專利名稱：一種產(chǎn)堿性淀粉酶的嗜堿芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株產(chǎn)堿性淀粉酶的嗜堿芽孢桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
α -淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1)是一種降解淀粉的重要的工業(yè)用酶，主要應(yīng)用在食品、 紡織、醫(yī)藥、洗滌劑等領(lǐng)域。堿性淀粉酶最適反應(yīng)PH應(yīng)高于8.0，堿性淀粉酶可用于紡織品退漿、洗滌劑添加劑以及以淀粉作粘結(jié)劑的粘度調(diào)節(jié)劑等。Horikosh i在1971年首先報(bào)道了產(chǎn)自嗜堿菌A-40-2的堿性淀粉酶。2007年Saxena等人篩選到一株可以產(chǎn)堿性淀粉酶的菌株。2010年P(guān)ancha等人篩選出一株產(chǎn)耐溫淀粉酶菌株。四川大學(xué)盧濤等人從西藏當(dāng)雄八宿溫泉土壤中篩選出一株分泌高溫淀粉酶的高產(chǎn)突變菌株，為地衣芽孢桿菌，該菌生長(zhǎng)的地理環(huán)境獨(dú)特，其高溫特性良好，經(jīng)改造得到了一種PH活性域較寬、熱穩(wěn)定性較高的淀粉酶。目前，國內(nèi)的前處理酶制劑市場(chǎng)基本被丹麥諾維信公司和美國杰能科公司所壟斷。 諾維信公司介紹了一種堿性淀粉酶，有較寬的PH及溫度范圍。目前國內(nèi)外工業(yè)化的堿性淀粉酶幾乎沒有，因此篩選產(chǎn)堿性淀粉酶的優(yōu)良菌株非常有必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種嗜堿芽孢桿菌JN21 (.Bacillusalcalophilus JN21)，已于 2011 年7月1日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO =M 2011229，地址中國武漢、武漢大學(xué)；其16SrDNA序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO: 1所示，以其16SrDNA全序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹如說明書附圖2所示。本發(fā)明還提供了一種堿性淀粉酶，來源于嗜堿芽孢桿菌JN21，CCTCC NO =M 2011229，其最適反應(yīng)pH為10. 5。所述產(chǎn)堿性淀粉酶的嗜堿芽孢桿菌是從堿性土壤中篩選，其保藏條件如下從生長(zhǎng)良好的平板上接取3環(huán)嗜堿芽孢桿菌到搖瓶培養(yǎng)基中，30°C搖床(200 rpm)培養(yǎng)36 h，取 0. 65 mL移入含有0. 3 mL無菌甘油的甘油管中，放入_70°C超低溫冰箱保存。所述固態(tài)平板培養(yǎng)基為1. 0%玉米淀粉，0. 5%酵母粉，1. 5%蛋白胨，0. 5% NaCl, 0. 05% KH2PO4, 2% 瓊脂粉，滅菌后，用 Na2CO3 調(diào) pH 9.5-10.5。所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基為1. 5%可溶性淀粉，1.0%酵母粉，1.0%蛋白胨，0.5% NaCl, 0. 05% KH2PO4,滅菌后，用 Na2CO3 調(diào) pH 9. 5-10. 5。所述嗜堿芽孢桿菌的培養(yǎng)條件為將已保藏甘油管的嗜堿芽孢桿菌接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C，200 rpm，搖床培養(yǎng)36 h。將產(chǎn)堿性淀粉酶的嗜堿芽孢桿菌發(fā)酵后的發(fā)酵液，10000 rpm離心10 min，在pH 10. 0條件下，采用DNS法測(cè)定離心后發(fā)酵上清液的堿性淀粉酶酶的酶活。在堿性條件下， 酶活明顯。在不同堿性PH值下，測(cè)定堿性淀粉酶的最適反應(yīng)pH，堿性淀粉酶的最適反應(yīng)pH 為10. 5，在堿性環(huán)境下，可以高效降解淀粉。
本發(fā)明自堿性土壤中篩選出一株產(chǎn)堿性淀粉酶的嗜堿芽孢桿菌JN21 (.Bacillusalcalophilus JN21 )，該菌株可生產(chǎn)耐強(qiáng)堿的堿性淀粉酶，該堿性淀粉酶可以在強(qiáng)堿的環(huán)境下高效降解淀粉。將菌株生產(chǎn)的堿性淀粉酶應(yīng)用于紡織退漿、洗滌劑添加、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域，可以在堿性環(huán)境下高效降解淀粉，達(dá)到所需的目的。


圖1 采用含有玉米淀粉的固體培養(yǎng)基平板篩選產(chǎn)堿性淀粉酶的嗜堿芽孢桿菌； 圖2 嗜堿芽孢桿菌U^a/iMHic bacillus sp. ) JN21的系統(tǒng)發(fā)育樹；
圖3 嗜堿芽孢桿菌產(chǎn)生的堿性淀粉酶的最適反應(yīng)Ph; 圖4 嗜堿芽孢桿菌產(chǎn)生的堿性淀粉酶的最適穩(wěn)定pH。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 產(chǎn)堿性淀粉酶的嗜堿芽孢桿菌篩選方法
取采取的一定量堿性土壤，放入裝有100 mL無菌水及玻璃珠的250mL三角瓶中，振蕩，稀釋不同濃度梯度，將不同濃度梯度稀釋好的樣品分別涂布到含有玉米淀粉的PH值為 10.0的固體培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)36 h。反復(fù)進(jìn)行平板劃線分離，重復(fù)三次得到純化的單菌落，供下一步鑒定用。鑒定主要通過1)菌落特征觀察在含有玉米淀粉的固體培養(yǎng)基平板上，用肉眼直接觀察，在菌落周圍有淀粉降解透明圈的菌株(見附圖1所示)。2)個(gè)體形態(tài)觀察用光學(xué)顯微鏡染色觀察，挑起有芽孢的菌株。將滿足鑒定條件的菌株挑出甘油管保藏。以3%接種量取-70°C甘油管保藏液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C，200rpm搖瓶培養(yǎng)。取30°C搖床培養(yǎng)的36 h的發(fā)酵液，10000 rpm，4°C離心10 min。離心結(jié)束后，取上清液，采用DNS法，在堿性條件下測(cè)定堿性淀粉酶的酶活。通過利用DNS法對(duì)堿性淀粉酶進(jìn)行測(cè)定，篩選出一株具有較強(qiáng)耐堿能力且在堿性環(huán)境下可高效降解淀粉的菌株，所產(chǎn)堿性淀粉酶酶活為509. 3 U/mL，通過16SrDNA鑒定， 序列分析(見核苷酸序列表中SEQ ID NO: 1所示)可知該菌株為嗜堿芽孢桿菌，已于2011年 7月1日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO =M 2011229，地址中國武漢、武漢大學(xué)；分類學(xué)命名嗜堿芽孢桿菌JN21 (Mcillusalcalophilus JN21)。實(shí)施例2 嗜堿芽孢桿菌產(chǎn)堿性淀粉酶最適反應(yīng)pH的測(cè)定 DNS法測(cè)定堿性淀粉酶酶活
1)DNS試劑的配置稱取2. 5 g 3，5-二硝基水楊酸溶于少量水中，加入0.5 g苯酚，再溶解0.075 g亞硫酸鈉、2. 5 g氫氧化鈉、50 g酒石酸鉀鈉，將其轉(zhuǎn)入500 mL容量瓶中搖勻定容，儲(chǔ)存于棕色瓶放置在4°C冰箱中待用。2)麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作配制0.2 g/L - 1.0 g/L不同濃度的麥芽糖溶液。取 1 mL不同濃度的麥芽糖與同體積的DNS溶液混合，放入沸水浴中，水浴10 min.用冷水冷卻，定容至10 mL，A54tl測(cè)定吸光值。以麥芽糖的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。3)將2 mL 1%的可溶性淀粉加入到試管中，加入1 mL的緩沖液，混勻，55°C預(yù)熱5 min，加入0.4 mL稀釋好的酶液，反應(yīng)5 min。取1 ml反應(yīng)液與同體積的DNS試劑混勻，沸水浴煮沸10 min，用冷水冷卻，定容至10 ml，混勻后，以沒有加酶液但加入當(dāng)量的去離子水的反應(yīng)體系作為對(duì)照，測(cè)定A54tl吸光值。堿性淀粉酶最適反應(yīng)pH值的測(cè)定
采用甘氨酸_氫氧化鈉緩沖液，配制不同PH的緩沖液(8. 0,8. 5,9. 0,9. 5，10. 0，10. 5， 11.0)，將緩沖液與可溶性淀粉混勻，采用3)的方法測(cè)定堿性淀粉酶最適反應(yīng)pH (見圖3)。 該堿性淀粉酶的最適反應(yīng)PH為10. 5，在堿性環(huán)境下可以高效降解淀粉，為堿性淀粉酶。
實(shí)施例3 嗜堿芽孢桿菌產(chǎn)堿性淀粉酶最適穩(wěn)定pH的測(cè)定
采用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，配置不同梯度PH緩沖液(7.0，7.5，8.0，8.5，9.0， 9.5，10.0，10.5，11.0)。分別將相同濃度酶液(500 U/mL)與不同pH的緩沖液在試管中混合，在25°C水浴鍋內(nèi)保溫24 h，分別在不同pH下采用實(shí)施例2中3)測(cè)定堿性淀粉酶的方法，測(cè)定殘?zhí)敲富畹牧?。以酶活初始值為基礎(chǔ)，將所有酶活除以初始值，乘以100%，得到堿性淀粉酶酶活力隨著不同PH的變化，活力殘留的情況。結(jié)果顯示，在PH值為7. 5-10. 5的范圍內(nèi)，堿性淀粉酶穩(wěn)定(見圖4)，充分說明該淀粉酶為耐堿性淀粉酶。
可 以理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附的權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種嗜堿芽孢桿菌，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 2011229。
2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的嗜堿芽孢桿菌，其特征在于，該菌生產(chǎn)的淀粉酶在PH為 8. 0-11.0的條件下使用。
3.權(quán)利要求1所述嗜堿芽孢桿菌生產(chǎn)的淀粉酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的淀粉酶，其特征在于，該酶的最適反應(yīng)PH為10.5，在pH為 8. 0-11.0的條件下使用。
5.權(quán)利要求1所述的嗜堿芽孢桿菌用于生產(chǎn)淀粉酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基為1.5%可溶性淀粉，1.0% 酵母粉，1. 0% 蛋白胨，0. 5% NaCl, 0. 05% KH2PO4,滅菌后，用 Na2CO3 調(diào) pH 9. 5-10. 5。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的淀粉酶在紡織退漿、洗滌劑、化工、食品領(lǐng)域的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株產(chǎn)堿性淀粉酶的嗜堿芽孢桿菌JN21(BacillusalcalophilusJN21)，保藏編號(hào)CCTCC NOM2011229。該菌株生產(chǎn)的堿性淀粉酶具有較高的耐堿性，適用的pH值范圍較寬，可以在堿性條件下，高效降解淀粉。該菌株生產(chǎn)的堿性淀粉酶主要用于紡織退漿、洗滌劑添加劑、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102311934SQ201110247289
公開日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2011年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月24日
發(fā)明者劉龍, 堵國成, 李江華, 楊海泉, 陳堅(jiān) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)