專利名稱：一種快速鑒定結(jié)核分枝桿菌死活的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病原微生物的檢測與鑒定，具體涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)快速鑒定結(jié)核分枝桿菌死活的方法。
背景技術(shù)：
結(jié)核病至今仍然是全球范圍內(nèi)對人類健康危害最嚴重的細菌性傳染病之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全世界現(xiàn)有結(jié)核病人2 000萬，每年新發(fā)生約900萬例，每年死亡300萬人，約1/ 3人群有潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染。由于人口劇增、移民增加、旅游業(yè)發(fā)展、耐藥性的產(chǎn)生、人類免疫缺陷病毒感染流行、吸毒、酗酒與貧困等原因，結(jié)核病呈日益嚴重回升趨勢。至今，死菌活菌的鑒定，一直是微生物檢測的重大難題之一。由于只有活性的結(jié)核分枝桿菌才具有傳染性和侵襲力，但是目前對結(jié)核分枝桿菌的多種檢測方法，從涂片鏡檢為主的微生物學(xué)診斷方法(國家標準GB/T 14擬6. 48-2001)，到特異抗原的免疫學(xué)檢測技術(shù)、核酸探針、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)等分子生物學(xué)檢測方法，都均難以進行結(jié)核分枝桿菌死活菌的鑒定。目前涂片技術(shù)為抗酸染色，死亡的結(jié)核分枝桿菌也能被著色，因此無法區(qū)分；免疫學(xué)檢測技術(shù)是利用抗原抗體的特異性結(jié)合，死亡的結(jié)核分枝桿菌仍然具有抗原的一般特性；作為基因診斷的PCR技術(shù)，以DNA為檢測靶點，DNA在死亡的結(jié)核分枝桿菌樣本中仍然存在；培養(yǎng)技術(shù)雖然能夠區(qū)分死菌與活菌，但是結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)周期長達56 日，無法滿足目前對快速檢測的要求。疊氮溴化乙錠(ethidium bromide monoazide, EMA)是一種只能進入具有不完整細胞膜的死細胞中的DNA分子核酸染料。死細胞暴露于EMA僅需Imin的時間，便可以滲透細胞壁或細胞膜與其中的DNA結(jié)合，使其不能發(fā)生擴增反應(yīng)。Jf-^11^(loop-mediated isothermal amplification of DNA, 簡稱LAMP)克服以往基因擴增方法的不足，在恒溫條件下能夠特異、高效、快速的核酸擴增， 具有很多的優(yōu)點，在63 65°C溫度下進行循環(huán)鏈置換反應(yīng)，0. 5至1. 5小時即可進行結(jié)果判斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種將疊氮溴化乙錠與環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴增技術(shù)相結(jié)合快速鑒定結(jié)核分枝桿菌死活的方法，該方法檢測時間短、特異性強、靈敏度高、檢準率高，適用于臨床和疾控部門的檢測鑒定。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下 一種快速鑒定結(jié)核分枝桿菌死活的方法，包括如下步驟
(1)樣品的預(yù)處理取待檢樣品，加入終濃度為10至1000yg/mL的疊氮溴化乙錠 (ethidium bromide monoazide, EMA)，暗處放置 1 IOOmin ；然后暴露在 50(Tl000W 的鹵素?zé)粝抡丈?0秒 10分鐘，此過程在冰浴上進行；所述待檢樣品為已鑒定含有結(jié)核分枝桿菌的樣品或分離的結(jié)核分枝桿菌；
(2)模板DNA制備取上述處理過的樣品，提取DNA；
(3)恒溫基因擴增反應(yīng)反應(yīng)體系為25μ1，包括4條特異性引物，廣IOmM的dNTPs， 廣IOmM的MgSO4，廣IOM的甜菜堿，廣5μ1模板DNA，廣8U Bst DNA聚合酶，加蒸餾水至25μ1， 混勻；于60 65 °C下，擴增60 80分鐘；
(4)結(jié)果判斷在上述反應(yīng)產(chǎn)物中加入廣2μ 1顯色劑STOR GREEN I，混勻后觀察反應(yīng)液的顏色，若顏色呈綠色則說明樣本中存在活的結(jié)核分枝桿菌，若顏色呈橙色，則說明樣本中不存在活的結(jié)核分枝桿菌；
步驟(3)所述特異性引物選自以下5組引物中任一組，其中外引物1的濃度為 0.廣10mM，外引物2的濃度為0.廣10mM，內(nèi)引物1的濃度為廣10mM，內(nèi)引物2的濃度為廣IOmM
引物組1:
外引物 1 :TCATCGCCGATCATCAGG (SEQ ID No. 1) 外引物 2 CGAGTTTGGTCATCAGCCG (SEQ ID No. 2)
內(nèi)引物 1 :TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT (SEQ ID No. 3) 內(nèi)引物 2 :TGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG (SEQ ID No. 4)； 引物組2 :
外引物 1 :ACTACGACCACATCAACCG (SEQ ID No. 5) 外引物 2 :TCAGCGATCGTGGTCCT (SEQ ID No. 6)
內(nèi)引物 1 :CGGGCACCGTAAACACCGTACGATGGCGAACTCAAGGAG (SEQ ID No. 7) 內(nèi)引物 2 :AGTGTGGCTAACCCTGAACCGAGTTTGGTCATCAGCCGTTC (SEQ ID No. 8)； 引物組3
外引物 1 :ACGATGGCCACCTCCA (SEQ ID No. 9) 外引物 2 :CGGGTTTGATCAGCTCGG (SEQ ID No. 10)
內(nèi)引物 1 :CTCGCTGAACCGGATCGATGTGGAAGGCGTACTCGACCTGA (SEQ ID No. 11) 內(nèi)引物 2 :CAGGCATCCAACCGTCGGTTCGTCTCGGCTAGTGCA (SEQ ID No. 12)； 引物組4
外引物 1 :ATCGATCCGGTTCAGCG (SEQ ID No. 13)
外引物 2 :AGTAGGCAGCCTCGAGTTC (SEQ ID No. 14)
內(nèi)引物 1 :AGGGCTTGCCGGGTTTGATCAATGCACTAGCCGAGACGA (SEQ ID No. 15)
內(nèi)引物 2 :AGGATGTCGAGTTGGCCACCTCGCCGCAGTACTGGTA (SEQ ID No. 16)；
引物組5
外引物 1 GAGTCGATCTGCACACAGC (SEQ ID No. 17) 外引物 2 GAGTTTGGTCATCAGCCGT (SEQ ID No. 18) 內(nèi)引物 1 :TGAGTTCGCCATCGCGCATGCCGATCGCCCCAT (SEQ ID No. 19) 內(nèi)引物 2 :GTCCACGCCGCCAACTACGCTCGATGCCCTCACGGT (SEQ ID No. 20)。
優(yōu)選的，上述一種快速鑒定結(jié)核分枝桿菌死活的方法，步驟(2)中的反應(yīng)體系包括 0. 2mM外引物1，0. 2mM外引物2，1. 6mM內(nèi)引物1，1. 6mM內(nèi)引物2，1. 6mM的dNTPs，6mM的 MgSO4, IM的甜菜堿，3 μ 1模板DNA，8U Bst DNA聚合酶，加蒸餾水至25 μ 1。
本發(fā)明將疊氮溴化乙錠與環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴增技術(shù)相結(jié)合，根據(jù)結(jié)核分枝桿菌保守基因IS6100序列設(shè)計四條特異性引物，采用四條特異性引物及一種具有鏈置換活性的 DNA聚合酶，在63 65°C對樣品DNA模板進行擴增，短時間擴增效率可達到IO9 101°個拷貝， 通過加入STOR Green I觀察顏色變化來判斷擴增與否。本發(fā)明具有以下有益效果
(1)對設(shè)備的要求低只需一恒定溫度就能擴增反應(yīng)，不需要特殊試劑與設(shè)備；
(2)高特異性根據(jù)結(jié)核分枝桿菌保守基因IS6100序列設(shè)計四條特異性引物，特異識別靶基因序列上的六個獨立區(qū)域，根據(jù)是否擴增就能判斷靶標物質(zhì)的存在與否，陽性率可達大于99. 9%，假陽性率小于0. ；
(3)快速、高效擴增擴增在不到2小時即可完成，且產(chǎn)率高；
(4)靈敏度高用于病原微生物的檢測和傳染病的診斷中，對結(jié)核分枝桿菌的最低檢測極限達到10個細胞以內(nèi)，標本的檢出率達到97% ；
(5)鑒定簡便通過肉眼觀察鑒定，無需電泳等其他任何分析步驟；
(6)用途廣可廣泛用于臨床和疾控部門的檢測鑒定。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。以下實施例中所用樣品是已鑒定為結(jié)核分枝桿菌患者的痰液或支氣管灌洗液。當然，在實際操作中，也可以采用其他已鑒定含有結(jié)核分枝桿菌的樣品，或者分離的結(jié)核分枝桿菌。實施例1引物設(shè)計
根據(jù)結(jié)核分枝桿菌保守基因IS6100序列設(shè)計引物，并通過實驗篩選得到下列5組特異性引物
引物組1:
外引物 1 :TCATCGCCGATCATCAGG (SEQ ID No. 1)； 外引物 2 CGAGTTTGGTCATCAGCCG (SEQ ID No. 2)；
內(nèi)引物 1 :TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT (SEQ ID No. 3)； 內(nèi)引物 2 :TGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG (SEQ ID No. 4)。引物組2:
外引物 1 :ACTACGACCACATCAACCG (SEQ ID No. 5)； 外引物 2 :TCAGCGATCGTGGTCCT (SEQ ID No. 6)；
內(nèi)引物 1 :CGGGCACCGTAAACACCGTACGATGGCGAACTCAAGGAG (SEQ ID No. 7)； 內(nèi)引物 2 :AGTGTGGCTAACCCTGAACCGAGTTTGGTCATCAGCCGTTC (SEQ ID No. 8)。引物組3
外引物 1 :ACGATGGCCACCTCCA (SEQ ID No. 9)； 外引物 2 :CGGGTTTGATCAGCTCGG (SEQ ID No. 10)；
內(nèi)引物 1 :CTCGCTGAACCGGATCGATGTGGAAGGCGTACTCGACCTGA (SEQ ID No. 11)； 內(nèi)引物 2 :CAGGCATCCAACCGTCGGTTCGTCTCGGCTAGTGCA (SEQ ID No. 12)。引物組4
外引物 1 :ATCGATCCGGTTCAGCG (SEQ ID No. 13)；外引物 2 :AGTAGGCAGCCTCGAGTTC (SEQ ID No. 14)；
內(nèi)引物 1 :AGGGCTTGCCGGGTTTGATCAATGCACTAGCCGAGACGA (SEQ ID No. 15)；
內(nèi)引物 2 :AGGATGTCGAGTTGGCCACCTCGCCGCAGTACTGGTA (SEQ ID No. 16)。引物組5
外引物 1 GAGTCGATCTGCACACAGC (SEQ ID No. 17)；
外引物 2 GAGTTTGGTCATCAGCCGT (SEQ ID No. 18)；
內(nèi)引物 1 :TGAGTTCGCCATCGCGCATGCCGATCGCCCCAT (SEQ ID No. 19)；
內(nèi)引物 2 :GTCCACGCCGCCAACTACGCTCGATGCCCTCACGGT (SEQ ID No. 20)。以下實施例可選用上述5組引物的任一組對結(jié)核分枝桿菌的死活進行快速鑒定， 均可達到本發(fā)明的技術(shù)效果。實施例2結(jié)核分枝桿菌死活鑒定 1、樣品預(yù)處理
本實施例中所用樣品是已鑒定為結(jié)核分枝桿菌患者的痰液，將樣品按以下步驟進行處
理
(1)取2ml結(jié)核病患者痰液于管中，在痰樣標本中加入1 2倍痰樣體積的4%的NaOH；
(2)每隔2min渦旋振蕩15s，處理15min，然后吸取Iml加入帶旋蓋的離心管中， 12000r/min離心15min，去上清液；
(3)加入0.9%的NaCl lml，洗滌，12000r/min離心5min，去上清液；
(4)加入終濃度為100μ g/mL的EMA樣本處理液，暗處放置IOmin ；
(5)隨后整管暴露在650W的鹵素?zé)粝?，照?0s。2、模板DNA制備
(1)沸水中煮上述處理過的樣品20分鐘后立即置于冰上冷卻10分鐘；
(2)IOOOOrpm離心2分鐘，上清即可作為待用的模板DNA。3、環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增反應(yīng)
反應(yīng)體系為25μ1，包括4條特異性引物，1. 6mM的dNTPs，6mM的MgSO4, IM的甜菜堿，3μ1 模板DNA，8U Bst DNA聚合酶，加蒸餾水至25μ1，混勻；于63°C下，擴增60分鐘。所述4條特異性引物選自實施例1的引物組1，4條引物的序列如SEQ ID No.廣4 所示。其中內(nèi)引物ι的濃度為1. 6mM,內(nèi)引物2的濃度為1. 6mM，外引物1的濃度為0. 2 mM, 外引物2的濃度為0.2 mM。4、結(jié)果判斷
在反應(yīng)產(chǎn)物中加入Ιμ 顯色劑(1XSYBR Green I )，混勻，靜置5min。若顏色呈綠色則說明樣本中存在活的結(jié)核分枝桿菌，若顏色呈橙色，則說明樣本中不存在活的結(jié)核分枝桿菌。在本實施例中，反應(yīng)產(chǎn)物呈綠色，說明待檢樣品中存在活的結(jié)核分枝桿菌。將待檢樣品接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)6周，觀察結(jié)果，結(jié)果與LAMP檢測結(jié)果相一致。實施例3 結(jié)核分枝桿菌死活鑒定 1、樣品預(yù)處理
本實施例中所用樣品是已鑒定為結(jié)核分枝桿菌患者的支氣管灌洗液作為樣品，按以下步驟進行處理
(1)取5ml結(jié)核病患者的支氣管灌洗液于管中，IOOOrpm離心2分鐘，去上清；
(2)加入終濃度為100μ g/mL的EMA樣本處理液，暗處放置IOmin ；
(3)隨后整管暴露在650W的鹵素?zé)粝拢丈?min。2、模板DNA制備
(1)沸水中煮上述處理過的樣品20分鐘后立即置于冰上冷卻10分鐘；
(2)IOOOOrpm離心2分鐘，上清即可作為待用的模板DNA。3、環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增反應(yīng)
反應(yīng)體系為25μ1，包括4條特異性引物，2mM的dNTPs，IOmM的MgSO4, 2M的甜菜堿，5μ1 模板DNA，8U Bst DNA聚合酶，加蒸餾水至25μ1，混勻；于63°C下，擴增60分鐘。所述4條特異性引物選自實施例1中的引物組2。 4條引物的序列如SEQ ID No. 5、所示。其中內(nèi)引物1的濃度為2mM，內(nèi)引物2的濃度為2mM，外引物1的濃度為0. 5 mM，外引物2的濃度為0. 5mM。4、結(jié)果判斷
在反應(yīng)產(chǎn)物中加入2μ1顯色劑(1XSYBR Green I )，混勻，靜置5min。若顏色呈綠色則說明樣本中存在活的結(jié)核分枝桿菌，若顏色呈橙色，則說明樣本中不存在活的結(jié)核分枝桿菌。在本實施例中，反應(yīng)產(chǎn)物呈橙色，說明待檢樣品中不存在活的結(jié)核分枝桿菌。 將待檢樣品接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)6周，觀察結(jié)果結(jié)果與LAMP檢測
結(jié)果相一致。
權(quán)利要求
1. 一種快速鑒定結(jié)核分枝桿菌死活的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)樣品的預(yù)處理取待檢樣品，加入終濃度為10至lOOOyg/mL的疊氮溴化乙錠 (ethidium bromide monoazide, EMA)，暗處放置 1 IOOmin ；然后暴露在 50(Tl000W 的鹵素?zé)粝抡丈?0秒 10分鐘，此過程在冰浴上進行；所述待檢樣品為已鑒定含有結(jié)核分枝桿菌的樣品或分離的結(jié)核分枝桿菌；(2)模板DNA的制備取上述處理過的樣品，提取DNA作為模板DNA；(3)恒溫基因擴增反應(yīng)反應(yīng)體系為25μ1，包括4條特異性引物，廣IOmM的dNTPs， 廣IOmM的MgSO4，廣10M的甜菜堿，廣5μ1模板DNA，廣8U Bst DNA聚合酶，加蒸餾水至25μ1， 混勻；于60 65 °C下，擴增60 80分鐘；(4)結(jié)果判斷在上述反應(yīng)產(chǎn)物中加入廣2μ 1顯色劑STOR GREEN I，混勻后觀察反應(yīng)液的顏色，若顏色呈綠色則說明樣本中存在活的結(jié)核分枝桿菌，若顏色呈橙色，則說明樣本中不存在活的結(jié)核分枝桿菌；步驟(3)所述特異性引物選自以下5組引物中任一組，其中外引物1的濃度為 0.廣10mM，外引物2的濃度為0.廣10mM，內(nèi)引物1的濃度為廣10mM，內(nèi)引物2的濃度為廣IOmM 引物組1:外引物 1 :TCATCGCCGATCATCAGG (SEQ ID No. 1) 外引物 2 CGAGTTTGGTCATCAGCCG (SEQ ID No. 2)內(nèi)引物 1 :TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT (SEQ ID No. 3) 內(nèi)引物 2 :TGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG (SEQ ID No. 4)； 引物組2 :外引物 1 :ACTACGACCACATCAACCG (SEQ ID No. 5) 外引物 2 :TCAGCGATCGTGGTCCT (SEQ ID No. 6)內(nèi)引物 1 :CGGGCACCGTAAACACCGTACGATGGCGAACTCAAGGAG (SEQ ID No. 7) 內(nèi)引物 2 :AGTGTGGCTAACCCTGAACCGAGTTTGGTCATCAGCCGTTC (SEQ ID No. 8)； 引物組3外引物 1 :ACGATGGCCACCTCCA (SEQ ID No. 9) 外引物 2 :CGGGTTTGATCAGCTCGG (SEQ ID No. 10)內(nèi)引物 1 :CTCGCTGAACCGGATCGATGTGGAAGGCGTACTCGACCTGA (SEQ ID No. 11) 內(nèi)引物 2 :CAGGCATCCAACCGTCGGTTCGTCTCGGCTAGTGCA (SEQ ID No. 12)； 引物組4外引物 1 :ATCGATCCGGTTCAGCG (SEQ ID No. 13)外引物 2 :AGTAGGCAGCCTCGAGTTC (SEQ ID No. 14)內(nèi)引物 1 :AGGGCTTGCCGGGTTTGATCAATGCACTAGCCGAGACGA (SEQ ID No. 15)內(nèi)引物 2 :AGGATGTCGAGTTGGCCACCTCGCCGCAGTACTGGTA (SEQ ID No. 16)；引物組5外引物 1 GAGTCGATCTGCACACAGC (SEQ ID No. 17) 外引物 2 GAGTTTGGTCATCAGCCGT (SEQ ID No. 18) 內(nèi)引物 1 :TGAGTTCGCCATCGCGCATGCCGATCGCCCCAT (SEQ ID No. 19)內(nèi)引物 2 :GTCCACGCCGCCAACTACGCTCGATGCCCTCACGGT (SEQ ID No. 20)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速鑒定結(jié)核分枝桿菌死活的方法，其特征在于，步驟 (2)中的反應(yīng)體系包括0. 2mM外引物1,0. 2mM外引物2，1. 6mM內(nèi)引物l，1.6mM內(nèi)引物2， 1. 6mM的dNIPs，6mM的MgSO4, IM的甜菜堿，3 μ 1模板DNA，8U Bst DNA聚合酶，加蒸餾水至 25 μ 1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速鑒定結(jié)核分枝桿菌死活的方法，其原理是將疊氮溴化乙錠與環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴增技術(shù)相結(jié)合，根據(jù)結(jié)核分枝桿菌保守基因IS6100序列設(shè)計四條特異性引物，采用四條特異性引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在63~65℃對樣品DNA模板進行擴增，短時間擴增效率可達到109~1010個拷貝，通過加入SYBRGreenI觀察顏色變化來判斷擴增與否。本發(fā)明方法檢測時間短、特異性強、靈敏度高，對結(jié)核分枝桿菌死活菌的鑒定準確率達99%以上，可廣泛應(yīng)用于臨床和疾控部門的檢測鑒定。
文檔編號C12R1/32GK102286623SQ201110246309
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月25日
發(fā)明者葉宇鑫, 周琳, 唐大運, 常彥磊, 石磊, 鐘球, 陳濤 申請人:廣東省結(jié)核病控制中心, 廣州迪澳生物科技有限公司