專利名稱：檢測(cè)輪狀病毒a組的組合物、試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種特異性檢測(cè)病毒的組合物、試劑盒和檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
輪狀病毒主要感染人體小腸上皮細(xì)胞，從而造成細(xì)胞損傷，引起腹瀉，病程一般為一周左右，發(fā)熱持續(xù)3天，嘔吐2 3天，腹瀉5天，嚴(yán)重者出現(xiàn)脫水癥狀。引起小兒秋冬腹瀉的輪狀病毒主要屬A組，成人輪狀病毒多為B組，A、B組形態(tài)上無(wú)法區(qū)分。全世界每年因輪狀病毒A組感染導(dǎo)致的嬰幼兒死亡的人數(shù)大約為90萬(wàn)人，其中大多數(shù)發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。在我國(guó)，2歲以內(nèi)的嬰幼兒約為4000萬(wàn)人，每年大約1000萬(wàn)嬰幼兒患輪狀病毒感染性胃腸炎，占嬰幼兒人數(shù)的1/4，是引起嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉的最主要病原。輪狀病毒為雙鏈RNA病毒，球形顆粒，直徑70nm，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，耐熱，耐酸堿，表面有血凝素，培養(yǎng)較困難。輪狀病毒是由糞口路徑傳播，也有可能經(jīng)由呼吸路徑傳染。受感染者每毫克糞便中可以包含上億個(gè)有傳染性的病毒顆粒，其中只要10個(gè)到100個(gè)病毒顆粒就可以具備傳播和感染能力。輪狀病毒A組在20°C左右活躍，其流行有明顯的季節(jié)性。兒童多集中在每年10月至12月期間感染輪狀病毒，秋冬交接時(shí)期尤其要注意謹(jǐn)防小兒感染輪狀病毒。人一生中感染輪狀病毒A組的經(jīng)過(guò)大致為第一次感染通常會(huì)產(chǎn)生癥狀，感染后， 免疫系統(tǒng)產(chǎn)生部分的保護(hù)機(jī)制，故下一次感染通常無(wú)癥狀。童年獲得的免疫力使大部分的成人對(duì)輪狀病毒A組并不易感。兩歲以下兒童的感染癥狀發(fā)生比例最高。雖然新生兒感染的機(jī)會(huì)很常見(jiàn)，但是通常癥狀溫和或是無(wú)癥狀；六個(gè)月到兩歲的小孩及存在免疫缺陷的小孩的癥狀最為嚴(yán)重。輪狀病毒A組在嬰幼兒之間有很強(qiáng)的傳染性和致病性，為了有效的保護(hù)患兒和易感兒童，應(yīng)做到早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早診斷、早治療，這使輪狀病毒A組的早期診斷方法顯得尤為重要。由于該病毒血清型較多，病毒分離或培養(yǎng)繁雜費(fèi)時(shí)，且費(fèi)用高，實(shí)驗(yàn)條件高，使以往的病原學(xué)診斷受到限制?？乖饦?biāo)法檢測(cè)敏感度低，假陰性高，細(xì)胞培養(yǎng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不利于快速檢測(cè)，并且涉及活的病毒培養(yǎng)，對(duì)于操作人員來(lái)說(shuō)具備一定的危險(xiǎn)性。近年來(lái)針對(duì)病毒核酸序列的PCR反應(yīng)快速檢測(cè)技術(shù)開(kāi)始出現(xiàn)。對(duì)于PCR檢測(cè)來(lái)說(shuō)，引物的選擇至關(guān)重要， 直接影響檢測(cè)的特異性。如果引物特異性不夠，則可能導(dǎo)致檢測(cè)的假陽(yáng)性結(jié)果或者假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。目前，發(fā)明一種能特異性檢測(cè)輪狀病毒A組的物質(zhì)和方法非常緊迫，但是還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于針對(duì)上述存在的問(wèn)題，提供一種能特異性檢測(cè)輪狀病毒A 組的組合物。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是這樣的一種檢測(cè)輪狀病毒A組的組合物，包括下述引物
Pl :5’ - GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCC -3’，
P2 :5，- AAYTGYGGTATATTCAATACCATACA -3，，其中，Y 為 C 或 T。作為優(yōu)先還包括下述探針
Probe :5’ -熒光報(bào)告基團(tuán)AARGAGCTAWCCGYTAGCCAGACGG -熒光淬滅基團(tuán)_3’，其中R 為A或G，Y為C或T，W為A或T。發(fā)明人針對(duì)病毒特異的靶序列設(shè)計(jì)Taqman探針，用于檢測(cè)病毒時(shí)很大程度上保證了結(jié)果的特異性
進(jìn)一步的其中所述熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，所述熒光淬滅基團(tuán)為ECLIPSE。本發(fā)明的目的之二在于提供一種能特異性檢測(cè)輪狀病毒A組的試劑盒。采用的技術(shù)方案為一種檢測(cè)輪狀病毒A組的試劑盒，包括病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系、PCR反應(yīng)體系和上述的組合物。作為優(yōu)選所述PCR反應(yīng)體系為實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系。本發(fā)明的發(fā)明目的之三在于提供一種能特異性檢測(cè)輪狀病毒A組的方法。采用的技術(shù)方案為一種檢測(cè)輪狀病毒A組的方法，依次包括以下步驟
1)提取樣品中的病毒RNA;
2)使用權(quán)利要求1-3中所述的組合物和使用權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，用PCR 法擴(kuò)增所述病毒相應(yīng)核酸序列；
3)反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行分析上述步驟(2)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行分析，得出檢測(cè)結(jié)論。作為優(yōu)選所述的PCR法為實(shí)時(shí)熒光PCR法。進(jìn)一步的所述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為反應(yīng)體系為20 μ 1，包括5 X PCR緩沖液 4 ？ lU0mmol/L dNTP 0. 8 l、20 mol/L 引物各 0. 4 ？ 1、10 mol/L 探針各 0. 4 ？ 1、 QIAGEN逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶混合物0. 8 1、模板2ul，加滅菌水至終體系20 ？ 1。作為優(yōu)選所述PCR法的循環(huán)參數(shù)為
50°C，逆轉(zhuǎn)錄30min ；95°C,10min;進(jìn)入循環(huán)階段95°C變性15s，56°C退火延伸lmin， 共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，退火延伸階段采集熒光信號(hào)。綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是本檢測(cè)體系所檢測(cè)標(biāo)本無(wú)活病毒，在樣品處理的第一步RNA提取的裂解過(guò)程中就可使活病毒迅速死亡，減少了對(duì)操作人員的生物危害。本方法無(wú)需培養(yǎng)，整個(gè)反應(yīng)在3小時(shí)內(nèi)完成，大大節(jié)省了人力與時(shí)間，可用于快速檢測(cè)輪狀病毒A組。在更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，采用本發(fā)明所述的特異性探針，利用TaqMan實(shí)時(shí)熒光 PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，該方法由于自動(dòng)化程度高，無(wú)需開(kāi)蓋檢測(cè)PCR產(chǎn)物，減少了產(chǎn)物污染的機(jī)會(huì)。利用本發(fā)明的組合物、試劑盒和/或方法對(duì)輪狀病毒A組進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)范圍為 IO8 IO1拷貝基因組當(dāng)量/反應(yīng)體系，該檢測(cè)快速簡(jiǎn)便，整個(gè)反應(yīng)在3小時(shí)內(nèi)完成，并且特異性高，準(zhǔn)確度高。


圖1實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系檢測(cè)輪狀病毒RNA的靈敏度對(duì)比圖(圖中IO6 IO1為輪狀病毒RNA的拷貝數(shù))；
圖2實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系對(duì)輪狀病毒A組RNA的檢測(cè)特異性對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)的說(shuō)明。需要指出的是，這里列出的實(shí)施例僅僅為示例性說(shuō)明的目的，而不應(yīng)將其解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的任何限制。其中使用的試劑盒、緩沖液等試劑僅僅為該具體實(shí)施例中具體選擇的試劑，應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要選擇其他公司的相應(yīng)試劑以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。為了特異性檢測(cè)輪狀病毒A組，發(fā)明人選擇了其基因組特異性序列作為靶標(biāo)序列，針對(duì)該序列設(shè)計(jì)了特異性引物，并通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)選擇了最具有特異性的一對(duì)引物(Pl 和P2，見(jiàn)下表1)用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，選擇Pl和P2作為特異性引物，用RT-PCR方法檢測(cè)樣品中輪狀病毒A組的RNA的存在。使用該方法，可特異性檢測(cè)樣品中輪狀病毒A組的RNA， 進(jìn)而特異性檢測(cè)樣品中輪狀病毒A組的存在，并且在檢測(cè)初期就要求裂解使病毒死亡，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員造成威脅。優(yōu)選使用熒光實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)，同時(shí)整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中無(wú)需對(duì)檢測(cè)物開(kāi)蓋取出進(jìn)行普通PCR的凝膠電泳，減少了污染，節(jié)約了時(shí)間，使檢測(cè)和分析更加簡(jiǎn)便，縮短了檢測(cè)的時(shí)間；使用TaqMan技術(shù)標(biāo)記的熒光實(shí)時(shí)PCR法，該探針為針對(duì)該靶標(biāo)序列特異性探針，增強(qiáng)了檢測(cè)的特異性。本發(fā)明中熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)可以分別是FAM 禾口 Eclipse。引物和TaqMan探針的設(shè)計(jì)與合成
利用Genbank的Blast工具對(duì)輪狀病毒A組基因組進(jìn)行分析，選擇其穩(wěn)定的保守區(qū)域作為檢測(cè)靶標(biāo)序列，并針對(duì)檢測(cè)靶標(biāo)序列設(shè)計(jì)引物和探針(見(jiàn)表1)。引物和探針均由日本 TaKaRa大連寶生物公司合成，其中檢測(cè)探針5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記Eclipse熒光淬滅基團(tuán)。表1引物及探針序列
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)輪狀病毒A組的組合物，其特征在于包括下述引物Pl :5’ - GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCC -3’，P2 :5，- AAYTGYGGTATATTCAATACCATACA -3，，其中，Y 為 C 或 T。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)輪狀病毒A組的組合物，其特征在于所述的組合物中還包括下述探針Probe :5’ -熒光報(bào)告基團(tuán)AARGAGCTAWCCGYTAGCCAGACGG -熒光淬滅基團(tuán)_3’，其中R 為A或G，Y為C或T，W為A或T。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)輪狀病毒A組的組合物，其特征在于其中所述熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，所述熒光淬滅基團(tuán)為Eclipse。
4.一種檢測(cè)輪狀病毒A組的試劑盒，其特征在于包括病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系、PCR 反應(yīng)體系和權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)輪狀病毒A組的試劑盒，其特征在于所述PCR反應(yīng)體系為實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系。
6.一種檢測(cè)輪狀病毒A組的方法，其特征在于依次包括以下步驟提取樣品中的病毒RNA;使用權(quán)利要求1-3中所述的組合物和使用權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，用PCR法擴(kuò)增所述病毒相應(yīng)核酸序列；反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行分析上述步驟(2)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行分析，得出檢測(cè)結(jié)論。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)輪狀病毒A組的方法，其特征在于所述的PCR法為實(shí)時(shí)熒光PCR法。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)輪狀病毒A組的方法，其特征在于所述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系為 20 μ 1，包括 5XPCR緩沖液4 ？ lUOmmol/L dNTP 0. 8 l、20 mol/L 引物各0.4 ？ l、10 mol/L探針各0. 4 ？ 1、QIAGEN逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶混合物0. 8 1、模板2ul，加滅菌水至終體系20 ？ 1。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)輪狀病毒A組的方法，其特征在于所述PCR法的循環(huán)參數(shù)為50°C，逆轉(zhuǎn)錄30min ；95°C,10min;進(jìn)入循環(huán)階段95°C變性15s，56°C退火延伸lmin， 共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，退火延伸階段采集熒光信號(hào)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)輪狀病毒A組的組合物，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，包括下述引物5’-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCC-3’和5’-AAYTGYGGTATATTCAATACCATACA-3’還包括探針5’-熒光報(bào)告基團(tuán)AARGAGCTAWCCGYTAGCCAGACGG-熒光淬滅基團(tuán)-3’，還公開(kāi)了包含上述引物和探針的試劑盒及應(yīng)用其檢測(cè)輪狀病毒A組的方法，利用本發(fā)明的組合物、試劑盒和/或方法對(duì)輪狀病毒A組進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)范圍為108～101拷貝基因組當(dāng)量/反應(yīng)體系，該檢測(cè)快速簡(jiǎn)便，整個(gè)反應(yīng)在3小時(shí)內(nèi)完成，并且特異性高，準(zhǔn)確度高。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102260752SQ20111024606
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月25日
發(fā)明者汪耀, 王玲 申請(qǐng)人:成都新基因格生物科技有限公司