專利名稱：固定化漆酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶的固定化領(lǐng)域，具體涉及一種固定化漆酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
漆酶(laccase，Ε. C. 1. 10. 3. 2)是一種含銅多酚氧化酶，廣泛存在于真菌、細(xì)菌和植物中。漆酶具有較廣泛的底物專一性和較強(qiáng)的穩(wěn)定性，能催化許多酚類和芳香胺類物質(zhì)， 如苯酚、對(duì)氯苯酚、苯胺以及多酚和多胺類物質(zhì)，因而在生物傳感器、生物燃料電池、生物轉(zhuǎn)化及廢水處理等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。但由于漆酶易溶于水，在水中游離的漆酶不可回收也不能長(zhǎng)期保存，且在高溫或其他極端環(huán)境下漆酶的穩(wěn)定性不易保持，因而限制了漆酶的實(shí)際應(yīng)用。固定化技術(shù)在保持游離漆酶的專一、高效的催化活性的同時(shí)，更是提高漆酶重復(fù)利用性、操控性和穩(wěn)定性的有效手段，常用的固定化載體包括活性炭、殼聚糖、多孔硅膠以及微濾膜等多種材料，但現(xiàn)有的固定化材料存在固定化效率低、加工工藝復(fù)雜、分離困難以及操作性不高等缺陷。新型介孔材料由于具有納米規(guī)整的有序孔道結(jié)構(gòu)、巨大的比表面積及孔容等特征，在生物催化和分離領(lǐng)域，尤其是在作為酶固定化載體的研究和應(yīng)用上顯示了極大潛力。 有文獻(xiàn)報(bào)道，用大孔徑的磁性介孔硅固定漆酶，固定化酶的活性回收率較高，且提高了漆酶的PH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性(Yufang Zhu et al,Chemistry of Materials，2007，6408-6413)， 但該類介孔材料具有制備過程繁瑣、難以分離等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有大比表面積和二級(jí)介孔結(jié)構(gòu)的磁性介孔碳材料固定的且具有優(yōu)異酶學(xué)性能的固定化漆酶，以及相應(yīng)提供該固定化漆酶的制備方法。為解決上述問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種固定化漆酶，其以磁性介孔碳為載體，漆酶通過物理吸附作用固定于所述磁性介孔碳上，所述磁性介孔碳的孔道內(nèi)嵌入有磁性納米顆粒，所述磁性介孔碳上的漆酶吸附量在140mg/g以上，所述固定化漆酶的酶活性回收率為60% 95% (優(yōu)選的技術(shù)方案可達(dá)75% 95% )。作為對(duì)上述的固定化漆酶的優(yōu)化，所述的磁性介孔碳與漆酶的質(zhì)量配比為 1 (1 2. 5)。作為對(duì)上述的固定化漆酶的優(yōu)化，所述磁性介孔碳含有有序雙峰介孔結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的，該有序雙峰介孔結(jié)構(gòu)是指磁性介孔碳孔徑分布的兩個(gè)峰值分別出現(xiàn)在4nm附近區(qū)域和 ISnm附近區(qū)域。4nm附近區(qū)域特別是指孔徑主要集中分布在4nm 5nm的孔徑范圍內(nèi)，18nm 附近區(qū)域特別是指孔徑主要集中分布在14nm ISnm的孔徑范圍內(nèi)。作為一個(gè)總的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供上述的固定化漆酶的制備方法，包括以下步驟先準(zhǔn)備磁性介孔碳和漆酶溶液，所述漆酶溶液中漆酶的初始濃度為0. 3mg/ml 1. Omg/ml，所述漆酶溶液的pH值為3. 0 6. 0 ；然后將磁性介孔碳加入至所述漆酶溶液中，在25V 30°C的溫度下對(duì)混合溶液振蕩池以上；再經(jīng)過洗滌、磁性分離、冷凍和真空干燥后，得到固定化漆酶。上述的制備方法中，優(yōu)選地，所述漆酶溶液是由漆酶與檸檬酸緩沖液或磷酸緩沖液配制而成，所述檸檬酸緩沖液的PH值為3. 5 4. 0，所述磷酸緩沖液的pH值為4. 5 5 · 5 ο作為對(duì)上述的制備方法的優(yōu)化，所述振蕩的轉(zhuǎn)速為IOOrpm 120rpm，所述振蕩的時(shí)間為3h 7h。作為對(duì)上述的制備方法的優(yōu)化，所述磁性介孔碳通過以下方法制得(1)先將嵌段共聚物(模板劑)與正硅酸乙酯在30°C 35°C的溫度下混合攪拌 20h Mh，再將混合液轉(zhuǎn)移至135°C 140°C下水熱反應(yīng)2 Mh，得到白色沉淀，將所述白色沉淀洗滌至中性后過濾、干燥，得到白色粉末；(2)將上述得到的白色粉末在500°C 550°C的溫度下煅燒4h ^后(模板劑嵌段共聚物被脫除)得到介孔硅模板；(3)利用初濕浸漬法將由金屬硝酸鹽、乙醇和糠醇組成的多元溶液滲透到所述介孔硅模板中，然后在70°C 80°C的空氣中對(duì)滲透有多元溶液的介孔硅模板固化IOh 12h， 干燥后得到復(fù)合物；(4)將所述步驟(3)得到的復(fù)合物在N2中于800°C 900°C的溫度下熱處理Ih 池，然后用加熱至80°C 90°C的氫氧化鈉溶液洗滌移除復(fù)合物中的硅模板，再對(duì)移除硅模板后的復(fù)合物過濾、清洗和干燥，得到磁性介孔碳。上述的制備方法中，優(yōu)選地，所述金屬硝酸鹽是指摩爾比為1 (1 11)的 Fe (NO3) 3 與 Ni (NO3) 2 的混合物。上述的制備方法中，優(yōu)選地，所述漆酶溶液中漆酶的初始濃度為O.^ig/ml或 1. Omg/ml，所述漆酶溶液的pH值為4. 0，所述振蕩的轉(zhuǎn)速為IOOrpm，所述振蕩的時(shí)間為3h。本發(fā)明的固定化漆酶的制備方法中，漆酶的固定化時(shí)間，漆酶溶液的pH值，以及漆酶溶液中的漆酶初始濃度對(duì)固定化漆酶的制備有著重要的影響，我們以不同固定化條件下的載體吸附酶量和固定化酶活性作為確定標(biāo)準(zhǔn)，通過以下實(shí)驗(yàn)得到本發(fā)明的固定化漆酶的制備方法中的工藝參數(shù)。1.固定化時(shí)間范圍的確定取40mg磁性介孔碳作為載體，加入IOOmL裝有40mg漆酶的磷酸緩沖液中(濃度為50mM，pH值為4. 0)，于30°C下以IOOrpm的速度振蕩15min 420min，磁性分離后用緩沖液清洗數(shù)次；用福林酚試劑法(lowry法)分別測(cè)定固定前緩沖溶液中漆酶量及固定后緩沖液中剩余的漆酶量，計(jì)算不同時(shí)間內(nèi)單位載體吸附的漆酶量，得到的結(jié)果如表1所示；由表 1可知，單位載體吸附漆酶量隨時(shí)間增長(zhǎng)不斷增高，但在池后吸附漆酶量達(dá)到平衡，因此， 適宜的固定化時(shí)間范圍為池以上；考慮到隨著時(shí)間延長(zhǎng)，漆酶活損失增加，因此，上述技術(shù)方案中確定的優(yōu)選振蕩固化時(shí)間為池 7h，最佳的固定化時(shí)間為池。表1 不同振蕩時(shí)間下載體吸附漆酶量
權(quán)利要求
1.一種固定化漆酶，其特征在于所述固定化漆酶以磁性介孔碳為載體，漆酶通過物理吸附作用固定于所述磁性介孔碳上，所述磁性介孔碳的孔道內(nèi)嵌入有磁性納米顆粒，所述磁性介孔碳上的漆酶吸附量在140mg/g以上，所述固定化漆酶的酶活性回收率為60% 95%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化漆酶，其特征在于所述的磁性介孔碳與漆酶的質(zhì)量配比為1 (1 2. 5)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固定化漆酶，其特征在于所述磁性介孔碳含有有序雙峰介孔結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的固定化漆酶，其特征在于所述有序雙峰介孔結(jié)構(gòu)是指孔徑分布的兩個(gè)峰值分別出現(xiàn)在4nm附近區(qū)域和18nm附近區(qū)域。
5.一種如權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的固定化漆酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟先準(zhǔn)備磁性介孔碳和漆酶溶液，所述漆酶溶液中漆酶的初始濃度為0. 3mg/ml 1. Omg/ml，所述漆酶溶液的pH值為3. O 6. O ；然后將磁性介孔碳加入至所述漆酶溶液中， 在25°C 30°C的溫度下對(duì)該溶液振蕩池以上；再經(jīng)過洗滌、磁性分離、冷凍和真空干燥后， 得到固定化漆酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的固定化漆酶的制備方法，其特征在于所述漆酶溶液是由漆酶與檸檬酸緩沖液或磷酸緩沖液配制而成，所述檸檬酸緩沖液的PH值為3. 5 4. 0，所述磷酸緩沖液的PH值為4. 5 5. 5。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的固定化漆酶的制備方法，其特征在于所述振蕩的轉(zhuǎn)速為IOOrpm 120rpm，所述振蕩的時(shí)間為汕 訃。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的固定化漆酶的制備方法，其特征在于，所述磁性介孔碳通過以下方法制得(1)先將嵌段共聚物與正硅酸乙酯在30°C 35°C的溫度下混合攪拌20h Mh，再將混合液轉(zhuǎn)移至135°C 140°C下水熱反應(yīng)2 Mh，得到白色沉淀，將所述白色沉淀洗滌至中性后過濾、干燥，得到白色粉末；(2)將上述得到的白色粉末在500°C 550°C的溫度下煅燒4h 證后得到介孔硅模板；(3)利用初濕浸漬法將由金屬硝酸鹽、乙醇和糠醇組成的多元溶液滲透到所述介孔硅模板中，然后在70°C 80°C的空氣中對(duì)滲透有多元溶液的介孔硅模板固化IOh 12h，干燥后得到復(fù)合物；(4)將所述步驟(3)得到的復(fù)合物在N2中于800°C 900°C的溫度下熱處理Ih 2h， 然后用加熱至80°C 90°C的氫氧化鈉溶液洗滌移除復(fù)合物中的硅模板，再經(jīng)過濾、清洗和干燥，得到磁性介孔碳。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的固定化漆酶的制備方法，其特征在于所述金屬硝酸鹽是指摩爾比為1 (1 1. 1)的Fe (NO3) 3與Ni (NO3) 2的混合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的固定化漆酶的制備方法，其特征在于所述漆酶溶液中漆酶的初始濃度為0. 4mg/ml或1. Omg/ml，所述漆酶溶液的pH值為4. 0，所述振蕩的轉(zhuǎn)速為 lOOrpm，所述振蕩的時(shí)間為池。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固定化漆酶，其以磁性介孔碳為載體，漆酶通過物理吸附作用固定于磁性介孔碳上，磁性介孔碳的孔道內(nèi)嵌入有磁性納米顆粒，磁性介孔碳上的漆酶吸附量在140mg/g以上，固定化漆酶的酶活性回收率為60％～95％；本發(fā)明相應(yīng)公開了該固定化漆酶的制備方法，包括以下步驟先準(zhǔn)備磁性介孔碳和漆酶溶液，漆酶溶液的濃度為0.3～1.0mg/ml，漆酶溶液的pH值為3.0～6.0；然后將磁性介孔碳加入至漆酶溶液中，在25℃～30℃的溫度下對(duì)該溶液振蕩3h以上；經(jīng)過后續(xù)處理得到固定化漆酶；本發(fā)明的固定化漆酶基于磁性介孔碳固定漆酶，使得漆酶具有優(yōu)異酶學(xué)性能；本發(fā)明的固定化漆酶的制備方法，操作簡(jiǎn)單，成本低廉。
文檔編號(hào)C12N11/14GK102286455SQ20111024718
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月26日
發(fā)明者伍夢(mèng)詩(shī), 劉媛媛, 危臻, 龐婭, 曾光明, 李貞 , 湯琳, 雷曉霞 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)