所以微生物發(fā)酵降解羽毛角蛋白具有巨大的應(yīng)用價值潛能。微生物發(fā)酵有好氧法和厭氧法。厭氧發(fā)酵角蛋白具有以下兩點優(yōu)勢一是厭氧條件下發(fā)酵產(chǎn)物能累積較多的蛋白質(zhì)或氨基酸等高附加值產(chǎn)品；二是厭氧發(fā)酵無需提供通氣設(shè)備，減少了發(fā)酵染菌的可能性，大大降低能耗和成本。目前發(fā)現(xiàn)的厭氧降解羽毛角蛋白的微生物菌種很少且羽毛降解效率不是很高。 1996年發(fā)現(xiàn)的/^mWoAacieriws pennavorans 70°C，48 h后降解羽毛剩下羽毛主梗 (Friedrich and Antranikian , 1996) ；2002 ^ ^ ^ T Fervidobacterium islandicum AW-l，70°C，24h后觀測到氨基酸含量明顯增加(Nam et al. 2002) ;2008年獲得了 Clostridium ■sporo^wes 菌株，42°C，7 天觀測到羽毛完全降解(Ionata et al. 2008)。由于這些菌種降解羽毛時間較長，不能很好滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。因此，缺乏高效的羽毛厭氧降解菌株及相應(yīng)的厭氧發(fā)酵技術(shù)工藝，成為限制這一綠色產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種厭氧降解羽毛角蛋白的微生物菌株 18D-TA，該菌株不但能快速地將完整羽毛完全降解，而且對角蛋白的降解效率高，同時由于降解產(chǎn)物中所含附加營養(yǎng)成分較高，因而滿足了工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下本發(fā)明提供的是一種羽毛角蛋白厭氧降解菌株18D-TA，它屬于T^idimicrobium菌屬的菌種，該菌株的分類命名為力i sp.，2011年4月觀日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種的保藏編號為CGMCC NO. 4800。本發(fā)明所述的18D-TA菌株具有以下微生物學(xué)特性 a、形態(tài)學(xué)的特性
菌株18D-TA在厭氧固體培養(yǎng)基培養(yǎng)3-5天出現(xiàn)0. 5-lmm白色球形菌落，該菌株呈桿狀，單生或多個連成線，也有單個球形，或者球形與桿狀相連，且細(xì)胞壁較厚。b、培養(yǎng)學(xué)的特性
以1% (w/v) tryptone (胰化蛋白胨)為碳源和氮源，再選取基本培養(yǎng)基嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)后，取適量菌液以600nm下的吸光度作為指標(biāo)，做菌株18D-TA的溫度試驗，pH試驗，NaCl濃度試驗，以及在最適溫度、PH和NaCl濃度下的倍增時間試驗。經(jīng)上述試驗，菌株18D-TA的最適溫度為45-60°C，pH 7. 0-9. 5，氯化鈉濃度 0. 1-0. 4%，倍增時間 3. 02h。所述基本培養(yǎng)基的成分含量為=K2HPO43g/L, KH2PO4 2.5 g/L，NaCl 3 g/L， MgSO4 ·7Η20 0. 02 g/L, CaCO3O. 02 g/L，維生素液 1% (ν/ν)，微量元素液 1% (ν/ν)， Cysteine-HCl · H2O 0. 1%(w/v)，質(zhì)量體積濃度為 0. 1% 的刃天青 0. 1% (v/v)，蒸餾水 1 L， pH 7. 0-7. 5。所述維生素液的組成為生物素2. 00 mg,葉酸2. 00 mg,吡哆醇-鹽酸10. OOmg, 二水合硫胺素-鹽酸5. 00 mg，核黃素5.00mg，煙酸5.00mg，D_泛酸鈣5.00mg，維生素B12 0. 10mg，對氨基苯甲酸5. 00mg，硫辛酸5. 00 mg，蒸餾水1000. OOml。所述微量元素液的組成為MgSO4.7 H2O 3. 00g, MnSO4 · H2O 0. 50 g，NaCl 1.00 g, FeSO4 · 7 H2O 0. 10 g, CoSO4 · 7 H2O 0. 18 g, CaCl2 · 2 H2O 0. 10 g, ZnSO4 · 7 H2O 0. 18 g，CuSO4. 5 H2O 0. 01 g，KAl (SO4)2 · 12 H2O 0. 02g, H3BO3 0. Olg, Na2MoO4 · 2 H2O 0. 01 g, NiCl2 · 6 H2O 0. 03g, Na2SeO3 ‘ 5 H2O 0. 30mg，蒸餾水 1000.00ml。C、生理生化特性
通過對菌株18D-TA分別進(jìn)行革蘭氏染色試驗、芽孢鑒定試驗(孔雀石綠法)、抗生素試驗、底物利用試驗、電子受體試驗(以蛋白胨為電子供體)、吲哚產(chǎn)物鑒定試驗(根據(jù)吲哚與對位二甲基氨基苯甲醛生成吲哚玫瑰圈法，采用m^rlich' s試劑)，其生理生化特性表現(xiàn)為
A、菌株18D-TA為革蘭氏陰性菌，產(chǎn)生芽孢和吲哚，對利福平、氯霉素和卡那霉素敏感， 對紅霉素、新霉素、青霉素和鏈霉素有抗性；
B、以蛋白胨為電子供體時，可作為菌株18D-TA電子受體的物質(zhì)有9，10_蒽醌-2， 6-雙磺酸鈉(AQDS)，F(xiàn)eCl3，無定形Fii2O3，檸檬酸鐵，Na2S2O3, NaNO3和延胡索酸鈉等檢測物質(zhì)。C、菌株18D-TA能利用的蛋白質(zhì)類物質(zhì)(1%—w/v)包括=Gelatin,明膠，大豆蛋白， 蛋白胨，牛肉膏，酵母粉，脫脂牛奶，膠原蛋白，干酪素等以及一些難降解的硬角蛋白類物質(zhì)，如雞毛，鴨毛，頭發(fā)，牛毛，豬毛，指甲等。氨基酸類物質(zhì)中可利用的有脯氨酸(20nmol/ L) + 丙氨酸(20nmol/L)，脯氨酸(20nmol/L) + 纈氨酸(20nmol/L)，脯氨酸(20nmol/L) + 絲氨酸(20nmol/L)。碳水化合物類物質(zhì)中可利用的有木聚糖(1%-w/v)，糖原(1%-w/v)，琥珀酸鹽(20nmol/L)，延胡索酸二鈉(20nmol/L)；表現(xiàn)為弱生長的有阿拉伯糖，乳糖，麥芽糖，鼠李糖，蜜二糖，棉子糖，果糖，蔗糖，葡萄糖，木糖，纖維二糖和海藻糖，所述碳水化合物的終濃度均為20nmol/L。菌株18D-TA厭氧降解羽毛的情況在45-60 V，pH 7. 0-9. 5，氯化鈉濃度 0. 1-0. 4%，嚴(yán)格厭氧條件下，該菌株能在ISh-Mh內(nèi)將未經(jīng)處理的羽毛完全降解，甚至該菌株作用9h后，羽毛結(jié)構(gòu)就已經(jīng)被崩解。d、菌種鑒定結(jié)果
PCR擴(kuò)增、測序該菌株以tryptone (胰蛋白胨)為底物厭氧培養(yǎng)至指數(shù)生長期，離心收集菌體，按細(xì)菌基因組提取試劑盒提取總DNA，電泳觀察。16S rRNA PCR反應(yīng)所用引物為通用引物(27f 5"-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ； 1492r :5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。PCR 反應(yīng)體系(50 μ 1)為模板 DNA 2 μ 1，引物 27f (10umol/L)和 1492r (IOumol/ L)各IylJXPCR MasterMix (購置于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)25 μ 1，雙蒸水21 μ 1。PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性5min ;94°C變性lmin，56 °C退火lmin，72°C延伸2 min ；第2步循環(huán)四次；72°C 10 min,電泳觀察。PCR產(chǎn)物純化后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。根據(jù)16S rRNA序列比較分析，所述菌株18D-TA的微生物分類地位為domain Bacteria , phylum 〃Firmicutes〃 , class "Clostridia" , order Clostridiales,family Incertae Sedis XI, genus Tepidimicrobium ,Tepidimicrobium ferriphilum 的最大相似度為94. 5%，初步鑒定為一個新種，命名為T^pidimicrobium. sp. 18D-TA，其 16S rRNA序列在GenBank上的登錄號為JF727749。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹在NCBI數(shù)據(jù)庫中，提交待測菌株的16S rRNA序列，用BLAST軟件進(jìn)行相似性比對。選取與待測菌株相似性最高的屬中所有的模式菌株的16S rRNA序列，用Clustalx軟件進(jìn)行多序列比對，再用序列分析軟件MEGA4. 1進(jìn)行分析。最后采用 Neighbour-jioning (鄰接法)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。本發(fā)明所述的菌株18D-TA是T^idimicrobium屬中首次報道能降解羽毛等角蛋白材料的菌株，且其降解羽毛角蛋白的速率也為最快的一種菌種，在菌株最適發(fā)酵條件(溫度55°C，pH8. 0-8. 5，嚴(yán)格厭氧)下20h能將完整羽毛完全降解，從而為厭氧高效降解羽毛角蛋白廢棄物提供了優(yōu)良的天然微生物菌種資源。同時，利用現(xiàn)代生物技術(shù)——基因工程、代謝組學(xué)、生物系統(tǒng)學(xué)等高科技技術(shù)，還可進(jìn)一步提高該菌株的羽毛角蛋白降解效率，并通過降解產(chǎn)物而獲得高附加值的營養(yǎng)成分，使該菌株的工業(yè)生產(chǎn)前景更加廣闊。


圖1為18D-TA菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu)圖，包括掃描電鏡圖a和投射電鏡圖b。圖2為18D-TA菌株在不同時間內(nèi)厭氧降解羽毛的變化圖。圖3為18D-TA菌株對羽毛角蛋白降解的微觀結(jié)構(gòu)。圖4為18D-TA菌株的溫度試驗圖。圖5為18D-TA菌株的pH試驗圖。圖6為18D-TA菌株的NaCl試驗圖。圖7為18D-TA菌株的生長周期試驗圖。
圖8為16S rRNA序列按照鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹示意圖。
具體實施例方式實施例1 :18D_TA菌株的篩選方法或分離方法
角蛋白厭氧降解菌的分離需在嚴(yán)格厭氧的條件下進(jìn)行，通過富集培養(yǎng)和分離純化達(dá)到分離出厭氧菌株的目的。1. 1試驗裝置與羽毛處理
由于細(xì)胞內(nèi)缺乏SOD和細(xì)胞色素氧化酶，同時多數(shù)還缺乏過氧化氫酶，因此，嚴(yán)格厭氧微生物只能生長在氧化還原電勢低于0. IV的環(huán)境中，即選用厭氧操作箱或由厭氧微生物研究中心提供的Hungate銅柱除氧系統(tǒng)厭氧裝置。羽毛處理家禽活宰點收集到的羽毛經(jīng)流水沖洗干凈，450C -55 °C烘干2_3天，備用。羽毛經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過100目篩子，供固體培養(yǎng)使用。1. 2富集培養(yǎng)
富集培養(yǎng)基的配制預(yù)先加入500ml蒸餾水于IL的三角瓶中，稱取培養(yǎng)基的組成成分， 溶解后，再加水至IL0煮沸5-8min，冷卻至室溫，加入0. 1% (w/v) Cysteine- HCl · H2O,用 5mol/l KOH調(diào)節(jié)pH至7. 0-7. 5，加入質(zhì)量體積濃度為0. 1%的刃天青溶液0. 1%( v/v)，通N2 (2. 0m3/h)，煮沸15min，冷卻后取50ml培養(yǎng)基分裝于預(yù)先加有1% (w/v)的羽毛作為唯一碳源和氮源的120ml血清瓶中，加上鋁封。121 °C，高溫濕熱滅菌30min。無菌無氧的NaHCO3和Na2S溶液的配置取500ml蒸餾水加于IL的三角瓶中，煮沸約lOmin，在Hungate銅柱除氧系統(tǒng)厭氧裝置下，通N2 (2. 0m3/h)，煮沸20min，冷卻后，取 70ml水分裝于預(yù)先加有NaHCO3 (10%—w/v)和Na2S (3%—w/v)的血清瓶中，待全部溶解后塞好內(nèi)塞，加上鋁封。用60ml注射器每瓶分別補(bǔ)加約120ml N2,121°C，高溫濕熱滅菌30min， 待用。接種接種前補(bǔ)加無菌無氧的NaHCO3溶液和Na2S溶液，使其終濃度分別達(dá)到0. 1% (w/v)和0. 3% (w/v)，接種量10%，55°C靜置培養(yǎng)。待60-70%的羽毛被降解時，轉(zhuǎn)接于新鮮的富集培養(yǎng)基中繼續(xù)富集3-4代。所述富集培養(yǎng)基的成分含量為羽毛1%，蛋白胨1%，NaCl 3 g/L，MgSO4 · 7H20 0. 02 g/L，0. 1% (w/v) Cysteine- HCl · H2O,質(zhì)量體積濃度為 0. 1% 刃天青溶液 0. 1% (ν/ν), 蒸餾水 1 L，pH 7. 0-7. 5。1. 3分離純化
烘干的羽毛用粉碎機(jī)粉碎，過100目篩子，得到羽毛粉，供配制固體管時使用。將富集后的培養(yǎng)物分別接種于液體選擇培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，采用Hungate滾管法，利用梯度稀釋，對樣品進(jìn)行分離純化，具體步驟如下
(1)滾管厭氧瓊脂糖固體培養(yǎng)基的制備制備過程與富集培養(yǎng)基相同，按4. 5ml/管分裝于螺口厭氧試管中，121°C，高溫濕熱滅菌30min。將滅菌后處于液體狀態(tài)的固體培養(yǎng)基置于50-55 °C水浴中，補(bǔ)加NaHCO3溶液和Na2S溶液，使其終濃度分別達(dá)到0. 1% (w/v)和0.3% (w/v)，用無菌無氧注射器取 0. 2ml-0. 3ml富集培養(yǎng)物，注入一支呈融化狀態(tài)的固體培養(yǎng)管中，輕輕顛倒混合均勻，從中再取0. 2ml-0. 3ml接菌的固體培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接至第二支固體培養(yǎng)管中，這樣反復(fù)稀釋至10_6 10_8。將接好菌的固體培養(yǎng)管放置于裝有冰水混合物的滾管機(jī)上進(jìn)行滾管，待固體培養(yǎng)基均勻覆蓋于厭氧管內(nèi)壁后，將管好的固體管垂直放置，55°C培養(yǎng)。每個菌樣重復(fù)2次。所述液體選擇培養(yǎng)基的成分含量為羽毛1% (w/v), K2HPO4 3 g/L，KH2PO4 2. 5 g/ L，NaCl 3 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 02 g/L, CaCO3 0. 02 g/L，維生素液 1% (v/v)，微量元素液 1% (v/v)，0. 1% (w/v)Cysteine- HCl ·Η20，質(zhì)量體積濃度為 0. 1% 刃天青溶液 0. 1% (ν/ν), 蒸餾水 1 L，ρΗ 7. 0-7. 5。所述維生素液、微量元素液的組成含量與基本培養(yǎng)基中所述的相同。所述固體培養(yǎng)基的成分含量為羽毛粉0.8%，K2HPO4 3 g/L，KH2PO4 2.5 g/L，NaCl 3 g/L，MgSO4 · 7H20 0. 02 g/L, CaCO3 0. 02 g/L，瓊脂糖 2% (w/v)，維生素液 1% (ν/ν), 微量元素液1% (v/v),0. 1% (w/v) Cysteine- HCl ·Η20，質(zhì)量體積濃度為0. 1%刃天青溶液 0. 1% (ν/ν)，蒸餾水 1 L，ρΗ 7. 0-7. 5。所述維生素液、微量元素液的組成含量與基本培養(yǎng)基中所述的相同。(2)挑取菌落菌的純化過程是多次挑取單菌落、稀釋滾管的過程。制備挑取菌落用的彎頭毛細(xì)管將玻璃細(xì)管(內(nèi)徑0. 5cm，外徑0. 8cm，長15cm)，兩端塞入脫脂棉，在酒精噴燈火焰上加熱并拉成毛細(xì)管，端部內(nèi)徑約為0. 5mm。12rC，30min 高溫濕熱滅菌，烘干備用。制備無菌無氧的選擇培養(yǎng)基，制備方法同富集培養(yǎng)基，每支厭氧管中分裝IOml培養(yǎng)基。制備無菌無氧的氮氣管備用。挑取菌落時，在Himgate操作系統(tǒng)中完成。將待挑取菌落的固體管管口朝上，固定于鐵架臺上，管身與水平面成30度角。打開固體管的同時，將Himgate操作系統(tǒng)的氣流大小調(diào)至適當(dāng)(從排氣針吹出的氣流橫向吹酒精燈火焰達(dá)到Icm左右為宜)、排氣針頭經(jīng)火焰灼燒滅菌冷卻后迅速伸入固體管內(nèi)，保證固體管處于無氧狀態(tài)。打開液體培養(yǎng)基厭氧管膠塞，并迅速將火焰灼燒過的排氣針插入液體管液面上方。以同樣的方法打開無菌無氧氮氣管，用作挑菌時的換氣管。將毛細(xì)管在火焰上灼燒，使末端彎曲至約90度，用鑷子去除多余彎曲部分，保留 2-3mm。毛細(xì)管另一端套乳膠管，在換氣管中深吸一口氮氣，以保證毛細(xì)管中無氧。將毛細(xì)管插入固體管中，并緩慢移至待挑取菌落處(不能碰到管內(nèi)壁)，吸取菌落，移出毛細(xì)管并快速插入液體管內(nèi)，折斷毛細(xì)管，蓋上內(nèi)塞，拔出針頭，蓋緊蓋子，厭氧靜置培養(yǎng)。重復(fù)滾管挑菌3、次直至所得培養(yǎng)物菌體形態(tài)、菌落形態(tài)及顏色均一致，革蘭氏染色結(jié)果一致。所述選擇培養(yǎng)基的成分含量為羽毛1% (w/v), K2HPO4 3 g/L，KH2PO4 2. 5 g/L, NaCl 3 g/L，MgSO4 ·7Η20 0. 02 g/L, CaCO3 0. 02 g/L，維生素液 1% (v/v)，微量元素液 1% (v/v),0. 1% (w/v) Cysteine- HCl ·Η20，質(zhì)量體積濃度為 0. 1% 刃天青溶液 0. 1% (ν/ν)，蒸餾水 1 L，ρΗ 7. 0-7. 5。所述維生素液、微量元素液的組成含量與基本培養(yǎng)基中所述的相同。實施例2 羽毛角蛋白降解作用的研究
制備選擇培養(yǎng)基，制備方法同富集培養(yǎng)基，分裝于預(yù)先裝有完整羽毛的厭氧管中， 12rC,30min高溫濕熱滅菌，補(bǔ)加NaHCO3和Na2S溶液(無菌無氧，終濃度分別為0. l%(w/v) 和0.3% (w/v))，接種分離純化的角蛋白厭氧降解菌18D-TA 10% (v/v)，55°C靜置培養(yǎng)，觀察羽毛被降解的情況。實施例3 菌株的鑒定形態(tài)特征
1)光學(xué)顯微鏡觀察
無菌注射器取適量培養(yǎng)物制片，使用Nikon Eclipse 80i相差顯微鏡于40 X，100 X觀察，用Nikon DXM-1200C相機(jī)拍照。2)掃描顯微鏡觀察
取對數(shù)生長期菌液，離心收集菌體，以PBS緩沖液(pH7. 2)沖洗，滴加于蓋玻片上， 自然干燥。樣品置于2. 5%戊二醛磷酸緩沖液(pH7. 2)，4°C冰箱過夜固定，用30%，50%，70%， 80%,95%乙醇逐級脫水，每次15min。樣品送四川大學(xué)分析測試中心做掃描電鏡分析，噴金后，Amray-IOOOB掃描電鏡觀察并拍照。3)透射電鏡觀察
a)取對數(shù)生長期菌液2-細(xì)1，放于離心管中，用1500-2000rpm離心10-15min，棄去上清液。b)用移液槍沿管壁緩慢加入約0. 5%戊二醛固定液，于4°C靜置15-30min。c) 10000-13000rpm 離心 10_15min，棄去上清液。d)用移液槍沿管壁緩慢加入3%戊二醛固定液預(yù)固定，送四川大學(xué)華西醫(yī)院電鏡室做透射電鏡分析。e)l%四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，EponSl包埋，半薄切片光學(xué)定位，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，日H-600IV型透射電鏡觀察并拍照。培養(yǎng)特征
以1% (w/v) tryptone為唯一碳源和氮源，再選取基本培養(yǎng)基嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)后，用菌液在600nm下的吸光度作為指標(biāo)，做菌株18D-TA的溫度試驗，pH試驗，NaCl濃度試驗，倍增時間試驗(在最適溫度，pH，NaCl濃度下)。生理生化實驗
對菌株18D-TA進(jìn)行革蘭氏染色試驗革蘭氏染色方法(劉芬et al.，2002);芽孢鑒定試驗孔雀石綠法；抗生素試驗-J種抗生素，終濃度200ng/ml ；底物利用試驗；電子受體試驗向含有1%大豆蛋白胨(電子供體)的培養(yǎng)基中分別加入20mmol/L的電子受體物質(zhì)一9， 10-蒽醌-2，6-雙磺酸鈉(々005)，F(xiàn)eCl3，無定形狗203，檸檬酸鐵，Na2S2O3, NaNO3，延胡索酸鈉，Na2SO4, NaNO2，亞硒酸鈉，然后接種，55°C厭氧培養(yǎng)，定期檢測生長情況或產(chǎn)物的產(chǎn)生一鐵離子采用鹽酸鄰菲羅啉分光光度計法；吲哚產(chǎn)物鑒定試驗根據(jù)吲哚與對位二甲基氨基苯甲醛生成吲哚玫瑰圈法，采用m^rlich' s試劑?；瘜W(xué)分類
菌株以tryptone為底物培養(yǎng)至指數(shù)生長期，離心收集菌體，按細(xì)菌基因組提取試劑盒(購置上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)說明方法提取總DNA，電泳觀察。16S rRNA PCR 反應(yīng)所用引物為通用引物((27f 5“-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3‘ ； 1492r 5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ‘)。PCR 反應(yīng)體系(50 μ 1)為模板 DNA 2 μ 1，引物 27f (10umol/L)和 1492r (IOumol/ L)各IylJXPCR MasterMix (購置于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)25 μ 1，雙蒸水21 μ 1。PCR反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性5min ;94°C變性lmin，56 °C退火lmin，72°C延伸2 min ；第2步循環(huán)四次；72°C 10 min，電泳觀察。PCR產(chǎn)物純化后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建在NCBI數(shù)據(jù)庫中，提交待測菌株的16S rRNA序列，用BLAST軟件進(jìn)行相似性比對。選取與待測菌株相似性最高的屬中所有的模式菌株的16S rRNA序列，用Clustalx軟件進(jìn)行多序列比對，再用序列分析軟件MEGA4. 1進(jìn)行分析。最后采用 Neighbour-jioning (鄰接法)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。實施例4:對比試驗
制備選擇培養(yǎng)基，分裝于預(yù)先裝有完整羽毛的厭氧管中，12rC，30min高溫濕熱滅菌， 補(bǔ)加NaHCO3和Na2S溶液(無菌無氧，終濃度分別為0. 1%和0. 3%)，實驗組接種分離純化的角蛋白厭氧降解菌18D-TA 10%，對照組不接菌，55°C靜置培養(yǎng)一段時間后，對比觀察羽毛被降解的情況。實驗組在9h時羽絨從羽軸上脫落，14h脫落的羽絨被降解，18h羽軸被降解， 只剩羽毛中最硬的羽柄部分。電鏡觀察羽毛顯微結(jié)構(gòu)變化，9h后對照組羽毛呈完整的竹節(jié)狀，實驗組羽毛已被該菌崩解。
權(quán)利要求
1.一種羽毛角蛋白厭氧降解菌株18D-TA，其特征在于該菌株的分類命名為 Tepidimicrobium sp.，2011年4月觀日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種的保藏編號為CGMCC NO. 4800。
2.如權(quán)利要求1所述的羽毛角蛋白厭氧降解菌株18D-TA，其特征在于該菌株具有以下微生物學(xué)特性a、形態(tài)學(xué)的特性菌株18D-TA在厭氧固體培養(yǎng)基下培養(yǎng)3-5天出現(xiàn)0. 5-lmm白色球形菌落，該菌株呈桿狀，單生或多個連成線，也有單個球形，或者球形與桿狀相連，且細(xì)胞壁較厚；b、培養(yǎng)學(xué)的特性菌株18D-TA經(jīng)溫度試驗，pH試驗，NaCl濃度試驗，以及在最適溫度、pH和NaCl濃度下的倍增時間試驗得知菌株18D-TA的最適溫度為45-60°C，pH 7. 0-9. 5，氯化鈉的質(zhì)量體積比濃度為0. 1-0. 4%，倍增時間3. 02h ；C、生理生化特性通過對菌株18D-TA分別進(jìn)行革蘭氏染色試驗、芽孢鑒定試驗、抗生素試驗、底物利用試驗、電子受體試驗、吲哚產(chǎn)物鑒定試驗，其生理生化特性表現(xiàn)為A、菌株18D-TA為革蘭氏陰性菌，產(chǎn)生芽孢和吲哚，對利福平、氯霉素和卡那霉素敏感， 對紅霉素、新霉素、青霉素和鏈霉素有抗性；B、以蛋白胨為電子供體時，可作為菌株18D-TA電子受體的物質(zhì)有9，10-蒽醌-2， 6-雙磺酸鈉(AQDS)，F(xiàn)eCl3，無定形!^e2O3，檸檬酸鐵，Na2S2O3, NaNO3或延胡索酸鈉；C、菌株18D-TA能利用的質(zhì)量體積比為1%的蛋白質(zhì)類物質(zhì)包括=Gelatin,明膠，大豆蛋白，蛋白胨，牛肉膏，酵母粉，脫脂牛奶，膠原蛋白或干酪素，以及雞毛，鴨毛，頭發(fā)，牛毛，豬毛或指甲類難降解的硬角蛋白類物質(zhì)；其中氨基酸類物質(zhì)中可利用的有脯氨酸(20nmol/ L) + 丙氨酸(20nmol/L)，脯氨酸(20nmol/L) + 纈氨酸(20nmol/L)，脯氨酸(20nmol/L) + 絲氨酸(20nmol/L)；碳水化合物類物質(zhì)中可利用的有木聚糖(1%-w/v)，糖原(1%-w/v)，琥珀酸鹽(20nmol/L)，延胡索酸二鈉(20nmol/L)；菌株18D-TA厭氧降解羽毛的情況在45-60°C, pH 7. 0-9. 5，氯化鈉濃度0. 1-0. 4%，嚴(yán)格厭氧條件下，該菌株能在Wh-24h內(nèi)將未經(jīng)處理的羽毛完全降解，且作用9h后，羽毛結(jié)構(gòu)就已經(jīng)被崩解；d、菌種鑒定結(jié)果PCR擴(kuò)增、測序該菌株以tryptone (胰蛋白胨)為底物厭氧培養(yǎng)至指數(shù)生長期，離心收集菌體，提取總DNA，電泳觀察，并經(jīng)測序后初步鑒定為一個新種，命名為T^pidimicrobium. sp. 18D-TA，其 16S rRNA 序列在 GenBank 上的登錄號為JF727749。
3.—種如權(quán)利要求1或2所述的羽毛角蛋白厭氧降解菌株18D-TA在水解角蛋白或含有角蛋白的物質(zhì)成短肽或氨基酸方面的應(yīng)用；所述含有角蛋白的物質(zhì)是指羽毛、頭發(fā)、豬毛、牛毛或指甲。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種羽毛角蛋白厭氧降解菌株18D-TA，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。該菌株的分類名稱為Tepidimicrobium sp.，保藏編號為CGMCCNO.4800。該菌株能快速地將完整羽毛完全降解，對角蛋白的降解效率高，且降解產(chǎn)物中附加的營養(yǎng)成分高，滿足了工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/01GK102321553SQ201110245868
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月24日
發(fā)明者鄧宇 申請人:農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所