專利名稱：一種枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)天蠶素抗菌肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域，更具體地說是關(guān)于一種枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)天蠶素抗菌肽的方法。
背景技術(shù)：
抗菌肽是一類不易導(dǎo)致微生物產(chǎn)生耐藥性的新型抗感染多肽。世界上發(fā)現(xiàn)的第一種抗菌肽是天蠶素，1980年由瑞典科學(xué)家Boman等用陰溝通桿菌及大腸桿菌誘導(dǎo)惜古比天蠶蛹分離得到具有抗菌活性的多肽物質(zhì)，定名為天蠶素(cecropin)。隨后又在其它生物體內(nèi)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種抗菌肽，如娃皮素(magainins)、蜂毒素(melittins)、防御素(defensins)等。目前世界上已知的抗菌肽共有1500多種。由于最初人們發(fā)現(xiàn)這類活性多肽對(duì)細(xì)菌具有廣譜高效殺菌活性，因而命名為抗菌肽。隨著研究工作的深入開展，發(fā)現(xiàn)某些 抗菌肽對(duì)部分真菌、原蟲、病毒及癌細(xì)胞等均具有很強(qiáng)的殺傷作用。天蠶素抗菌肽是由Cecropin A和Cecropin D設(shè)計(jì)合成的37個(gè)氨基酸殘基組成的雜合肽，不含半胱氨酸，其中N端區(qū)域具有強(qiáng)堿性，兩者之間有甘氨酸和脯氨酸形成的鉸鏈區(qū)，多數(shù)多肽的C端具酰胺化，酰胺化對(duì)其抗菌肽活性具有重要作用，天蠶素抗菌肽具有獨(dú)特的廣譜抗菌活性，體外試驗(yàn)已經(jīng)證明它能夠有效的的抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等有害菌，因此，它成為抗生素替代物的絕佳選擇之一，隨著研究工作的進(jìn)一步深入開展，發(fā)現(xiàn)某些抗菌肽會(huì)對(duì)真菌、原蟲、病毒及癌細(xì)胞等均具有很強(qiáng)的殺傷作用，并在其它領(lǐng)域也具有很好的應(yīng)用前景，天蠶素抗菌肽是生物體自身合成的一種具有殺菌活性的小分子多肽、是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種重要免疫因子，多數(shù)具有強(qiáng)堿性，熱穩(wěn)定性，對(duì)生物的天然免疫起關(guān)鍵作用，其作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，導(dǎo)致膜通透性增大，以此穿透，殺滅細(xì)菌，細(xì)菌必須改變膜的結(jié)構(gòu)，即改變相當(dāng)部分的基因才能防御天蠶素抗菌肽的進(jìn)攻，而這幾乎是不可能的，因此，天蠶素抗菌肽極大的減少了產(chǎn)生耐藥性的可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種天蠶素抗菌肽基因轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)方法。將含天蠶素抗菌肽基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到基因工程枯草芽孢桿菌中，在適宜的條件下成功表達(dá)天蠶素抗菌肽基因并分泌天蠶素抗菌肽到菌體外，方法的工藝主要包括搖瓶培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)、發(fā)酵罐發(fā)酵，具體工藝過程如下
(I)搖瓶培養(yǎng)
按照配方配制I. 5L培養(yǎng)基，平均分裝于20個(gè)IOOOml三角燒瓶中，高溫滅菌冷卻后，用試管菌種接種，接種量I :500，搖床培養(yǎng)，攪拌速度為225rpm/min，溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間12小時(shí)，檢驗(yàn)合格后得菌種，待用。培養(yǎng)基配方為
蛋白胨 15g 酵母提取物7. 5g食鹽7. 5g
用蒸懼水定容至I. 5L ；
(2)發(fā)酵罐發(fā)酵
按照配方配制20m3培養(yǎng)基，高溫滅菌冷卻至37°C，移種量1:70，pH 5. 5 6.0，溫度37°C，補(bǔ)料前通氣量0.6 :1、補(bǔ)料后通氣量0.8 :1、補(bǔ)料8小時(shí)后至放罐通氣量1.2 :1，攪拌速度為80 90 rpm/min,每2小時(shí)取樣檢測(cè)，OD_在O. 6 I時(shí)補(bǔ)料，整體發(fā)酵時(shí)間為24 26小時(shí)，檢測(cè)合格后放罐。培養(yǎng)基配方為
玉米3%
豆柏1. 8%
蛋白胨1%
硫酸銨1%
葡萄糖0. 3%
磷酸二氫鉀O. 3%
麥芽糖5. 5%
消泡劑O. 02%
其中培養(yǎng)基組分中的固形物與液體的比例為10% ；
當(dāng)發(fā)酵生產(chǎn)菌種用量超過10升時(shí)，方法的工藝主要包括搖瓶培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)、發(fā)酵罐發(fā)酵，具體工藝過程如下
(1)搖瓶培養(yǎng)
按照配方配制I. 5L培養(yǎng)基，平均分裝于20個(gè)IOOOml三角燒瓶中，高溫滅菌冷卻后，用試管菌種接種，接種量I :500，搖床培養(yǎng)，攪拌速度為225rpm/min，溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間12小時(shí)，檢驗(yàn)合格后得菌種，待用。培養(yǎng)基配方為
蛋白胨 15g 酵母提取物7. 5g 食鹽7. 5g
用蒸懼水定容至I. 5L ；
(2)種子罐培養(yǎng)
按照配方配制300L培養(yǎng)基，高溫滅菌冷卻至37°C，接種方式為火焰接種，接種量I 200，pH6. O 7. 0，溫度37°C，攪拌速度為35 40rpm/min，每2小時(shí)取樣檢測(cè)一次，OD600在O. 6 I時(shí)補(bǔ)料，發(fā)酵時(shí)間為20 24小時(shí)，顯微鏡檢測(cè)菌體數(shù)量多，大小均一，沒有其它雜囷生長(zhǎng)，合格后，放iiS用。培養(yǎng)基配方為
玉米面3%
豆柏1. 8%
蛋白胨1%
硫酸銨1%
葡萄糖0. 3%磷酸二氫鉀0. 3%
消泡劑0. 02%
(3)發(fā)酵罐發(fā)酵
按照配方配制20m3培養(yǎng)基，高溫滅菌冷卻至37°C，移種量1:70，pH 5. 5 6.0，溫度37°C，補(bǔ)料前通氣量0.6 :1、補(bǔ)料后通氣量0.8 :1、補(bǔ)料8小時(shí)后至放罐通氣量1.2 :1，攪拌速度為80 90 rpm/min,每2小時(shí)取樣檢測(cè)，OD_在O. 6 I時(shí)補(bǔ)料，整體發(fā)酵時(shí)間為24 26小時(shí)，檢測(cè)合格后放罐。培養(yǎng)基配方為
玉米3%
豆柏1. 8%
蛋白胨1%
硫酸銨1%
葡萄糖0. 3%
磷酸二氫鉀O. 3%
麥芽糖5. 5%
消泡劑O. 02%
其中培養(yǎng)基組分中的固形物與液體的比例為10% ；
本發(fā)明中所用的含天蠶素抗菌肽基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的工程枯草芽孢桿菌可用現(xiàn)有的基因工程手段得到。具體可參考ZL200810132258. I公開的方法得到。本發(fā)明中所用的培養(yǎng)基組分中的固形物與液體比例優(yōu)先方案為10%;
利用該發(fā)酵培養(yǎng)方法生產(chǎn)的天蠶素抗菌肽殺菌效價(jià)高，質(zhì)量穩(wěn)定，可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)周期短并且成本低。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明的方法作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例I 一次IOL發(fā)酵罐的天蠶素抗菌肽的生產(chǎn) I、搖瓶培養(yǎng)
按照配方配制200ml培養(yǎng)基，平均分裝于3個(gè)500ml三角燒瓶中，高溫滅菌冷卻后，用試管菌種接種，接種量I :500，搖床培養(yǎng)，攪拌速度為225rpm/min，37°C培養(yǎng)12小時(shí)，檢驗(yàn)合格后得菌種，待用。培養(yǎng)基配方為
蛋白胨2g
酵母提取物Ig 食鹽Ig
用蒸餾水定容至200 mL，高壓滅菌備用。2、發(fā)酵罐發(fā)酵
按配方配制7L培養(yǎng)基，高溫滅菌冷卻至37°C，接種方式為火焰接種，接種量1:35，pH6. O 7. 0，溫度37°C，攪拌速度為225rpm/min，每2小時(shí)取樣檢測(cè)一次，發(fā)酵時(shí)間為20 24小時(shí)，OD6c 在O. 6 I時(shí)補(bǔ)料，顯微鏡檢測(cè)菌體數(shù)量多，大小均一，沒有其它雜菌生長(zhǎng)，合格后，放 用；
培養(yǎng)基配方為
玉米3%
豆柏1. 8%
蛋白胨1%
硫酸銨1%
葡萄糖0. 3%· 磷酸二氫鉀O. 3%
麥芽糖5. 5%
消泡劑O. 02%
實(shí)施例2 —次Im3發(fā)酵罐天蠶素抗菌肽的生產(chǎn) I、搖瓶培養(yǎng)
按照配方配制3L培養(yǎng)基，平均分裝于20個(gè)IOOOml三角燒瓶中，高溫滅菌冷卻后，用試管菌種接種，接種量I :500，搖床培養(yǎng)，攪拌速度為225rpm/min，37°C培養(yǎng)12小時(shí)，檢驗(yàn)合格后得菌種，待用。培養(yǎng)基配方為
蛋白胨30g
酵母提取物15g mL 食鹽 15g
用蒸餾水定容至3L，高壓滅菌備用。2、發(fā)酵罐發(fā)酵
按照配方配制600L培養(yǎng)基，高溫滅菌冷卻至37°C，接種方式為火焰接種，接種量I 200，pH6. O 7. 0，溫度37°C，攪拌速度為35 40rpm/min，每2小時(shí)取樣檢測(cè)一次，OD600在O. 6 I時(shí)補(bǔ)料，發(fā)酵時(shí)間為20 24小時(shí)，顯微鏡檢測(cè)菌體數(shù)量多，大小均一，沒有其它雜囷生長(zhǎng)，合格后，放iiS用。培養(yǎng)基配方為
玉米3%
豆柏1. 8%
蛋白胨1%
硫酸銨1%
葡萄糖0. 3%
磷酸二氫鉀O. 3%
麥芽糖5. 5%
消泡劑O. 02%
實(shí)施例3 —次30 m3發(fā)酵罐天蠶素抗菌肽的生產(chǎn) I、搖瓶培養(yǎng)
按照配方配制I. 5L培養(yǎng)基，平均分裝于20個(gè)IOOOml三角燒瓶中，高溫滅菌冷卻后，用試管菌種接種，接種量I :500，搖床培養(yǎng)，攪拌速度為225rpm/min，37°C培養(yǎng)12小時(shí)，檢驗(yàn)合格后得菌種，待用。
培養(yǎng)基配方為
蛋白胨 15g 酵母提取物7. 5g 食鹽7. 5g
用蒸餾水定容至I. 5L,高壓滅菌備用。2、種子罐培養(yǎng)
按照配方配制300L培養(yǎng)基，高溫滅菌冷卻至37°C，接種方式為火焰接種，接種量I 200，pH6. O 7. 0，溫度37°C，攪拌速度為35 40rpm/min，每2小時(shí)取樣檢測(cè)一次，OD600在O. 6 I時(shí)補(bǔ)料，發(fā)酵時(shí)間為20 24小時(shí)，顯微鏡檢測(cè)菌體數(shù)量多，大小均一，沒有其它雜囷生長(zhǎng)，合格后，放iiS用。培養(yǎng)基配方為
玉米面3%
豆柏1. 8%
蛋白胨1%
硫酸銨1%
葡萄糖0. 3%
磷酸二氫鉀0. 3%
消泡劑0. 02%
3、發(fā)酵罐發(fā)酵
按照配方配制20m3培養(yǎng)基，高溫滅菌冷卻至37°C，移種量1:70，pH 5. 5 6.0，溫度37°C，補(bǔ)料前通氣量0.6 :I、補(bǔ)料后通氣量0.8 :I、補(bǔ)料8小時(shí)后至放罐通氣量1.2 :1，攪拌速度為80 90 rpm/min,每2小時(shí)取樣檢測(cè)，0D_在O. 6 I時(shí)補(bǔ)料，整體發(fā)酵時(shí)間為24 26小時(shí)，檢測(cè)合格后放罐。培養(yǎng)基配方為
玉米3%
豆柏1. 8%
蛋白胨1%
硫酸銨1%
葡萄糖0. 3%
磷酸二氫鉀O. 3%
麥芽糖5. 5%
消泡劑O. 02%。
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)天蠶素抗菌肽的方法，包括 (O搖瓶培養(yǎng)按照配方配制I. 5L培養(yǎng)基，平均分裝于20個(gè)IOOOml三角燒瓶中，高溫滅菌冷卻后，用試管菌種接種，接種量I :500，搖床培養(yǎng)，攪拌速度為225rpm/min，溫度37°C,培養(yǎng)時(shí)間12小時(shí)；培養(yǎng)基配方為 蛋白胨 15g 酵母提取物7. 5g 食鹽7. 5g 用蒸懼水定容至I. 5L ； (2)發(fā)酵罐發(fā)酵按照配方配制20m3培養(yǎng)基，高溫滅菌冷卻至37°C，移種量1:70，pH 5.5 6. 0，溫度37°C，補(bǔ)料前通氣量O. 6 :I、補(bǔ)料后通氣量O. 8 :1、補(bǔ)料8小時(shí)后至放罐通氣量I. 2 :1，攪拌速度為80 90 rpm/min，每2小時(shí)取樣檢測(cè)，OD6tltl在O. 6 I時(shí)補(bǔ)料，整體發(fā)酵時(shí)間為24 26小時(shí),培養(yǎng)基配方為 玉米3% 豆柏1. 8% 蛋白胨1% 硫酸銨1% 葡萄糖0. 3% 磷酸二氫鉀O. 3% 麥芽糖5. 5% 消泡劑O. 02%。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的天蠶素抗菌肽基因轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)菌種用量超過IOL時(shí)，在搖瓶培養(yǎng)后和發(fā)酵罐發(fā)酵前進(jìn)行種子罐培養(yǎng)，按照配方配制300L培養(yǎng)基，高溫滅菌冷卻至37°C，接種方式為火焰接種，接種量I 200，pH6. O 7.0，溫度37°C，攪拌速度為35 40rpm/min，每2小時(shí)取樣檢測(cè)一次，OD600在O. 6 I時(shí)補(bǔ)料，發(fā)酵時(shí)間為20 24小時(shí)；培養(yǎng)基配方為 玉米面3% 豆柏1. 8% 蛋白胨1% 硫酸銨1% 葡萄糖0. 3% 磷酸二氫鉀0. 3% 消泡劑0. 02%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的天蠶素抗菌肽基因轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于培養(yǎng)基組分中的固形物與液體的比例為10%。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域，涉及一種枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)天蠶素抗菌肽的方法，將天蠶素抗菌肽基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌在合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，表達(dá)天蠶素抗菌肽基因并分泌天蠶素抗菌肽到菌體外，發(fā)酵液天蠶素抗菌肽的有效成分含量為≥1.5mg/ml，該方法生產(chǎn)的天蠶素抗菌肽殺菌效價(jià)高，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便，質(zhì)量穩(wěn)定，可規(guī)模生產(chǎn)，優(yōu)化養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，生產(chǎn)周期短且成本低。
文檔編號(hào)C12P21/02GK102952835SQ201110250209
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2011年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月29日
發(fā)明者譙仕彥, 何濤, 郭文江 申請(qǐng)人:中農(nóng)穎泰林州生物科園有限公司