專利名稱：一種輔助鑒定早熟禾屬植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種輔助鑒定早熟禾屬植物的方法。
背景技術(shù)：
草坪草是一種城市綠化植物，也廣泛應(yīng)用于體育場(chǎng)地、高速公路及河岸提坡防護(hù)、消除污染等方面，體現(xiàn)了巨大的生態(tài)效益。草坪草種類繁多，生長(zhǎng)環(huán)境迥異，按氣候條件分類可分為暖季型草坪草和冷季型草坪草，按不同科屬分類可分為禾本科虎尾草亞科 Poaceae (Gramineae) (7 個(gè)屬)、黍亞科 Panicoideae (6 個(gè)屬)、早熟禾亞科 Pooideae (12 個(gè)屬)，以及莎草科Cyeraceae O個(gè)屬)和豆科及旋花科的一些品種等。早熟禾屬(Poa L)植物為禾本科早熟禾亞科多年生草本，喜光、耐陰性差、具有很強(qiáng)的耐寒能力、抗旱性差，夏季炎熱時(shí)生長(zhǎng)停滯、春秋季生長(zhǎng)繁茂，喜冷涼濕潤(rùn)的環(huán)境，根莖繁殖力強(qiáng)、再生性好、形成草皮的能力極強(qiáng)、耐踐踏、綠期長(zhǎng)。早熟禾屬(Poa L)植物是北方建植各類綠地的主要草種，也是建植運(yùn)動(dòng)場(chǎng)草坪的主要草種。在草坪草雜交育種工作中，為了提高雜交育種的效率和成功率，需要選用親緣關(guān)系較近且品質(zhì)優(yōu)良的兩個(gè)品種進(jìn)行雜交。因此雜交育種的前期工作，就是要明確每個(gè)品種的親緣關(guān)聯(lián)、隸屬關(guān)系等。長(zhǎng)期以來，生物學(xué)家主要通過形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)證據(jù)劃分不同的物種，但這些表型特征種類有限，且容易受到環(huán)境因素和發(fā)育階段的影響，加之自然選擇導(dǎo)致的普遍趨同效應(yīng)和平行進(jìn)化因素等，使得物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的判斷困難重重。草坪草基因組復(fù)雜，長(zhǎng)期自然或人工選擇的結(jié)果，產(chǎn)生了各種各樣的草坪草種類，包括各種各樣的生態(tài)類型、豐富多彩的野生資源等。如果不能高效準(zhǔn)確的鑒別草坪草不同的基因型，確認(rèn)它們之間的親緣關(guān)系，雜交育種的親本選擇就存在一定的盲目性，多樣化草坪草基因資源的利用就會(huì)受到極大的限制。基因作為遺傳信息的載體，保留了很多進(jìn)化的痕跡，同一基因在不同物種中的序列差異可以作為分類鑒定的分子標(biāo)記，具有信息量大、能夠穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定早熟禾屬植物的方法。本發(fā)明提供了輔助鑒定早熟禾屬(Poa L)植物的引物對(duì)，由序列表的序列1所示 DNA(DNA區(qū)段)和序列表的序列2所示(DNA區(qū)段)區(qū)段組成。所述早熟禾屬植物具體可為Nuglade(中文名稱為新哥求德，英文名稱為 NuGlade)、America (中文名稱為美洲王，英文名稱為America)、Award (中文名稱為獎(jiǎng)品，英文名稱為award)、Youmei (中文名稱為優(yōu)美，英文名稱為Euromyth)、Carbenet、 Freedom3(中文名稱為自由3，英文名稱為Freedom 3)、Dayue jin (中文名稱為大躍進(jìn)，英文名稱為Quantum Leap)或Siufeng(中文名稱為珠峰，英文名稱為Everest)。所述引物對(duì)可用于制備輔助鑒定早熟禾屬植物的試劑盒。所述早熟禾屬植物具體可為Nuglade(中文名稱為新哥求德，英文名稱為NuGlade)、America (中文名稱為美洲王，英文名稱為America)、Award (中文名稱為獎(jiǎng)品，英文名稱為award)、Youmei (中文名稱為優(yōu)美，英文名稱為Euromyth)、Carbenet、 Freedom3(中文名稱為自由3，英文名稱為Freedom 3)、Dayuejin (中文名稱為大躍進(jìn)，英文名稱為Quantum Leap)或Zhufeng (中文名稱為珠峰，英文名稱為Everest)。
所述弓ι物對(duì)可用于輔助鑒定早熟禾屬植物。所述早熟禾屬植物具體可為Nuglade(中文名稱為新哥求德，英文名稱為 NuGlade)、America (中文名稱為美洲王，英文名稱為America)、Award (中文名稱為獎(jiǎng)品，英文名稱為award)、Youmei (中文名稱為優(yōu)美，英文名稱為Euromyth)、Carbenet、 Freedom3(中文名稱為自由3，英文名稱為Freedom 3)、Dayuejin (中文名稱為大躍進(jìn)，英文名稱為Quantum Leap)或Siufeng (中文名稱為珠峰，英文名稱為Everest)。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定早熟禾屬植物的方法，包括如下步驟以待測(cè)植物的基因組DNA為模板，用所述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物待測(cè)植物為候選的早熟禾屬植物，如果沒有得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物待測(cè)植物為候選的非早熟禾屬植物。所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具體可為180bp。所述待測(cè)植物具體可為剪股穎屬(Agrostis)植物、早熟禾屬(Poa)植物、羊茅屬 (Festuca)植物、結(jié)縷草屬(Zoysia)植物、黑麥草屬(Lolium)植物或狗牙根屬(Cynodon) 植物。所述剪股穎屬植物具體可為A4(中英文名稱均為PennA4)、Century、Putter、 hcbpendence、Declaration、L93、Shark、NTAS、FTAS 或 Backspin。所述早熟禾屬植物具體可為Nuglade (中文名稱為新哥求德，英文名稱為NuGlade)、America (中文名稱為美洲王， 英文名稱為America)、Award (中文名稱為獎(jiǎng)品，英文名稱為award) Joumei (中文名稱為優(yōu)美,英文名稱為Euromyth)、Carbenet, Freedom3 (中文名稱為自由3，英文名稱為Freedom 3) ,Dayuejin (中文名稱為大躍進(jìn)，英文名稱為Quantum Leap)或Siufeng (中文名稱為珠峰，英文名稱為Everest)。所述羊茅屬植物具體可為PicasscKQiangjin (中文名稱為強(qiáng)勁， 英文名稱為hferno)、Dynasty (中文名稱為王朝，英文名稱為Dyansty)、Starlet (中文名稱為新秀，英文名稱為Marlet)、Day (中文名稱為帝王，英文名稱為Diva)、Arid3 (中文名稱為愛瑞3，英文名稱為Arid 3)或Hoimdog (中文名稱為獵狗5，英文名稱為Hoimdog 5)。 所述結(jié)縷草屬植物具體可為結(jié)縷草(英文名稱為L(zhǎng)awngrass)或青島結(jié)縷草(英文名稱為 Qingdao Lawngrass)。所述黑麥草屬植物具體可為L(zhǎng)eishenIV(中文名稱為雷神4號(hào)，英文名稱為Blazer 4) ,Cutter或Qi jian。所述狗牙根屬植物具體可為狗牙根不脫殼包衣(中文名稱為狗亞根(不脫殼，包衣)，英文名稱為Common Burmudagrass)或狗牙根脫殼(中文名稱為狗亞根(脫殼)，英文名稱為Unhulled Burmudagrass)。本發(fā)明還保護(hù)輔助鑒定早熟禾屬植物的試劑盒，包括引物對(duì)甲；所述引物對(duì)甲由序列表的序列1所示DNA (DNA區(qū)段)和序列表的序列2所示DNA (DNA區(qū)段)組成。所述試劑盒還可包括引物對(duì)乙；所述引物對(duì)乙由序列表的序列3所示DNA (DNA區(qū)段)和序列表的序列4所示DNA(DNA區(qū)段)組成。所述試劑盒可用于輔助鑒定早熟禾屬植物。所述早熟禾屬植物具體可為Nuglade(中文名稱為新哥求德，英文名稱為 NuGlade)、America (中文名稱為美洲王，英文名稱為America)、Award (中文名稱為獎(jiǎng)品，英文名稱為award)、Youmei (中文名稱為優(yōu)美，英文名稱為Euromyth)、Carbenet、 Freedom3(中文名稱為自由3，英文名稱為Freedom 3)、Dayue jin (中文名稱為大躍進(jìn)，英文名稱為Quantum Leap)或Siufeng(中文名稱為珠峰，英文名稱為Everest)。本發(fā)明還保護(hù)輔助鑒定早熟禾屬植物的方法，包括如下步驟以待測(cè)植物的基因組DNA為模板，分別用所述引物對(duì)甲和所述引物對(duì)乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果用所述引物對(duì)甲能得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物且用所述引物對(duì)乙能得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測(cè)植物為候選的早熟禾屬植物；如果用所述引物對(duì)甲不能得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物且用所述引物對(duì)乙能得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測(cè)植物為候選的非早熟禾屬植物。用所述引物對(duì)甲得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具體可為180bp (180bp左右)。用所述引物對(duì)乙得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具體可為221bp (221bp左右)。所述待測(cè)植物具體可為剪股穎屬(Agrostis)植物、早熟禾屬(Poa)植物、羊茅屬 (Festuca)植物、結(jié)縷草屬(Zoysia)植物、黑麥草屬(Lolium)植物或狗牙根屬(Cynodon) 植物。所述剪股穎屬植物具體可為A4(中英文名稱均為PennA4)、Century、Putter、 hcbpendence、Declaration、L93、Shark、NTAS、FTAS 或 Backspin。所述早熟禾屬植物具體可為Nuglade (中文名稱為新哥求德，英文名稱為NuGlade)、America (中文名稱為美洲王， 英文名稱為America)、Award (中文名稱為獎(jiǎng)品，英文名稱為award) Joumei (中文名稱為優(yōu)美,英文名稱為Euromyth)、Carbenet, Freedom3 (中文名稱為自由3，英文名稱為Freedom 3) ,Dayuejin (中文名稱為大躍進(jìn)，英文名稱為Quantum Leap)或Siufeng (中文名稱為珠峰，英文名稱為Everest)。所述羊茅屬植物具體可為PicasscKQiangjin (中文名稱為強(qiáng)勁， 英文名稱為hferno)、Dynasty (中文名稱為王朝，英文名稱為Dyansty)、Starlet (中文名稱為新秀，英文名稱為Marlet)、Day (中文名稱為帝王，英文名稱為Diva)、Arid3 (中文名稱為愛瑞3，英文名稱為Arid 3)或Hoimdog (中文名稱為獵狗5，英文名稱為Hoimdog 5)。 所述結(jié)縷草屬植物具體可為結(jié)縷草(英文名稱為L(zhǎng)awngrass)或青島結(jié)縷草(英文名稱為 Qingdao Lawngrass)。所述黑麥草屬植物具體可為L(zhǎng)eishenIV(中文名稱為雷神4號(hào)，英文名稱為Blazer 4)、Cutter或Qi jian。所述狗牙根屬植物具體可為狗牙根不脫殼包衣(中文名稱為狗亞根(不脫殼，包衣)，英文名稱為Common Burmudagrass)或狗牙根脫殼(中文名稱為狗亞根(脫殼)，英文名稱為Unhulled Burmudagrass)。本發(fā)明通過對(duì)不同草坪草種屬品種抗逆性基因AsEXPl的克隆，分析其序列位點(diǎn)差異，了解該基因在不同種屬間的變異規(guī)律，并通過種屬間序列特征分析，篩選得到了早熟禾屬草坪草特異性的分子標(biāo)記，以及用于鑒定所述分子標(biāo)記的特異引物對(duì)。本發(fā)明提供的特異引物對(duì)(CAs4F/CAs4R)可以輔助鑒定早熟禾屬(Poa)植物，可以用于草坪草種屬品種的鑒定、親緣關(guān)系分析及進(jìn)化路徑分析等，并為草坪草的分子標(biāo)記輔助育種和品種遺傳改良工作提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。


圖1為利用cAslF/cAslR對(duì)不同草坪草品種基因組DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道1_6 依次為 A4、Century、Carbenet、Award、Starlet、Arid3 ；Μ, DL2000 ladder。圖2為基于AsEXPl基因片段序列多態(tài)性建立的草坪草不同種屬間系統(tǒng)進(jìn)化樹。
圖3為3個(gè)屬6個(gè)草坪草品種AsEXPl基因片段序列比對(duì)結(jié)果。圖4為2種引物組合對(duì)草坪草3個(gè)屬6個(gè)品種的PCR擴(kuò)增結(jié)果；A 采用cAs4F和 cAs4R組成的引物對(duì)；B 采用cAs2F和cAs2R組成的引物對(duì)；泳道1_6依次為草坪草品種 A4、Century>Carbenent>Award>Starlet、Arid3。圖5為2種引物組合對(duì)草坪草6個(gè)屬32個(gè)品種的PCR擴(kuò)增結(jié)果；A 采用cAs4F和 cAs4R組成的引物對(duì)；B 采用cAs2F和cAs2R組成的引物對(duì)；1 :A4 ；2 =Century ；3 =Putter ； 4 Independence ；5 !Declaration ；6 :Nuglade ；7 America ；8 Award ；9 Youmei ； 10 結(jié)縷草；11 =Picasso ；12 =Qiangjin ；13 =Dynasty ；14 =Starlet ；15 =Day ；16 狗牙根不脫殼包衣；17 :L93 ；18 =Shark ；19 =NTAS ；20 =FTAS ；21 =Backspin ；22 =Carbenet ；23 :Freedom3 ； 24 =Dayuejin ；25 =Zhufeng ；26 青島結(jié)縷草；27 :Arid3 ；28 =Houndog ；29 =LeishenIV ；30 Cutter ；31 =Qijian ；32 狗牙根脫殼。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例1、草坪草種屬特異性分子標(biāo)記的篩選和特異引物對(duì)的設(shè)計(jì)一、AsEXPl基因片段克隆及序列分析從草坪草剪股穎屬、早熟禾屬、羊茅屬中隨機(jī)選取各2個(gè)品種(A4、CentrUy為剪股穎屬，Carbenet, Award為早熟禾屬，Marlet、Arid3為羊茅屬)，以基因組DNA為模板，用 cAslF和cAslR組成的引物對(duì)進(jìn)行AsEXPl基因的同源片段擴(kuò)增。見圖1。結(jié)果顯示，所有檢測(cè)品種在460bp左右均有一特異性條帶，不同品種草坪草的同源片段大小相近，在1. 5% 的瓊脂膠上無(wú)法分辨。二、AsEXPl基因片段的同源性比較分析將上述擴(kuò)增的條帶切割、回收并克隆，測(cè)序后去除內(nèi)含子部分并進(jìn)行序列比對(duì)。圖 3為多重序列比對(duì)結(jié)果(所注堿基位置均以統(tǒng)一序列為準(zhǔn))，可以看出不同品種間序列呈現(xiàn)多態(tài)性，并顯示出很好的屬間特異性。其中，剪股穎屬的2個(gè)品種AsEXPl基因同源片段長(zhǎng)度為368bp，早熟禾屬為359bp，羊茅屬為371bp。與剪股穎屬相比，早熟禾兩個(gè)品種在261 到270bp處有9bp的缺失，羊茅屬兩品種在40到43bp處有一個(gè)!3bp的插入。在核苷酸替換方面，剪股穎屬的兩個(gè)品種在30bp和31bp處為GG，而其它2個(gè)屬的品種為CT ；在240bp 處，剪股穎屬為G，其他屬為C ；早熟禾在116、117、119bp處分別為G、T、G，而另外2個(gè)屬的品種皆為A、G、C ；在處，早熟禾屬品種堿基分別為G、T、C，而其他屬品種堿基為C、Gλ G0表1為同源性比對(duì)結(jié)果，同屬內(nèi)不同品種間同源性很高，同為剪股穎屬的Α4和 Century的同源性為99. 46%，同為早熟禾屬的Carbenet和Award為99. 72%，同為羊茅屬的Marlet和和Arid3的同源性為97. 04%；不同屬的品種間的差異相對(duì)較大，如Carbenet 和Century同源性僅為91. 92%。表1 不同品種間AsEXPl基因片段序列兩兩同源率比較結(jié)果(DNAMAN比對(duì)結(jié)果)
品種A4CenturyCarbenetAwardStarletCentury99. 46%Carbenet91. 92%91. 92%Award92. 20%92. 20%99. 72%Starlet93. 21%93. 21%93. 59%93. 31%Arid393. 75%93. 21%93. 31%93. 04%97. 04%圖2為進(jìn)化樹分析結(jié)果，同屬的兩個(gè)品種均聚在一個(gè)分支上，3個(gè)屬分屬兩個(gè)大的分支，其中早熟禾屬單獨(dú)一個(gè)分支，剪股穎屬和羊茅屬隸屬同一分支，顯示這兩個(gè)屬具有較近的親緣關(guān)系。三、草坪草種屬特異性分子標(biāo)記的篩選上述分析結(jié)果顯示，AsEXPl基因片段在不同草坪草中呈現(xiàn)DNA序列的種屬特異性。設(shè)計(jì)cAs4F和cAs4R組成的特異性引物，設(shè)計(jì)cAs2F和cAs2R組成的保守引物。cAs4F(上游引物)5，-GCCACGTTCTACGGCGGTGG-3，(序列表的序列 1)；cAs4R(下游引物)5，-CGGCACGCAGTAGCTCCCCT-3，(序列表的序列 2)。cAs4F和cAs4R的靶序列為序列表的序列5自5，末端第97-276位核苷酸，180bp。cAs2F(上游引物)5，-CGACGCGTCCGGCACAATGG-3，(序列表的序列 3)；cAs2R(下游引物):5，-CGTCGTTGGGCAGCGCGTAG-3，(序列表的序列 4)。cAs2F和cAs2R的靶序列為序列表的序列5自5’末端第117-337位核苷酸，221bp。用cAs4F和cAs4R組成的引物對(duì)對(duì)6個(gè)品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，只在早熟禾屬中有特異性擴(kuò)增，在其他2個(gè)屬中均無(wú)條帶。用cAs2F和cAs2R組成的引物對(duì)對(duì)6個(gè)品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，在所有6個(gè)品種中均有條帶顯示(圖4)。實(shí)施例2、特異引物對(duì)的應(yīng)用(草坪草種屬特異分子標(biāo)記的驗(yàn)證)實(shí)驗(yàn)樣本如下剪股穎屬(10個(gè)品種):A4(中英文名稱均為 PennA4)參考文獻(xiàn)Journal of Experimental Botany ； 2007,58(13) :3789-3796。Century 參考文獻(xiàn)Journal of Experimental Botany ；2007,58 (13) 3789-3796。Putter 參考文獻(xiàn) Journal of Experimental Botany ；2007, 58 (13) :3789_3796。Independence 參考文獻(xiàn)Journal of Experimental Botany ；2007, 58 (13) 3789-3796。Declaration 參考文 Journal of Experimental Botany ；2007,58(13) 3789-3796。L93 參考文獻(xiàn)Journal of Experimental Botany ；2007, 58 (13) :3789_3796。
Shark 參考文獻(xiàn)Journal of Experimental Botany ；2007, 58 (13) :3789_3796。NTAS 參考文獻(xiàn)Journal of Experimental Botany ；2007, 58 (13) :3789_3796。FTAS 參考文獻(xiàn)Journal of Experimental Botany ；2007, 58 (13) :3789_3796。Backspin 參考文 Journal of Experimental Botany ；2007,58 (13) 3789-3796。早熟禾屬(8個(gè)品種)Nuglade (中文名稱為新哥求德，英文名稱為NuGlade)購(gòu)自中種公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 70-76-0;3B。America(中文名稱為美洲王，英文名稱為America)購(gòu)自中種公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 69-19-03。Award(中文名稱為獎(jiǎng)品，英文名稱為award)購(gòu)自中種公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 70-557-00A。^umei (中文名稱為優(yōu)美，英文名稱為Euromyth)購(gòu)自中種公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 70-557-00A。Carbenet 購(gòu)自北京北方杰士生物科技有限責(zé)任公司。Freedom3(中文名稱為自由3，英文名稱為Freedom 3)購(gòu)自中種公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 70-94-04B。Dayuejin (中文名稱為大躍進(jìn)，英文名稱為Quantum Leap)購(gòu)自中種公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為68-441-00。amfeng(中文名稱為珠峰，英文名稱為Everest)購(gòu)自中種公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 70-88-03。羊茅屬(7個(gè)品種)Picasso 購(gòu)自北京北方杰士生物科技有限責(zé)任公司。Qiangjin (中文名稱為強(qiáng)勁，英文名稱為hferno)購(gòu)自中種公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 B18-5-30TF。Dynasty (中文名稱為王朝，英文名稱為Dyansty)購(gòu)自中種公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 LA18-5-57。Marlet (中文名稱為新秀，英文名稱為Marlet)購(gòu)自中種公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 L5-5-TF46。Day(中文名稱為帝王，英文名稱為Diva)購(gòu)自中種公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 M146-GBS-BD5-453-3。Arid3(中文名稱為愛瑞3，英文名稱為Arid 3)購(gòu)自北京北方杰士生物科技有限
責(zé)任公司。Houndog(中文名稱為獵狗5，英文名稱為Houndog 5)購(gòu)自中種公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 Y41-6-HD5-41-1。結(jié)縷草屬O個(gè)品種)結(jié)縷草(英文名稱為L(zhǎng)awngrass)購(gòu)自中種公司。青島結(jié)縷草(英文名稱為Qingdao Lawngrass)購(gòu)自中種公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 L30-5-7。
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黑麥草屬(3個(gè)品種)LeishenIV(中文名稱為雷神4號(hào)，英文名稱為Blazer 4)購(gòu)自中種公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為Y21-5-70。Cutter 購(gòu)自北京北方杰士生物科技有限責(zé)任公司。Qijian(中文名稱為旗艦，英文名稱為Flagship)購(gòu)自中種公司。狗牙根屬O個(gè)品種)狗牙根不脫殼包衣(中文名稱為狗亞根(不脫殼，包衣)，英文名稱為Common Burmudagrass)購(gòu)自中種公司。狗牙根脫殼(中文名稱為狗亞根(脫殼)，英文名稱為Unhulled Burmudagrass) 購(gòu)自中種公司。分別提取各個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本的葉片的基因組DNA，將每個(gè)樣本的基因組DNA分別用引物對(duì)甲(cAs4F和cAs4R組成的引物對(duì))和引物對(duì)乙(cAs2F和cAs2R組成的引物對(duì))進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，用引物對(duì)甲PCR擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物命名為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物甲，用引物對(duì)乙PCR 擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物命名為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物乙。PCR 擴(kuò)增體系 QO 微升)10XPCR buffer 2 μ l,5mmol/L dNTPs 1 μ 1, Mg2+I μ 1, 5口11101/1上游引物和5“11101/1下游引物各1μ l,40ng/y 1基因組DNA 1μ 1， υ/μ 1高保真 DNA 聚合酶 0. 5μ 1，ddH20 12. 5μ1。PCR擴(kuò)增參數(shù)為95°C預(yù)變性IOmin ；95°C變性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸 lmin，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0將各個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物甲和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物乙進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，cAs4F和cAs4R組成的特異性引物只在早熟禾屬品種(8個(gè)品種)中有擴(kuò)增條帶，而其他5個(gè)屬的品種中均不見明顯條帶，而cAs2F和cAs2R組成的保守引物在6 個(gè)屬的32個(gè)品種均有擴(kuò)增。
權(quán)利要求
1.輔助鑒定早熟禾屬植物的引物對(duì)，由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成。
2.權(quán)利要求1所述引物對(duì)在制備輔助鑒定早熟禾屬植物的試劑盒中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述引物對(duì)在輔助鑒定早熟禾屬植物中的應(yīng)用。
4.一種輔助鑒定早熟禾屬植物的方法，包括如下步驟以待測(cè)植物的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1所述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物待測(cè)植物為候選的早熟禾屬植物，如果沒有得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物待測(cè)植物為候選的非早熟禾屬植物。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為ISObp；所述待測(cè)植物為剪股穎屬(Agrostis)植物、早熟禾屬(Poa)植物、羊茅屬O^estuca)植物、結(jié)縷草屬 (Zoysia)植物、黑麥草屬(Lolium)植物或狗牙根屬(Cynodon)植物。
6.輔助鑒定早熟禾屬植物的試劑盒，包括引物對(duì)甲；所述引物對(duì)甲由序列表的序列1 所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括引物對(duì)乙；所述引物對(duì)乙由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成。
8.權(quán)利要求6或7所述試劑盒在輔助鑒定早熟禾屬植物中的應(yīng)用。
9.一種用權(quán)利要求7所述試劑盒輔助鑒定早熟禾屬植物的方法，包括如下步驟以待測(cè)植物的基因組DNA為模板，分別用所述引物對(duì)甲和所述引物對(duì)乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果用所述引物對(duì)甲能得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物且用所述引物對(duì)乙能得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測(cè)植物為候選的早熟禾屬植物；如果用所述引物對(duì)甲不能得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物且用所述引物對(duì)乙能得到 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測(cè)植物為候選的非早熟禾屬植物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于用所述引物對(duì)甲得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為ISObp ；用所述引物對(duì)乙得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為221bp ；所述待測(cè)植物為剪股穎屬 (Agrostis)植物、早熟禾屬(Poa)植物、羊茅屬O^estuca)植物、結(jié)縷草屬(Zoysia)植物、 黑麥草屬(Lolium)植物或狗牙根屬(Cynodon)植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輔助鑒定早熟禾屬植物的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟以待測(cè)植物的基因DNA為模板，用序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待測(cè)植物為早熟禾屬植物。本發(fā)明通過對(duì)不同草坪草種屬品種抗逆性基因AsEXP1的克隆，分析其序列位點(diǎn)差異，了解該基因在不同種屬間的變異規(guī)律，并通過種屬間序列特征分析，篩選得到了早熟禾屬草坪草特異性分子標(biāo)記。本發(fā)明提供的特異引物對(duì)(cAs4F/cAs4R)可以輔助鑒定早熟禾屬品種，可以用于草坪草種屬品種的鑒定、親緣關(guān)系分析及進(jìn)化路徑分析等，并為草坪草的分子標(biāo)記輔助育種和品種遺傳改良工作提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102304577SQ201110248309
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月26日
發(fā)明者代亮, 徐倩, 徐吉臣, 徐筱 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)