專利名稱：一種以大孔陰離子樹脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法
技術領域：
本發(fā)明屬于蛋白分離純化技術領域，尤其是一種以大孔陰離子樹脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法。
背景技術：
隨著人們對保健食品和低熱量食品需求的增加，自20世紀80年代以來出現(xiàn)了一系列所謂的替代甜味劑，包括異麥芽低聚糖、大豆低聚糖、帕拉金糖和低聚果糖在內(nèi)的低聚糖是其中很重要的一類，其重要性在于它們具有難消化、低熱量、降血脂、增殖雙歧桿菌、抗齲齒及美容等獨特的生理功能。低聚果糖(Fructooligosaccharides，簡稱F0S)，又稱寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，分子式為G-F-Fn，n = 1 3(G為葡萄糖，F(xiàn)為果糖)。低聚果糖是蔗糖分子的果糖殘基上通β -2-1糖苷鍵連接1 3個果糖基而形成的果糖寡聚體蔗果三糖(1-kestose，GF2)、 蔗果四糖(nystose，GF3)、蔗果五糖(lF-fructofuranosyl nystose，GF4)及其混合物。它一般是利用微生物或植物中具有果糖轉(zhuǎn)移活性的酶作用于蔗糖而得的。目前低聚果糖的工業(yè)生產(chǎn)主要是通過發(fā)酵產(chǎn)生的果糖基轉(zhuǎn)移酶 (fructosyltransferase)催化而得到的。由于發(fā)酵得到的果糖基轉(zhuǎn)移酶經(jīng)過破壁后的酶液含有較多的其它成分，影響果糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性和穩(wěn)定性，因而果糖基轉(zhuǎn)移酶的純化具有重要的現(xiàn)實和實踐意義，楊光禮研究員(2002年)和魏遠安教授(2008年)報告的果糖基轉(zhuǎn)移酶的純化都是用葡聚糖等實驗性填充料，生產(chǎn)成本高，工業(yè)生產(chǎn)推廣較困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足之處，提供一種以大孔陰離子樹脂為填充料來進行果糖基轉(zhuǎn)移酶的初步分離的方法。本方法過程簡單，所得到的初步純化的果糖基轉(zhuǎn)移酶具有生產(chǎn)成本低，酶活回收率高，去除的雜蛋白較多，具有廣泛的工業(yè)用途。本發(fā)明實現(xiàn)目的的技術方案如下—種以大孔陰離子樹脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法，其特征在于將經(jīng)預處理大孔陰離子樹脂裝層析柱，用20mmol/mL的pH值為6. 5磷酸緩沖液以2. OmL/min 的流速通過層析柱，平衡層析柱，將含有果糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶液上樣，用兩倍體積的磷酸緩沖液洗脫，再用兩倍體積的磷酸緩沖液配置的Imol/mL的NaCl溶液Ο-lmol/mL梯度洗脫， 用UV280nm在線監(jiān)測，收集有酶活的峰，將收集到有酶活的酶液濃縮即得果糖基轉(zhuǎn)移酶。而且，所述大孔陰離子樹脂為大孔陰離子樹脂D290。而且，所述預處理大孔陰離子樹脂的方法為大孔陰離子樹脂先用蒸餾水浸泡4h 溶脹，除雜，然后用0. lmol/L的鹽酸浸泡2h，去離子水沖洗至中性；再用0. Imol/L的氫氧化鈉浸泡2h，用去離子水沖洗至中性，用2倍體積的去離子水浸泡，放置于4°C保存?zhèn)溆?。而且，所述果糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶液的制備方法如下
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將經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體，離心洗凈，收集菌絲體，將菌絲溶于5倍體積的水，球磨機5000r/min條件下20min，球磨兩次，然后在超高壓均質(zhì)機IOOOPa破壁兩次，冷凍離心， 超濾濃縮得到粗酶液。而且，所用NaCl溶液梯度為0-lmol/mL。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果如下1、本發(fā)明利用大孔陰離子樹脂D290作為填充料分離純化果糖基轉(zhuǎn)移酶，樹脂與果糖基轉(zhuǎn)移酶之間特異吸附，有效去除的雜蛋白，果糖基轉(zhuǎn)移酶被停留在層析柱內(nèi)，經(jīng)過洗脫液洗脫后獲得純化后的果糖基轉(zhuǎn)移酶，本方法具有生產(chǎn)成本低，使用方便，效率高，酶活回收率高的特點，其具有廣泛的應用前景。2、本方法純化過程簡單，所得到的初步純化的果糖基轉(zhuǎn)移酶具有生產(chǎn)成本低，酶活回收率高，去除的雜蛋白較多，具有廣泛的工業(yè)用途。3、本發(fā)明還提供了一種游離果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，先球磨機5000r/min條件下20min，球磨兩次，然后在超高壓均質(zhì)機IOOOPa破壁兩次，胞內(nèi)酶溶出率高，回收率高。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的， 不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。以下實施例總中果糖基轉(zhuǎn)移酶來自黑曲霉發(fā)酵獲得，本方法同樣適合其他方法或者渠道得到的含有果糖基轉(zhuǎn)移酶的溶液、粗酶液或發(fā)酵液等的純化，方法原理通本方法，不再一一舉例。實施例1一種以大孔陰離子樹脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法，步驟如下(1)將黑曲霉(是否有編號)經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)獲得菌絲體，離心洗凈，收集菌絲體，菌絲體可存放于_20°C待用；(2)在菌絲中加入5倍體積的水，球磨機5000r/min條件下20min，球磨兩次，然后在超高壓均質(zhì)機IOOOPa破壁兩次，冷凍離心，超濾濃縮得到粗酶液，再冷凍干燥至粉末，放置冰箱長期保存；(3)樹脂預處理將大孔陰離子樹脂D290用去離子水浸泡4h除雜，然后再用 0. lmol/L的鹽酸浸泡2h，用去離子水沖洗至中性；再用0. lmol/L的氫氧化鈉浸泡2h，用去離子水沖洗至中性，用2倍體積的去離子水浸泡，放置于4°C保存?zhèn)溆茫?4)吸附將處理好的樹脂裝層析柱，用20mmol/mL的pH值為6. 5磷酸緩沖液 (20mmoVLNa2HPO4-NaH2PO4)以2. OmL/min的流速通過層析柱，平衡層析柱，再上樣4mL， 用兩倍體積的磷酸緩沖液洗脫，再用兩倍體積的磷酸緩沖液配置的Imol/mL的NaCl溶液 Ο-lmol/mL梯度洗脫。同時UV280nm在線監(jiān)測，收集有酶活的峰。(5)將收集到有酶活的酶液用miIlipore離心超濾管(Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units)離心 30min，超濾濃縮脫鹽。(6)測酶活測上樣樣品的酶的總酶活308U，比活力為1. 2U/mg,收集到純化后的總酶活為233. 25U，比活力為5. 3U/mg。酶活回收率為75. 7%，純化倍數(shù)為4. 4。實施例2
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一種以大孔陰離子樹脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法，步驟如下(1)將黑曲霉經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體，離心洗凈，收集菌絲體。菌絲體可存放于-20°C待用。(2)加入5倍體積的水，球磨機5000r/min條件下20min，球磨兩次。然后在超高壓均質(zhì)機1000 破壁兩次，冷凍離心，超濾濃縮得到粗酶液，再冷凍干燥至粉末，放置冰箱長期保存。(3)樹脂預處理將大孔陰離子樹脂D290用去離子水浸泡除雜，然后用0. lmol/L 的鹽酸浸泡2h，用去離子水沖洗至中性；再用0. lmol/L的氫氧化鈉浸泡2h，用去離子水沖洗至中性，用2倍體積的去離子水浸泡，放置于4°C保存?zhèn)溆茫?4)吸附將處理好的樹脂裝層析柱，用20mmol/mL的pH值為6. 5磷酸緩沖液以 2. OmL/min的流速通過層析柱，平衡層析柱，再上樣3mL，用兩倍體積的磷酸緩沖液洗脫，再用兩倍體積的磷酸緩沖液配置的Imol/mL的NaCl溶液Ο-lmol/mL梯度洗脫。同時UW80nm 在線監(jiān)測，收集有酶活的峰。(5)將收集到有酶活的酶液用miIlipore離心超濾管(Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units)離心 30min，超濾濃縮脫鹽。(6)測酶活測上樣樣品的酶的總酶活225U，比活力為1. 3U/mg,為收集到純化后的總酶活為168U，比活力為5. 6U/mg。酶活回收率為74. 7%，純化倍數(shù)為4. 3。
權利要求
1.一種以大孔陰離子樹脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法，其特征在于將經(jīng)預處理大孔陰離子樹脂裝層析柱，用20mmol/mL的pH值為6. 5磷酸緩沖液以2. OmL/min的流速通過層析柱，平衡層析柱，將含有果糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶液上樣，用兩倍體積的磷酸緩沖液洗脫，再用兩倍體積的磷酸緩沖液配置的Imol/mL的NaCl溶液梯度洗脫，用UV280nm在線監(jiān)測，收集有酶活的峰，將收集到有酶活的酶液濃縮即得果糖基轉(zhuǎn)移酶。
2.根據(jù)權利要求1所述的以大孔陰離子樹脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法， 其特征在于所述大孔陰離子樹脂為大孔陰離子樹脂D290。
3.根據(jù)權利要求1所述的以大孔陰離子樹脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法， 其特征在于所述預處理大孔陰離子樹脂的方法為大孔陰離子樹脂先用蒸餾水浸泡4h溶脹，除雜，然后用0. lmol/L的鹽酸浸泡2h，去離子水沖洗至中性；再用0. lmol/L的氫氧化鈉浸泡2h，用去離子水沖洗至中性，用2倍體積的去離子水浸泡，放置于4°C保存?zhèn)溆谩?br> 4.根據(jù)權利要求1所述的以大孔陰離子樹脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法， 其特征在于所述果糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶液的制備方法如下將經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體，離心洗凈，收集菌絲體，將菌絲溶于5倍體積的水，球磨機 5000r/min條件下20min，球磨兩次，然后在超高壓均質(zhì)機IOOOPa破壁兩次，冷凍離心，超濾濃縮得到粗酶液。
5.根據(jù)權利要求1所述的以大孔陰離子樹脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法， 其特征在于所用NaCl溶液梯度為0-lmol/mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以大孔陰離子樹脂為填充料的果糖基轉(zhuǎn)移酶的初純化方法，將經(jīng)預處理大孔陰離子樹脂裝層析柱，用磷酸緩沖液沖洗層析柱層析柱，平衡層析柱，將含有果糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶液上樣，用兩倍體積的磷酸緩沖液洗脫，再用兩倍體積的磷酸緩沖液配置的1mol/mL的NaCl溶液0-1mol/mL梯度洗脫，用UV280nm在線監(jiān)測，收集有酶活的峰，將收集到有酶活的酶液濃縮即得果糖基轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明通過先球磨再超高壓均質(zhì)的方法得到了酶活較高的酶液，再采用大孔陰離子樹脂D290為填充料對果糖基轉(zhuǎn)移酶進行初純化，得到具有一定純度的果糖基轉(zhuǎn)移酶，對于利用果糖就轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)低聚果糖具有十分重要的現(xiàn)實意義和工業(yè)價值。
文檔編號C12N9/10GK102286439SQ201110249360
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月29日 優(yōu)先權日2011年8月29日
發(fā)明者劉曉光, 劉逸寒, 李玉, 王穩(wěn)航, 荊瑋, 路福平 申請人:天津科技大學