專利名稱：一種培養(yǎng)嗅鞘細胞的培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉 及生物技術領域，尤其涉及一種培養(yǎng)嗅鞘細胞的培養(yǎng)基。
背景技術：
嗅鞘細胞是目前所發(fā)現(xiàn)的極少數(shù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)可以再生的細胞之一，其特點為終身具有神經(jīng)再生功能，還能夠釋放多種神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)粘附分子，被認為是髓鞘化能力最強的膠質細胞，逐漸用于治療脊髓損傷。嗅鞘細胞與膠質細胞、許旺細胞在表現(xiàn)型上有共同點，它們都能促進軸突的再生，主要區(qū)別在于嗅鞘細胞不但存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也存在于外周神經(jīng)中。嗅黏膜中的神經(jīng)元是唯一生后才生長并在成年時繼續(xù)分化的神經(jīng)元，壽命為4 12周，隨著新細胞的生長，又建立了新的神經(jīng)支配關系。嗅鞘細胞存在于嗅神經(jīng)及嗅球的神經(jīng)層上，沿嗅神經(jīng)的全長，從周圍神經(jīng)系統(tǒng)到中樞神經(jīng)分布。何首烏主要含三類有效成分二苯乙烯苷類化合物、蒽醌類化合物及聚合原花青素。此外還含有卵磷脂和多種微量元素。二苯乙烯苷類化合物是一類具有顯著藥理活性的水溶性成分，其代表成分二苯乙烯苷，具有顯著的降脂作用。迄今為止，僅報導了幾種分離和生長靈長類干細胞的次優(yōu)方法。例如，使用添加了白血病抑制因子(LIF)的無飼養(yǎng)物(feeder)培養(yǎng)，將鼠科嗅鞘細胞維持在未分化狀態(tài)。另一方面，當細胞在無飼養(yǎng)物細胞層或來自適宜飼養(yǎng)物細胞系的條件培養(yǎng)基下培養(yǎng)時，即使存在LIF，人嗅鞘細胞也會分化。采用飼養(yǎng)物細胞(或來自飼養(yǎng)物細胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基)的系統(tǒng)通常使用來自不同物種的細胞而不是正培養(yǎng)的干細胞，例如在大部分報道的人嗅鞘細胞未分化生長中，小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)會形成飼養(yǎng)層(feeder layer)。而且，無飼養(yǎng)物系統(tǒng)的報道通常需要使用來自DMEM培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基，其不能滿足非異種產(chǎn)物/試劑的需要。甚至采用人飼養(yǎng)物細胞的系統(tǒng)具有將未分化細胞暴露于不確定培養(yǎng)條件下的缺陷，因此許多干細胞培養(yǎng)條件通常是不可再現(xiàn)的。此外，對于大多數(shù)細胞療法，治療需要極大量的多能干細胞。根據(jù)使用埃德蒙頓方案的胰島移植所需的細胞數(shù)量，所需的分化細胞估計量在109-1010細胞的數(shù)量級。通常，人們利用經(jīng)篩選、適于人OECs生長的牛血清，作為細胞增殖的主要刺激物，體外培養(yǎng)擴增0ECS。然而，研究表明，在培養(yǎng)過程中，OECS可以吞噬培養(yǎng)體系中的牛蛋白，使異種蛋白內在化，每1080ECS中牛蛋白含量達到10-30mg。因此，使用牛血清培養(yǎng)人OECs用于細胞治療，不僅將使病人暴露于催患人畜共患病的風險，也可能因移植OECS死亡釋放牛蛋白，引起機體免疫反應，造成血清病或其它免疫性疾病。此外，每批次血清的活性是不同的，對批次間收獲的細胞的穩(wěn)定性，有一定影響。因此，利用一種無動物血清成分的培養(yǎng)基，培養(yǎng)擴增0ECS，對治療的安全性和有效性，都是十分必要的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種培養(yǎng)嗅鞘細胞的培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基，包括基礎培養(yǎng)基、生物素、谷氨酞胺、堿性成纖維細胞生長因子和表皮生長因子。所述培養(yǎng)基還包括胰島素、硒元素、人血白蛋白、組分I、組分2、組分3、組分4、組分5、組分6和組分7 ；所述組分I為氯化鐵、氯化鉻、氯化銅、氯化錳、氯化鋅和鑰酸鈉中的至少一種；所述組分2為激活素A、轉化生長因子-P、骨形成蛋白-2、白血病抑制因子、干細胞生長因子、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子-I、促紅細胞生成素、血清素、血小板源生長因子BB、白介素-6中的至少一種；所述組分3為如下組分3-1或組分3-2，所述組分3-1為膽固醇，所述組分3_2為亞油酸、亞麻酸、中鏈甘油三酯、卵磷脂和大豆油中的至少一種；所述組分4為維生素B、維生素A、維生素C、維生素E中的至少一種； 所述組分5為地塞米松或氫化考的松；所述組分6為轉鐵蛋白、乙酞輔酶A、輔酶I中至少一種；所述組分7為L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-丙氨酸、L-異亮氨酸、L-門冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、精氨酸、賴氨酸、擷氨酸、蘇氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、膚氨酸和甘氨酸中的至少一種；所述培養(yǎng)基由基礎培養(yǎng)基、生物素、谷氨酞胺、堿性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、胰島素、硒元素、人血白蛋白、組分I、組分2、組分3、組分4、組分5、組分6和組分7組成。所述生物素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5-50PM ；所述谷氨酞胺在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5-10pM ；所述堿性成纖維細胞生長因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l-100ng/mL;所述表皮生長因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l-150ng/mL;所述胰島素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l-100pg/mL ；所述硒元素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為IO-IOOnM;所述人血白蛋白在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l-50mg/mL;所述氯化鐵在所述培養(yǎng)基中的終濃度為50-1000ng/mL ；所述氯化鉻在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O. l-10pg/L ；所述氯化銅在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O. Ι-lmg/L ；所述氯化錳在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O. 01-0. lmg/L ；所述氯化鋅在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O. l-10pg/L ；所述鑰酸鈉在所述培養(yǎng)基中的終濃度為lOO-lOOOng/mL;所述激活素A在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l-100ng/ml ；所述轉化生長因子-p在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l-100ng/mL ;所述骨形成蛋白-2在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l-100ng/mL ；所述白血病抑制因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l-100ng/mL;所述干細胞生長因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l-100ng/mL ；所述肝細胞生長因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l-100ng/mL ；所述胰島素樣生長因子-I在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l_150ng/mL ；所述促紅細胞生成素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為0. l-50U/mL ；
所述血清素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為1-lOOnM/L;所述血小板源生長因子BB在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l_50ng/mL ；所述白介素-6在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5_50ng/ml ；所述膽固醇在所述培養(yǎng)基中的終濃度為10-100pg/mL;所述亞油酸在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l_50mg/L;所述亞麻酸在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l-50pg/mL;所述中鏈甘油三酯在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l-500pg/mL;所述卵磷脂在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O. l-20pg/mL ；·所述大豆油在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l-500pg/mL;所述維生素B在所述培養(yǎng)基中的終濃度為I-IOOpM ；所述維生素A在所述培養(yǎng)基中的終濃度為1_200ρΜ ；所述維生素C在所述培養(yǎng)基中的終濃度為30_100pg/mL ；所述維生素E在所述培養(yǎng)基中的終濃度為10-100pg/mL ；所述地塞米松在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O-IOpM ；所述氫化考的松在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O-IOpM ；所述轉鐵蛋白在所述培養(yǎng)基中的終濃度為10-100pg/ml ；所述乙酞輔酶A在所述培養(yǎng)基中的終濃度為0. l-10U/mL ；所述輔酶I在所述培養(yǎng)基中的終濃度為10-1000ng/ml ；所述組分7中的每種氨基酸在所述培養(yǎng)基中的終濃度為1-100ρΜ。所述生物素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5_30pM ；所述谷氨酞胺在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5-7. 5pM ；所述堿性成纖維細胞生長因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5_50ng/mL ；所述表皮生長因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為25-100ng/ml ；所述胰島素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為2. 5-20pg/ml ；所述硒元素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為30_50nM ；所述人血白蛋白在所述培養(yǎng)基中的終濃度為2-20mg/ml ；所述氯化鐵在所述培養(yǎng)基中的終濃度為100_500ng/mL ;所述氯化鉻在所述培養(yǎng)基中的終濃度為2_5pg/L ；所述氯化銅在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O. 5-0. 8mg/L ；所述氯化錳在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O. 05-0. 08mg/L ；所述氯化鋅在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l_5pg/L;所述鑰酸鈉在所述培養(yǎng)基中的終濃度為200_500ng/mL ；所述激活素A在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5_50ng/ml ；所述轉化生長因子-P在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5_50ng/ml ；所述骨形成蛋白-2在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5-50ng/ml ；所述白血病抑制因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5_50ng/ml ；所述干細胞生長因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5_50ng/ml ；所述肝細胞生長因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為10_50ng/ml ；所述胰島素樣生長因子-I在所述培養(yǎng)基中的終濃度為25-100ng/ml ；
所述促紅細胞生成素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O. 5-50U/ml ；所述血清素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為20_50nM/L ；所述血小板源生長因子BB在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5_20ng/mL ；所述白介素-6在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5_20ng/mL ；所述膽固醇在所述培養(yǎng)基中的終濃度為20-50pg/mL ；所述亞油酸在所述培養(yǎng)基中的終濃度為10_50mg/L ； 所述亞麻酸在所述培養(yǎng)基中的終濃度為10-50pg/mL ；所述中鏈甘油三酯在所述培養(yǎng)基中的終濃度為50_200pg/mL ；所述卵磷脂在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5-10pg/mL ；所述大豆油在所述培養(yǎng)基中的終濃度為50-200pg/mL ；所述維生素B在所述培養(yǎng)基中的終濃度為20_50pM ；所述維生素A在所述培養(yǎng)基中的終濃度為20_50pM ；所述維生素C在所述培養(yǎng)基中的終濃度為45_50pM ；所述維生素E在所述培養(yǎng)基中的終濃度為20-50pg/mL ；所述地塞米松在所述培養(yǎng)基中的終濃度為2_5pM ；所述氫化考的松在所述培養(yǎng)基中的終濃度為2_5pM ；所述轉鐵蛋白在所述培養(yǎng)基中的終濃度為20_50pg/ml ；所述乙酞輔酶A在所述培養(yǎng)基中的終濃度為1-lOU/mL ；所述輔酶I在所述培養(yǎng)基中的終濃度為25_200ng/ml ；所述組分7中的每種氨基酸在所述培養(yǎng)基中的終濃度為20_50pM。所述基礎培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen，21041025)；所述硒元素來源于亞硒酸鈉。所述的培養(yǎng)基在促進離體嗅鞘細胞增值中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。所述嗅鞘細胞為人嗅鞘細胞。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培養(yǎng)嗅鞘細胞的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟將離體嗅鞘細胞在所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得增殖嗅鞘細胞。所述培養(yǎng)溫度為36°C _38°C，所述培養(yǎng)時間為3-10天；所述培養(yǎng)溫度具體為37. 5°C，所述培養(yǎng)時間具體為10天。所述嗅鞘細胞為人嗅鞘細胞。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基培養(yǎng)靈長類嗅鞘細胞，該培養(yǎng)基基本上無飼養(yǎng)物細胞，培養(yǎng)得到的細胞增殖率高、增值時間短，而同時維持干細胞分化成內胚層、中胚層和外胚層組織衍生物的潛能，并同時維持干細胞的核型。


圖I為不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的嗅鞘細胞細胞形態(tài)(7d)圖2為細胞生長曲線
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、嗅鞘細胞的在不同培養(yǎng)基中的培養(yǎng)I、嗅鞘細胞的培養(yǎng)I)預處理利用PBS洗漆液將離體的人嗅鞘細胞(Olfactory Ensheathing Cells, OECs,記載在 Lim F,Martin-Bermejo MJ,Garcia-Escudero V,Gallego-Hernandez MT,Garcia_G0mezAiRabano AiDiaz-Nido J,Avi la JiMoreno-Flores MT. Reversibly immortalized humanolfactory ensheathing glia from an elderly donor maintain neuroregenerativecapacity. Glia. 2010,58(5) =546-58.公眾可從北京清美聯(lián)創(chuàng)干細胞科技有限公司獲得。 )清洗，胰蛋白酶消化液消化37. 5°C，3min后，收集細胞、離心、棄去上懸液，收集細胞。PBS 洗漆液,Invitrogen,目錄號 10010031 ；胰蛋白酶消化液，Invitrogen,目錄號25300054。2)原代培養(yǎng)將步驟I)得到的細胞用細胞培養(yǎng)液I充分吹打成單細胞懸液，接種于細胞培養(yǎng)液I中培養(yǎng)24小時，半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)，以后每3天更換一次細胞培養(yǎng)液1，培養(yǎng)7天即可完成原代培養(yǎng)，得到原代培養(yǎng)細胞。3)傳代培養(yǎng)將步驟2)的原代培養(yǎng)產(chǎn)物棄除原代培養(yǎng)的培養(yǎng)混合液，用洗滌液充分清洗細胞，去除懸浮在貼壁細胞表面的圓形細胞，加入胰蛋白酶消化液，待細胞回縮、細胞間隙增大時，加入細胞培養(yǎng)液1，充分吹打、離心(1000rpm，10min，室溫)、棄上清液、接種、培養(yǎng)溫度為37. 5°C，培養(yǎng)10天，得到實驗組傳代的細胞。細胞培養(yǎng)液I按照如下步驟制備將DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen，21041025)、生物素、谷氨酞胺、堿性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、胰島素、硒元素、人血白蛋白、組分I、組分2、組分3、組分4、組分5、組分6和組分7混合，得到細胞培養(yǎng)液I ;所述組分I為氯化鐵、氯化鉻、氯化銅、氯化錳、氯化鋅和鑰酸鈉；所述組分2為激活素A、轉化生長因子-P、骨形成蛋白-2、白血病抑制因子、干細胞生長因子、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子-I、促紅細胞生成素、血清素、血小板源生長因子BB、白介素-6 ；所述組分3為膽固醇；所述組分4為維生素B、維生素A、維生素C、維生素E ；所述組分5為地塞米松；所述組分6為轉鐵蛋白、乙酞輔酶A、輔酶I ;所述組分7為L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-丙氨酸、L-異亮氨酸、L-門冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、精氨酸、賴氨酸、擷氨酸、蘇氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、膚氨酸和甘氨酸；所述生物素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5pM ；所述谷氨酞胺在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5pM ；所述堿性成纖維細胞生長因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5ng/mL ；
所述表皮生長因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為25ng/ml ；所述胰島素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為2. 5pg/ml ；所述硒元素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為30nM ；所述人血白蛋白在所述培養(yǎng)基中的終濃度為2mg/ml ；所述氯化鐵在所述培養(yǎng)基中的終濃度為100ng/mL ；所述氯化鉻在所述培養(yǎng)基中的終濃度為2pg/L ；所述氯化銅在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O. 5mg/L ；所述氯化錳在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O. 05mg/L ；·
所述氯化鋅在所述培養(yǎng)基中的終濃度為lpg/L ；所述鑰酸鈉在所述培養(yǎng)基中的終濃度為200ng/mL ；所述激活素A在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5ng/ml ；所述轉化生長因子-P在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5ng/ml ；所述骨形成蛋白-2在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5ng/ml ；所述白血病抑制因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5ng/ml ；所述干細胞生長因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5ng/ml ；所述肝細胞生長因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為10ng/ml ；所述胰島素樣生長因子-I在所述培養(yǎng)基中的終濃度為25ng/ml ；所述促紅細胞生成素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O. 5U/ml ；所述血清素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為20nM/L ；所述血小板源生長因子BB在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5ng/mL ；所述白介素-6在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5ng/mL ；所述膽固醇在所述培養(yǎng)基中的終濃度為20pg/mL ；所述維生素B在所述培養(yǎng)基中的終濃度為20pM ；所述維生素A在所述培養(yǎng)基中的終濃度為20pM ；所述維生素C在所述培養(yǎng)基中的終濃度為45pM ；所述維生素E在所述培養(yǎng)基中的終濃度為20pg/mL ；所述地塞米松在所述培養(yǎng)基中的終濃度為2pM ；所述轉鐵蛋白在所述培養(yǎng)基中的終濃度為20pg/ml ；所述乙酞輔酶A在所述培養(yǎng)基中的終濃度為lU/mL ；所述輔酶I在所述培養(yǎng)基中的終濃度為25ng/ml ；所述組分7中的每種氨基酸在所述培養(yǎng)基中的終濃度為20pM。采用同樣的方法，將傳代培養(yǎng)中的細胞培養(yǎng)液I替換為DMEM/F12培養(yǎng)基，得到對照的傳代細胞。2、檢測細胞增殖和計算倍增時間I)分別將上述各種傳代培養(yǎng)7天后的實驗組傳代細胞和對照的傳代細胞進行顯微鏡觀察(400倍觀察)，結果如圖I所示，其中，A為基礎培養(yǎng)基DMEM/F12培養(yǎng)的嗅鞘細胞(對照的傳代細胞)為本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)的嗅鞘細胞(實驗組傳代的細胞)，從圖中看出，兩組均有突起細長的嗅鞘細胞，且實驗組傳代的細胞的數(shù)量明顯多于對照組。2)檢測細胞增殖
用CCK-8試劑盒方法檢測(日本同仁化學研究所，CK04-500)細胞增殖，在450nm波長下檢測上述傳代的實驗組傳代細胞和對照的傳代細胞在10天中的OD值，并繪出細胞增殖曲線，結果如圖2所示。按下列倍增時間計算公式計算倍增時間，TD為倍增時間，Λ t為計數(shù)間隔天數(shù)，Nt為對數(shù)生長期任一點的理論觀察值，N0為對數(shù)生長期理論初始值。計算公式如下
權利要求
1.一種培養(yǎng)嗅鞘細胞的培養(yǎng)基,包括基礎培養(yǎng)基、生物素、谷氨酞胺、堿性成纖維細胞生長因子和表皮生長因子。
2.根據(jù)權利要求I所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基還包括胰島素、硒元素、人血白蛋白、組分I、組分2、組分3、組分4、組分5、組分6和組分7 ； 所述組分I為氯化鐵、氯化鉻、氯化銅、氯化錳、氯化鋅和鑰酸鈉中的至少一種； 所述組分2為激活素A、轉化生長因子-P、骨形成蛋白-2、白血病抑制因子、干細胞生長因子、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子-I、促紅細胞生成素、血清素、血小板源生長因子BB、白介素-6中的至少一種； 所述組分3為如下組分3-1或組分3-2，所述組分3-1為膽固醇，所述組分3-2為亞油酸、亞麻酸、中鏈甘油三酯、卵磷脂和大豆油中的至少一種； 所述組分4為維生素B、維生素A、維生素C、維生素E中的至少一種； 所述組分5為地塞米松或氫化考的松； 所述組分6為轉鐵蛋白、乙酞輔酶A、輔酶I中至少一種； 所述組分7為L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-丙氨酸、L-異亮氨酸、L-門冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、精氨酸、賴氨酸、擷氨酸、蘇氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、膚氨酸和甘氨酸中的至少一種； 所述培養(yǎng)基由基礎培養(yǎng)基、生物素、谷氨酞胺、堿性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、胰島素、硒元素、人血白蛋白、組分I、組分2、組分3、組分4、組分5、組分6和組分7組成。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的培養(yǎng)基，其特征在于 所述生物素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5-50pM ； 所述谷氨酞胺在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5-10pM ； 所述堿性成纖維細胞生長因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為Ι-lOOng/mL ； 所述表皮生長因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l_150ng/mL ； 所述胰島素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為1-lOOpg/mL ； 所述硒元素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為IO-IOOnM ； 所述人血白蛋白在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l_50mg/mL ； 所述氯化鐵在所述培養(yǎng)基中的終濃度為50-1000ng/mL ； 所述氯化鉻在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O. l-10pg/L ； 所述氯化銅在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O. 1-lmg/L ； 所述氯化錳在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O. 01-0. lmg/L ； 所述氯化鋅在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O. l-10pg/L ； 所述鑰酸鈉在所述培養(yǎng)基中的終濃度為lOO-lOOOng/mL ； 所述激活素A在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l-100ng/ml ； 所述轉化生長因子-P在所述培養(yǎng)基中的終濃度為Ι-lOOng/mL ； 所述骨形成蛋白-2在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l-100ng/mL ； 所述白血病抑制因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l-100ng/mL ； 所述干細胞生長因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l-100ng/mL ； 所述肝細胞生長因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l-100ng/mL ；所述胰島素樣生長因子-I在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l-150ng/mL ；所述促紅細胞生成素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O. l-50U/mL ；所述血清素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為Ι-ΙΟΟηΜ/L ；所述血小板源生長因子BB在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l_50ng/mL ；所述白介素-6在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5-50ng/ml ；所述膽固醇在所述培養(yǎng)基中的終濃度為10-100pg/mL ； 所述亞油酸在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l_50mg/L ；所述亞麻酸在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l_50pg/mL ；所述中鏈甘油三酯在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l_500pg/mL ；所述卵磷脂在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O. l-20pg/mL ；所述大豆油在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l_500pg/mL ；所述維生素B在所述培養(yǎng)基中的終濃度為I-IOOpM ；所述維生素A在所述培養(yǎng)基中的終濃度為1_200ρΜ ；所述維生素C在所述培養(yǎng)基中的終濃度為30-100pg/mL ；所述維生素E在所述培養(yǎng)基中的終濃度為10-100pg/mL ；所述地塞米松在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O-IOpM ；所述氫化考的松在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O-IOpM ；所述轉鐵蛋白在所述培養(yǎng)基中的終濃度為10-100pg/ml ；所述乙酞輔酶A在所述培養(yǎng)基中的終濃度為0. l-10U/mL ；所述輔酶I在所述培養(yǎng)基中的終濃度為10-1000ng/ml ；所述組分7中的每種氨基酸在所述培養(yǎng)基中的終濃度為1-100ρΜ。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一所述的培養(yǎng)基,其特征在于所述生物素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5-30pM ；所述谷氨酞胺在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5-7. 5pM ；所述堿性成纖維細胞生長因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5-50ng/mL ；所述表皮生長因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為25-100ng/ml ；所述胰島素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為2. 5-20pg/ml ；所述硒元素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為30-50nM ；所述人血白蛋白在所述培養(yǎng)基中的終濃度為2-20mg/ml ；所述氯化鐵在所述培養(yǎng)基中的終濃度為100-500ng/mL ；所述氯化鉻在所述培養(yǎng)基中的終濃度為2-5pg/L ；所述氯化銅在所述培養(yǎng)基中的終濃度為0. 5-0. 8mg/L ；所述氯化錳在所述培養(yǎng)基中的終濃度為0. 05-0. 08mg/L ；所述氯化鋅在所述培養(yǎng)基中的終濃度為l_5pg/L ；所述鑰酸鈉在所述培養(yǎng)基中的終濃度為200-500ng/mL ；所述激活素A在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5-50ng/ml ；所述轉化生長因子-P在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5-50ng/ml ；所述骨形成蛋白-2在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5-50ng/ml ；所述白血病抑制因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5-50ng/ml ；所述干細胞生長因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5-50ng/ml ； 所述肝細胞生長因子在所述培養(yǎng)基中的終濃度為10-50ng/ml ； 所述胰島素樣生長因子-I在所述培養(yǎng)基中的終濃度為25-100ng/ml ； 所述促紅細胞生成素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為O. 5-50U/ml ； 所述血清素在所述培養(yǎng)基中的終濃度為20-50nM/L ； 所述血小板源生長因子BB在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5-20ng/mL ； 所述白介素-6在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5-20ng/mL ； 所述膽固醇在所述培養(yǎng)基中的終濃度為20-50pg/mL ； 所述亞油酸在所述培養(yǎng)基中的終濃度為10-50mg/L ； 所述亞麻酸在所述培養(yǎng)基中的終濃度為10-50pg/mL ； 所述中鏈甘油三酯在所述培養(yǎng)基中的終濃度為50-200pg/mL ； 所述卵磷脂在所述培養(yǎng)基中的終濃度為5-10pg/mL ； 所述大豆油在所述培養(yǎng)基中的終濃度為50-200pg/mL ； 所述維生素B在所述培養(yǎng)基中的終濃度為20-50pM ； 所述維生素A在所述培養(yǎng)基中的終濃度為20-50pM ； 所述維生素C在所述培養(yǎng)基中的終濃度為45-50pM ； 所述維生素E在所述培養(yǎng)基中的終濃度為20-50pg/mL ； 所述地塞米松在所述培養(yǎng)基中的終濃度為2-5pM ； 所述氫化考的松在所述培養(yǎng)基中的終濃度為2-5pM ； 所述轉鐵蛋白在所述培養(yǎng)基中的終濃度為20-50pg/ml ； 所述乙酞輔酶A在所述培養(yǎng)基中的終濃度為1-lOU/mL; 所述 輔酶I在所述培養(yǎng)基中的終濃度為25-200ng/ml ； 所述組分7中的每種氨基酸在所述培養(yǎng)基中的終濃度為20-50pM。
5.根據(jù)權利要求1-3中所述的培養(yǎng)基，其特征在于 所述基礎培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基； 所述硒元素來源于亞硒酸鈉。
6.權利要求1-5中任一所述的培養(yǎng)基在促進離體嗅鞘細胞增值中的應用。
7.根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于所述嗅鞘細胞為人嗅鞘細胞。
8.一種培養(yǎng)嗅鞘細胞的方法，包括如下步驟 將離體嗅鞘細胞在權利要求1-5中任一所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得增殖嗅鞘細胞。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)溫度為36°C_38°C，所述培養(yǎng)時間為3-10天；所述培養(yǎng)溫度具體為37. 5°C，所述培養(yǎng)時間具體為10天。
10.根據(jù)權利要求8或9所述的方法，其特征在于所述嗅鞘細胞為人嗅鞘細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)嗅鞘細胞的培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基，包括組分1-組分10；本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基培養(yǎng)靈長類嗅鞘細胞，該培養(yǎng)基基本上無飼養(yǎng)物細胞，培養(yǎng)得到的細胞增殖率高，而同時維持干細胞分化成內胚層、中胚層和外胚層組織衍生物的潛能，并同時維持干細胞的核型。
文檔編號C12N5/079GK102952780SQ20111025153
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月29日 優(yōu)先權日2011年8月29日
發(fā)明者田杰 申請人:北京清美聯(lián)創(chuàng)干細胞科技有限公司