專利名稱：一種利用纖維素生產(chǎn)氫氣的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)氫氣的方法。
背景技術(shù)：
能源是人類賴以生存和持續(xù)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。而常規(guī)化石能源的儲量極其有限，全球已探明的石油、天然氣和煤炭儲量將分別在今后40、60和100年左右耗盡。同時， 利用化石能源所造成的環(huán)境污染和氣候變化對人類生存和發(fā)展也提出了嚴峻挑戰(zhàn)。這使得開發(fā)新型、清潔、可再生的新能源變得非常必要和緊迫。生物質(zhì)能源作為新興能源之一，據(jù)估計，在未來40年將占全球總能耗的40%。氫氣是生物質(zhì)能源中最容易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的品種之一，它作為一種新型的清潔能源，具有來源廣泛，燃燒值高，清潔無污染，存在形式多和應(yīng)用范圍廣泛等優(yōu)點。目前，生物制氫的底物多為糖類，雖然已經(jīng)獲得很高的產(chǎn)氫效率，卻增加了產(chǎn)氫成本。纖維素是地球上最廉價、最豐富的可再生資源之一，同時，由于纖維素也是太陽能的轉(zhuǎn)化載體之一，生產(chǎn)和利用纖維素產(chǎn)氫，并不會引起環(huán)境中(X)2總量的增加。因此，纖維素生物質(zhì)已成為大規(guī)模氫氣生產(chǎn)中極具吸引力的原料。利用纖維素生產(chǎn)氫氣，其最大的瓶頸在于生產(chǎn)成本過高。由纖維素到氫氣的轉(zhuǎn)化目前有四種策略可以實現(xiàn)聯(lián)合生物加工工藝(Consolidated BioProcessing, CBP)、分步水解和發(fā)酵(S印arate Hydrolysis and Fermentation, SHF)、同步糖化發(fā)酵(Simultaneous Saccharification and Fermentation, SSF)禾口同步糖化共發(fā)酵 (Simultaneous Saccharification and Co-Fermentation, SSCF)。其中聯(lián)合生物力口工 (CBP)雖然能夠?qū)⒗w維素酶生產(chǎn)、水解糖化和戊糖己糖共發(fā)酵整合在同一反應(yīng)器內(nèi)由同一微生物或微生物群落完成，但是因為菌種資源有限，其應(yīng)用受到極大的限制。由于絕大多數(shù)產(chǎn)氫菌不能直接利用纖維素發(fā)酵產(chǎn)氫，因此，SHF, SSF和SSCF工藝得到了較為廣泛的應(yīng)用。 因此現(xiàn)有技術(shù)利用纖維素生產(chǎn)氫氣工藝需要進行纖維素原料的預(yù)處理、預(yù)處理物的糖化水解二個方面，而糖化水解過程使用的纖維素酶主要由美國sigma公司及丹麥的novozymes 公司生產(chǎn)，酶活單位為3-10U/mg的纖維素酶價格約為1KU/232元(即lg/232元)，而水解 Ig纖維素一般需要投加25U左右的纖維素酶，約0. 4元，因此當利用纖維素大規(guī)模產(chǎn)氫時， 成本會大大增加。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決現(xiàn)有纖維素產(chǎn)氫方法成本高的問題，而提供一種利用纖維素生產(chǎn)氫氣的方法。一種利用纖維素生產(chǎn)氫氣的方法，具體是按以下步驟完成的一、培養(yǎng)將綠色木霉的孢子接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在25 35°C、120 180r/min的有氧條件下懸浮培養(yǎng)3 6天；二、分離將步驟一培養(yǎng)3 6天液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基在3 10°C，5000 10000r/min離心8 15min，分離得到上清液I即為粗酶液；三、配置纖維素溶液將纖維素原料粉碎至粒度為10 30mm，并采用熱堿方法處理兩個小時，然后加入到物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，配置成質(zhì)量-體積濃度為20 50g/L的纖維素溶液；四、制備纖維素糖化液在30 70°C、pH 3 7的條件下， 將步驟二分離得到的粗酶液加入步驟三制備的纖維素溶液中，在攪拌速度為120 180r/ min放置2 6天，即得到纖維素糖化液；五、產(chǎn)氫10000 15000r/min的條件下將步驟四制備的纖維素糖化液離心10 30min，分離得到的上清液II，然后加入營養(yǎng)鹽溶液，將營養(yǎng)鹽溶液和分離得到的上清液II充分混勻后即為產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基，向產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中通入純度為99. 99%的氮氣，使產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基處于厭氧狀態(tài)，然后加入產(chǎn)氫菌的種子液，在60°C下進行厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫12 36h ；步驟一中所述綠色木霉的孢子接種量為IX IO12個/L IX IO16個/L ；步驟一中所述液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基由KH2P04、(NH4)2SO4, MgSO4 WH2CKCaCl2、有機碳源、有機氮源和微量金屬元素貯液I組成，其中KH2PO4的質(zhì)量-體積濃度為1. 0 3. Og/L, (NH4)2SO4的質(zhì)量-體積濃度為0. 5 2. Og/L, MgSO4 · 7H20的質(zhì)量-體積濃度為0. 1 1. Og/L, CaCl2的質(zhì)量-體積濃度為0. 1 1. Og/L,有機碳源的質(zhì)量-體積濃度為20 40g/L，有機氮源的質(zhì)量-體積濃度為3 10g/L，微量金屬元素貯液 I占液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基總體積的千分之一；步驟四中所述加入步驟二分離得到的粗酶液與步驟三制備的纖維素溶液的體積比為(1 10) 10 ；步驟五中所述加入的營養(yǎng)鹽溶液與上清液II的體積比為1 (1 ；3)；步驟五中所述加入產(chǎn)氫菌的種子液與產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積比為(0.5 2. 5) 25。本發(fā)明優(yōu)點一、本發(fā)明使用對纖維素有較高降解能力的綠色木霉的粗酶液對預(yù)處理后的纖維素進行水解糖化，糖化率(糖化率是產(chǎn)糖量與纖維素中纖維素與半纖維素的比值)可以達到80 85%，沒有采用商品酶，使產(chǎn)氫的成本降低了 60%;二、本發(fā)明開發(fā)了一種利用天然的纖維素原料，使用的綠色木霉所產(chǎn)生的纖維素酶將天然的纖維素原料(如稻草，玉米秸稈，小麥秸稈等)中的部分纖維素，半纖維素轉(zhuǎn)化成可溶性還原糖，再利用轉(zhuǎn)化的可溶性還原糖生產(chǎn)氫氣的方法，這種方法不僅可以在降低底物成本，而且擴大了纖維素原料的利用范圍；三、本發(fā)明采用纖維素糖化液的產(chǎn)氫量比直接采用纖維素溶液的產(chǎn)氫量提高45倍，因此提高了產(chǎn)氫效能。


圖1是具體實施方式
二十七產(chǎn)出氣體的色相色譜圖。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式一種利用纖維素生產(chǎn)氫氣的方法，具體是按以下步驟完成的一、培養(yǎng)將綠色木霉的孢子接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在25 35°C、120 180r/min的有氧條件下懸浮培養(yǎng)3 6天；二、分離將步驟一培養(yǎng)3 6天液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基在3 10°C，5000 10000r/min離心8 15min，分離得到上清液I即為粗酶液；三、 配置纖維素溶液將纖維素原料粉碎至粒度為10 30mm，并采用熱堿方法處理兩個小時， 然后加入到物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，配置成質(zhì)量-體積濃度為20 50g/L的纖維素溶液；四、制備纖維素糖化液在30 70°C、pH 3 7的條件下，將步驟二分離得到的粗酶液加入步驟三制備的纖維素溶液中，在攪拌速度為120 180r/min放置2 6天，即得到纖維素糖化液；五、產(chǎn)氫10000 15000r/min的條件下將步驟四制備的纖維素糖化液離心10 30min，分離得到的上清液II，然后加入營養(yǎng)鹽溶液， 將營養(yǎng)鹽溶液和分離得到的上清液II充分混勻后即為產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基，向產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中通入純度為99. 99%的氮氣，使產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基處于厭氧狀態(tài)，然后加入產(chǎn)氫菌的種子液，在60°C下進行厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫12 36h。本實施方式步驟一中所述綠色木霉的孢子接種量為IXlO12個/L IXio16A/ L ；本實施方式步驟一中所述液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基由KH2P04、(NH4)2SO4, MgSO4 · 7H20、CaCl2、有機碳源、有機氮源和微量金屬元素貯液I組成，其中KH2PO4的質(zhì)量-體積濃度為1. 0 3. Og/ L，(NH4)2SO4的質(zhì)量-體積濃度為0. 5 2. Og/L, MgSO4 · 7H20的質(zhì)量-體積濃度為0. 1 1. Og/L, CaCl2的質(zhì)量-體積濃度為0. 1 1. Og/L,有機碳源的質(zhì)量-體積濃度為20 40g/ L，有機氮源的質(zhì)量-體積濃度為3 10g/L，微量金屬元素貯液I占液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基總體積的千分之一。本實施方式步驟四中所述加入步驟二分離得到的粗酶液與步驟三制備的纖維素溶液的體積比為(1 10) 10。本實施方式步驟五中所述加入的營養(yǎng)鹽溶液與上清液II的體積比為1 (1 3)；本實施方式步驟五中所述加入產(chǎn)氫菌的種子液與產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積比為 (0. 5 2.幻25。本實施方式使用對纖維素有較高降解能力的綠色木霉的粗酶液對預(yù)處理后的纖維素進行水解糖化，糖化率(糖化率是產(chǎn)糖量與纖維素中纖維素與半纖維素的比值)可以達到80 85%，沒有采用商品酶，使產(chǎn)氫的成本降低了 60%。目前的絕大多數(shù)產(chǎn)氫菌株以葡萄糖或淀粉等為底物生產(chǎn)氫氣，少數(shù)產(chǎn)氫菌株能夠利用五碳糖如木糖生產(chǎn)氫氣，這種直接使用葡萄糖、淀粉或木糖等物質(zhì)生產(chǎn)氫氣存在成本高的問題；本實施方式從實際出發(fā)，根據(jù)我國纖維素原料儲量十分豐富的特點，開發(fā)了一種利用天然的纖維素原料，使用的綠色木霉所產(chǎn)生的纖維素酶將天然的纖維素原料(如稻草，玉米秸稈，小麥秸稈等)中的部分纖維素，半纖維素轉(zhuǎn)化成可溶性還原糖，再利用轉(zhuǎn)化的可溶性還原糖生產(chǎn)氫氣的方法，這種方法不僅可以在降低底物成本，而且擴大了纖維素原料的利用范圍。本實施方式采用纖維素糖化液的產(chǎn)氫量比直接采用纖維素溶液的產(chǎn)氫量提高45 倍，因此提高了產(chǎn)氫效能。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同點是步驟一中所述的綠色木霉是真菌iTrichoderma viride，編號3. 2876，分離號糖研37。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二之一不同點是步驟一中所述液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中KH2PO4的質(zhì)量-體積濃度為2. Og/L, (NH4)2SO4的質(zhì)量-體積濃度為 1. 4g/L，MgSO4 · 7H20的質(zhì)量-體積濃度為0. 3g/L，CaCl2的質(zhì)量-體積濃度為0. 3g/L，有機碳源的質(zhì)量-體積濃度為30g/L，有機氮源的質(zhì)量-體積濃度為5g/L。其它與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一至三之一不同點是步驟一中所述液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的有機碳源為葡萄糖、微晶纖維素、麩皮、稻草、玉米秸稈或小麥秸稈中的一種或者兩種及兩種以上任意配比的混合物。其它與具體實施方式
一至三相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一至四之一不同點是步驟一中所述液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的有機碳源是麩皮和玉米秸稈的混合物，其中麩皮與玉米秸稈的質(zhì)量比為2 1。其它與具體實施方式
一至四相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一至五之一不同點是步驟一中所述液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的有機氮源為豆餅粉、尿素、蛋白胨或酵母浸粉中的一種或者兩種及兩種以上任意配比的混合物。其它與具體實施方式
一至五相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一至六之一不同點是步驟一中所述液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的微量金屬元素貯液I是由FeSO4 · 7H20、MgS04、ZnSO4 · 7H20和CoCl2 組成，其中FeSO4 · 7H20的質(zhì)量-體積濃度為3 7g/L，MgSO4的質(zhì)量-體積濃度為0. 5 3. Og/L，ZnSO4 ·7Η20的質(zhì)量-體積濃度為1. 0 2. Og/L, CoCl2的質(zhì)量-體積濃度為1. O 3.0g/L。其它與具體實施方式
一至六相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
一至七之一不同點是步驟一中所述液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的微量金屬元素貯液I是由FeSO4 · 7H20、MgS04、ZnSO4 · 7H20和CoCl2 組成，其中FeSO4 · 7H20的質(zhì)量-體積濃度為5. Og/L, MgSO4的質(zhì)量-體積濃度為1. 6g/L， ZnSO4 · 7H20的質(zhì)量-體積濃度為1. 4g/L，CoCl2的質(zhì)量-體積濃度為2. Og/L。其它與具體實施方式
一至七相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一至八之一不同點是步驟一中在 29°CU50r/min的有氧條件下懸浮培養(yǎng)4天。其它與具體實施方式
一至八相同。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
一至九之一不同點是步驟二中將步驟一培養(yǎng)4天液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基在4°C，8000r/min離心lOmin，分離得到上清液I即為粗酶液。其它與具體實施方式
一至九相同。
具體實施方式
十一本實施方式與具體實施方式
一至十之一不同點是步驟三中所述的纖維素原料是農(nóng)業(yè)廢棄物、工業(yè)處理的植物廢物或能源作物，或者農(nóng)業(yè)廢棄物和工業(yè)處理的植物廢物任意配比的混合物、農(nóng)業(yè)廢棄物和能源作物任意配比的混合物、能源作物和工業(yè)處理的植物廢物任意配比的混合物，或者農(nóng)業(yè)廢棄物、工業(yè)處理的植物廢物和能源作物三種物質(zhì)任意配比的混合物。其它與具體實施方式
一至十相同。
具體實施方式
十二 本實施方式與具體實施方式
十一的不同點是所述的農(nóng)業(yè)廢棄物為玉米秸稈、稻草秸稈、小麥秸稈或蔗渣；所述工業(yè)處理的植物廢物為鋸屑或紙漿；所述能源作物為狗尾草。其它與具體實施方式
十一相同。
具體實施方式
十三本實施方式與具體實施方式
一至十二之一不同點是步驟三中所述的熱堿方法是在100°c條件下采用質(zhì)量分數(shù)為2%的氫氧化鈉溶液處理粒度為10 30mm的纖維素原料。其它與具體實施方式
一至十二相同。
具體實施方式
十四本實施方式與具體實施方式
十三不同點是步驟三中所述的熱堿方法時，粒度為10 30mm的纖維素原料與質(zhì)量分數(shù)為2%的氫氧化鈉溶液的固液比 (所述的固液比是粒度為10 30mm的纖維素原料的質(zhì)量與質(zhì)量分數(shù)為2%的氫氧化鈉溶液的體積之比)為1 10。其它與具體實施方式
十三相同。
具體實施方式
十五本實施方式與具體實施方式
一至十四之一不同點是步驟三中采用熱堿方法2h，然后加入到物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，配置成質(zhì)量-體積濃度為35g/L的纖維素溶液。其它與具體實施方式
一至十四相同。
具體實施方式
十六本實施方式與具體實施方式
一至十五之一不同點是步驟四中在50°C、pH5的條件下，將步驟二分離得到的粗酶液加入步驟三制備的纖維素溶液中，在攪拌速度為150r/min放置3天，即得到纖維素糖化液。其它與具體實施方式
一至十五相同。
具體實施方式
十七本實施方式與具體實施方式
一至十六之一不同點是步驟四中所述加入步驟二分離得到的粗酶液與步驟三制備的纖維素溶液的體積比為0 5) 10。其它與具體實施方式
一至十六相同。
具體實施方式
十八本實施方式與具體實施方式
一至十七之一不同點是步驟四中所述加入步驟二分離得到的粗酶液與步驟三制備的纖維素溶液的體積比為3 7。其它與具體實施方式
一至十七相同。
具體實施方式
十九本實施方式與具體實施方式
一至十八之一不同點是步驟五中在13000r/min的條件下將步驟四制備的纖維素糖化液離心20min，分離得到的上清液 II。其它與具體實施方式
一至十八相同具體實施方式
二十本實施方式與具體實施方式
一至十九之一不同點是步驟五中所述的產(chǎn)氫菌為熱解糖厭氧芽孢桿菌W16 (Thermoanaerobacterium thermosaccharoIyticum W16)， Thermoanaerobacterium thermosaccharoIyticum W16 在 2008 年第 33 期第 61M-6132 頁的《hternational Journal of Hydrogen Energy)) 中干丨J 登的名禾爾為"Dark fermentation of xylose and glucose mix using isolated Thermoanaerobacterium thermosaccharoIyticum W16，，的文章中公開。其它與具體實施方式
一至十九相同。
具體實施方式
二十一本實施方式與具體實施方式
一至二十之一不同點是步驟五中所述營養(yǎng)鹽溶液由氯化銨、氯化鈉、磷酸氫二鉀、半胱氨酸、MgCl2 · 6H20、氯化鉀、酵母粉、蛋白胨、微量金屬元素貯液II、維生素貯液和0. 1%0 (w/v)的刃天青制備而成；其中所述的微量金屬元素貯液II由氯化亞鐵、氯化鋅、硼酸、MnCl2 · 4H20、CuCl2 · 2H20、CoCl2 · 6H20、 NiCl2 · 6H20、Na2MO4 · H20、鎢酸鈉和NiijeO4 · 5H20制備而成，微量金屬元素貯液II中氯化亞鐵的質(zhì)量-體積濃度為1. 5g/L，氯化鋅的質(zhì)量-體積濃度為70mg/L，硼酸的質(zhì)量-體積濃度為6mg/L，MnCl2 · 4H20的質(zhì)量-體積濃度為0. lg/L，CuCl2 · 2H20的質(zhì)量-體積濃度為 2mg/L, CoCl2 ·6Η20的質(zhì)量-體積濃度為0. 19g/L，NiCl2 ·6Η20的質(zhì)量-體積濃度為2%ig/L， Na2MO4 -H2O的質(zhì)量-體積濃度為36mg/L，鎢酸鈉的質(zhì)量-體積濃度為15mg/L，NajeO4 ·5Η20 的質(zhì)量-體積濃度為15mg/L ；其中所述的維生素貯液由硫辛酸、生物素、煙酸、鹽酸硫胺素、 對氨基苯甲酸、葉酸、泛酸鈣、維生素B12和鹽酸吡哆醇制備而成，維生素貯液中硫辛酸的質(zhì)量-體積濃度為50. Omg/L,生物素的質(zhì)量-體積濃度為20. Omg/L, 0. 35g/L的煙酸，鹽酸硫胺素的質(zhì)量-體積濃度5. Omg/L為，對氨基苯甲酸的質(zhì)量-體積濃度為50. Omg/L,葉酸的質(zhì)量-體積濃度為20. Omg/L,泛酸鈣的質(zhì)量-體積濃度為50. Omg/L,維生素B12的質(zhì)量-體積濃度為1. Omg/L，鹽酸吡哆醇的質(zhì)量-體積濃度為100. Omg/L。其它與具體實施方式
一至二十相同。
具體實施方式
二十二 本實施方式與具體實施方式
一至二十一之一不同點是步驟五中所述加入的營養(yǎng)鹽溶液與上清液II的體積比為3 7。其它與具體實施方式
一至二十一相同。
具體實施方式
二十三本實施方式與具體實施方式
一至二十二之一不同點是步驟五中制備的產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中氯化銨的質(zhì)量-體積濃度為1.0g/L、氯化鈉的質(zhì)量-體積濃度為1. Og/L、磷酸氫二鉀的質(zhì)量-體積濃度為3g/L、磷酸二氫鉀的質(zhì)量-體積濃度為1. 5g/L、半胱氨酸的質(zhì)量-體積濃度為0. 5g/L、MgCl2 · 6H20的質(zhì)量-體積濃度為 0. 5g/L、氯化鉀的質(zhì)量-體積濃度為0. 2g/L、酵母粉的質(zhì)量-體積濃度為2g/L、蛋白胨的質(zhì)量-體積濃度為2g/L、微量金屬元素貯液II占產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的千分之一、 維生素貯液占產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的千分之一、0.1%。(w/v)的刃天青占產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的千分之一。其它與具體實施方式
一至二十二相同。
具體實施方式
二十四本實施方式與具體實施方式
一至二十三之一不同點是步驟五中所述的產(chǎn)氫菌的種子液是產(chǎn)氫菌培養(yǎng)至對數(shù)期的液體懸濁液。其它與具體實施方式
一至二十三相同。
具體實施方式
二十五本實施方式與具體實施方式
一至二十四之一不同點是步驟五中所述加入產(chǎn)氫菌的種子液與產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積比為1 25。其它與具體實施方式
一至二十四相同。
具體實施方式
二十六本實施方式與具體實施方式
一至二十五之一不同點是步驟五中在60°C下進行厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫Mh。其它與具體實施方式
一至二十五相同。
具體實施方式
二十七本實施方式與具體實施方式
一至二十六之一不同點是本實施方式具體是按以下步驟完成的一、培養(yǎng)將真菌Trichoderma viride的孢子接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在、 150r/min的有氧條件下懸浮培養(yǎng)4天；二、分離將步驟一培養(yǎng)4天液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基在4°C， 8000r/min離心lOmin，分離得到上清液I即為粗酶液；三、配置纖維素溶液將玉米秸稈粉碎至粒度為10 30mm，并采用熱堿方法處理池，然后加入到物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，配置成質(zhì)量-體積濃度為35g/L的纖維素溶液；四、制備纖維素糖化液在50°C、pH 2的條件下，將步驟二分離得到的粗酶液加入步驟三制備的纖維素溶液中，在攪拌速度為150rpm/min放置3天，即得到纖維素糖化液；五、產(chǎn)氫13000r/ min的條件下將步驟四制備的纖維素糖化液離心20min，分離得到的上清液II，然后加入營養(yǎng)鹽溶液，將營養(yǎng)鹽溶液和分離得到的上清液II充分混勻后即為產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基， 向產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中通入純度為99. 99%的氮氣，使產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基處于厭氧狀態(tài)，然后加入產(chǎn)氫菌的種子液，在60°C下進行厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫Mh。本實施方式步驟一中真菌Trichoderma viride的孢子接種量為1 X IO12個/L IXlO16個/L ；本實施方式步驟一中所述液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基由KH2P04、(NH4)2SO4^MgSO4 · 7H20、 CaCl2、有機碳源、有機氮源和微量金屬元素貯液I組成，其中KH2PO4的質(zhì)量-體積濃度為
2.Og/L, (NH4)2SO4的質(zhì)量-體積濃度為1. 4g/L，MgSO4 · 7H20的質(zhì)量-體積濃度為0. 3g/ L，CaCl2的質(zhì)量-體積濃度為0. 3g/L，有機碳源的質(zhì)量-體積濃度為30g/L，有機氮源的質(zhì)量-體積濃度為5g/L，微量金屬元素貯液I占液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基總體積的千分之一；其中所述的有機碳源是麩皮與玉米秸稈按質(zhì)量比為2 1混合的混合物；其中所述的有機氮源為豆餅粉；其中所述的微量金屬元素貯液I是由FeSO4 · 7H20、MgSO4, ZnSO4 · 7H20和CoCl2 組成，其中FeSO4 · 7H20的質(zhì)量-體積濃度為3 7g/L，MgSO4的質(zhì)量-體積濃度為0. 5
3.Og/L, ZnSO4 ·7Η20的質(zhì)量-體積濃度為1. 0 2. 0g/L, CoCl2的質(zhì)量-體積濃度為1. 0 3. Og/L。本實施方式步驟三中所述的熱堿方法是在100°C條件下采用質(zhì)量分數(shù)為2%的氫氧化鈉溶液處理粒度為10 30mm的玉米秸稈，其中所述的粒度為10 30mm的玉米秸稈與質(zhì)量分數(shù)為2%的氫氧化鈉溶液的固液比(所述的固液比是粒度為10 30mm的玉米秸稈的質(zhì)量與質(zhì)量分數(shù)為2%的氫氧化鈉溶液的體積之比)為1 10。本實施方式步驟四中所述加入步驟二分離得到的粗酶液與步驟三制備的纖維素溶液的體積比為3 7。本實施方式步驟五中所述的產(chǎn)氫菌為熱解糖厭氧芽孢桿菌 W16 (Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16)，Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16在2008年第33期第6124-6132頁的《International Journal of Hydrogen Energy》中干丨J登的名禾爾為“Dark fermentation of xylose and glucose mix using isolated Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16，，的文章中公幵。本實施方式步驟五中所述營養(yǎng)鹽溶液由氯化銨、氯化鈉、磷酸氫二鉀、半胱氨酸、 MgCl2 · 6H20、氯化鉀、酵母粉、蛋白胨、微量金屬元素貯液II、維生素貯液和0. 1%0 (w/v)的刃天青制備而成；其中所述的微量金屬元素貯液II由氯化亞鐵、氯化鋅、硼酸、MnCl2 ·4Η20、 CuCl2 ·2Η20,CoCl2 ·6Η20、NiCl2 ·6Η20、Na2MO4 ·Η20、鎢酸鈉和 Νει2%04 ·5Η20 制備而成，微量金屬元素貯液II中氯化亞鐵的質(zhì)量-體積濃度為1. 5g/L，氯化鋅的質(zhì)量-體積濃度為70mg/ L，硼酸的質(zhì)量-體積濃度為6mg/L，MnCl2 · 4H20的質(zhì)量-體積濃度為0. lg/L，CuCl2 · 2H20 的質(zhì)量-體積濃度為ang/L，CoCl2 · 6H20的質(zhì)量-體積濃度為0. 19g/L，NiCl2 · 6H20的質(zhì)量-體積濃度為2%ig/L，Na2MO4 -H2O的質(zhì)量-體積濃度為36mg/L，鎢酸鈉的質(zhì)量-體積濃度為15mg/L，Na2k04 ·5Η20的質(zhì)量-體積濃度為15mg/L ；其中所述的維生素貯液由硫辛酸、生物素、煙酸、鹽酸硫胺素、對氨基苯甲酸、葉酸、泛酸鈣、維生素B12和鹽酸吡哆醇制備而成， 維生素貯液中硫辛酸的質(zhì)量-體積濃度為50. Omg/L,生物素的質(zhì)量-體積濃度為20. Omg/ L，0. 35g/L的煙酸，鹽酸硫胺素的質(zhì)量-體積濃度5. Omg/L為，對氨基苯甲酸的質(zhì)量-體積濃度為50. Omg/L,葉酸的質(zhì)量-體積濃度為20. Omg/L,泛酸鈣的質(zhì)量-體積濃度為50. Omg/ L，維生素B12的質(zhì)量-體積濃度為1. 0mg/L,鹽酸吡哆醇的質(zhì)量-體積濃度為100. 0mg/L。本實施方式步驟五中所述加入的營養(yǎng)鹽溶液與上清液II的體積比為3 7。本實施方式步驟五中制備的產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中氯化銨的質(zhì)量-體積濃度為1. 0g/L、氯化鈉的質(zhì)量-體積濃度為1. 0g/L、磷酸氫二鉀的質(zhì)量-體積濃度為3g/L、磷酸二氫鉀的質(zhì)量-體積濃度為1. 5g/L、半胱氨酸的質(zhì)量-體積濃度為0. 5g/L、MgCl2 · 6H20的質(zhì)量-體積濃度為0. 5g/L、氯化鉀的質(zhì)量-體積濃度為0. 2g/L、酵母粉的質(zhì)量-體積濃度為2g/L、蛋白胨的質(zhì)量-體積濃度為2g/L、微量金屬元素貯液II占產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的千分之一、維生素貯液占產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的千分之一、0. 1%0 (w/v) 的刃天青占產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的千分之一。本實施方式驟五中所述的產(chǎn)氫菌的種子液是產(chǎn)氫菌培養(yǎng)至對數(shù)期的液體懸濁液。本實施方式步驟五中所述加入產(chǎn)氫菌的種子液與產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積比為1 邪。檢測本實施方式步驟四制備的纖維素糖化液，可知步驟四制備的纖維素糖化液中還原糖總量達到15. 08g/L，與使用商品酶的糖化量相差不多，通過成分經(jīng)測定可知還原糖主要成分為戊糖和己糖。 本實施方式步驟五中在60°C下進行厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫他后開始有氣體產(chǎn)出，對產(chǎn)出的氣體通過SC II型氣相色譜儀(上海分析儀器)檢測，采用熱導(dǎo)池檢測器，選用柱長為^Ii 不銹鋼色譜柱、60 80目的擔體TDS-01、載氣為氮氣，在載氣流速為70mL/min、色譜柱溫度為150°C、檢測室溫度為150°C，室溫下檢測，如圖1所示，通過圖1可知產(chǎn)出的氣體保留時間為0. 54min,因此該氣體為氫氣；在60°C下進行厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫24h后氣體停止產(chǎn)出，通過計算可知最后的產(chǎn)氫量為107. 3ml/go
權(quán)利要求
1.一種利用纖維素生產(chǎn)氫氣的方法，其特征在于利用纖維素生產(chǎn)氫氣的方法是按以下步驟完成的一、培養(yǎng)將綠色木霉的孢子接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在25 35°C、120 180r/min 的有氧條件下懸浮培養(yǎng)3 6天；二、分離將步驟一培養(yǎng)3 6天液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基在3 10°C, 5000 lOOOOr/min離心8 15min，分離得到上清液I即為粗酶液；三、配置纖維素溶液將纖維素原料粉碎至粒度為10 30mm，并采用熱堿方法處理兩個小時，然后加入到物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，配置成質(zhì)量-體積濃度為 20 50g/L的纖維素溶液；四、制備纖維素糖化液在30 70°C、pH 3 7的條件下，將步驟二分離得到的粗酶液加入步驟三制備的纖維素溶液中，在攪拌速度為120 180r/min 放置2 6天，即得到纖維素糖化液；五、產(chǎn)氫10000 15000r/min的條件下將步驟四制備的纖維素糖化液離心10 30min，分離得到的上清液II，然后加入營養(yǎng)鹽溶液，將營養(yǎng)鹽溶液和分離得到的上清液II充分混勻后即為產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基，向產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中通入純度為99. 99%的氮氣，使產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基處于厭氧狀態(tài)，然后加入產(chǎn)氫菌的種子液，在60°C下進行厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫12 36h ；步驟一中所述綠色木霉的孢子接種量為IX IO12個/L IX IO16個/L ；步驟一中所述液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基由KH2P04、(NH4)2SO4, MgSO4 WH2CKCaCl2、有機碳源、有機氮源和微量金屬元素貯液I組成，其中KH2PO4的質(zhì)量-體積濃度為1. 0 3. Og/L, (NH4)2SO4的質(zhì)量-體積濃度為0. 5 2. 0g/L, MgSO4 · 7H20的質(zhì)量-體積濃度為0. 1 1. 0g/L, CaCl2的質(zhì)量-體積濃度為0. 1 1. 0g/L,有機碳源的質(zhì)量-體積濃度為20 40g/L，有機氮源的質(zhì)量-體積濃度為3 10g/L，微量金屬元素貯液 I占液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基總體積的千分之一；步驟四中所述加入步驟二分離得到的粗酶液與步驟三制備的纖維素溶液的體積比為(1 10) 10 ；步驟五中所述加入的營養(yǎng)鹽溶液與上清液II的體積比為1 (1 ；3)；步驟五中所述加入產(chǎn)氫菌的種子液與產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積比為(0.5 2. 5) 25。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用纖維素生產(chǎn)氫氣的方法，其特征在于步驟一中所述的綠色木霉是真菌iTrichoderma viride，編號3.觀76，分離號糖研37。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用纖維素生產(chǎn)氫氣的方法，其特征在于步驟一中所述液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的有機碳源為葡萄糖、微晶纖維素、麩皮、稻草、玉米秸稈或小麥秸稈中的一種或者兩種及兩種以上的混合物；步驟一中所述液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的有機氮源為豆餅粉、尿素、蛋白胨或酵母浸粉中的一種或者兩種及兩種以上的混合物；步驟一中所述液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的微量金屬元素貯液I是由FeSO4 · 7H20、MgSO4, ZnSO4 · 7H20和CoCl2組成，其中FeSO4 · 7H20的質(zhì)量-體積濃度為3 7g/L，MgSO4的質(zhì)量-體積濃度為0. 5 3. 0g/L, ZnSO4 · 7H20的質(zhì)量-體積濃度為1. 0 2. 0g/L, CoCl2的質(zhì)量-體積濃度為1. 0 3. Og/ L0
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種利用纖維素生產(chǎn)氫氣的方法，其特征在于步驟三中所述的纖維素原料是農(nóng)業(yè)廢棄物、工業(yè)處理的植物廢物或能源作物，或者農(nóng)業(yè)廢棄物和工業(yè)處理的植物廢物的混合物、農(nóng)業(yè)廢棄物和能源作物的混合物、能源作物和工業(yè)處理的植物廢物的混合物，或者農(nóng)業(yè)廢棄物、工業(yè)處理的植物廢物和能源作物三種物質(zhì)的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種利用纖維素生產(chǎn)氫氣的方法，其特征在于步驟三中所述的熱堿方法是在100°c條件下采用質(zhì)量分數(shù)為2%的氫氧化鈉溶液處理粒度為10 30mm的纖維素原料，其中所述的粒度為10 30mm的纖維素原料與質(zhì)量分數(shù)為2%的氫氧化鈉溶液的固液比為1 10。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種利用纖維素生產(chǎn)氫氣的方法，其特征在于步驟五中所述的產(chǎn)S菌為熱角軍糖厭氧芽抱桿菌 W16 (Thermoanaerobacterium thermosaccharoIyticum W16), Thermoanaerobacterium thermosaccharoIyticum W16 在 2008 年第 33 期第 6124-6132 頁的〈〈International Journal of Hydrogen Energy〉〉中干Ij登的名稱為"Dark fermentation of xylose and glucose mix using isolated Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16”的文章中公開；步驟五中所述營養(yǎng)鹽溶液由氯化銨、氯化鈉、 磷酸氫二鉀、半胱氨酸、MgCl2 · 6H20、氯化鉀、酵母粉、蛋白胨、微量金屬元素貯液II、維生素貯液和0. 1%0 (w/v)的刃天青制備而成；其中所述的微量金屬元素貯液II由氯化亞鐵、 氯化鋅、硼酸、MnCl2 · 4H20、CuCl2 · 2H20、CoCl2 · 6H20、NiCl2 · 6H20、Na2MO4 · H20、鎢酸鈉和 NajeO4 ·5Η20制備而成，微量金屬元素貯液II中氯化亞鐵的質(zhì)量-體積濃度為1.5g/L，氯化鋅的質(zhì)量-體積濃度為70mg/L，硼酸的質(zhì)量-體積濃度為6mg/L，MnCl2 ·4Η20的質(zhì)量-體積濃度為0. lg/L，CuCl2 · 2H20的質(zhì)量-體積濃度為ang/L，CoCl2 · 6H20的質(zhì)量-體積濃度為0. 19g/L，NiCl2 · 6H20的質(zhì)量-體積濃度為2%ig/L，Na2MO4 · H2O的質(zhì)量-體積濃度為 36mg/L，鎢酸鈉的質(zhì)量-體積濃度為15mg/L，Na2SeO4 · 5H20的質(zhì)量-體積濃度為15mg/L ； 其中所述的維生素貯液由硫辛酸、生物素、煙酸、鹽酸硫胺素、對氨基苯甲酸、葉酸、泛酸鈣、 維生素B12和鹽酸吡哆醇制備而成，維生素貯液中硫辛酸的質(zhì)量-體積濃度為50. Omg/L,生物素的質(zhì)量-體積濃度為20. Omg/L, 0. 35g/L的煙酸，鹽酸硫胺素的質(zhì)量-體積濃度5. Omg/ L為，對氨基苯甲酸的質(zhì)量-體積濃度為50. 0mg/L,葉酸的質(zhì)量-體積濃度為20. 0mg/L, 泛酸鈣的質(zhì)量-體積濃度為50. 0mg/L,維生素B12的質(zhì)量-體積濃度為1. 0mg/L,鹽酸吡哆醇的質(zhì)量-體積濃度為100. 0mg/L ；步驟五中制備的產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中氯化銨的質(zhì)量-體積濃度為1. 0g/L、氯化鈉的質(zhì)量-體積濃度為1. 0g/L、磷酸氫二鉀的質(zhì)量-體積濃度為3g/L、磷酸二氫鉀的質(zhì)量-體積濃度為1. 5g/L、半胱氨酸的質(zhì)量-體積濃度為0. 5g/ L、MgCl2 · 6H20的質(zhì)量-體積濃度為0. 5g/L、氯化鉀的質(zhì)量-體積濃度為0. 2g/L、酵母粉的質(zhì)量-體積濃度為2g/L、蛋白胨的質(zhì)量-體積濃度為2g/L、微量金屬元素貯液II占產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的千分之一、維生素貯液占產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的千分之一、0. 1%0 (w/v)的刃天青占產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的千分之一；步驟五中所述的產(chǎn)氫菌的種子液是產(chǎn)氫菌培養(yǎng)至對數(shù)期的液體懸濁液。
全文摘要
一種利用纖維素生產(chǎn)氫氣的方法，它涉及一種生產(chǎn)氫氣的方法。本發(fā)明要解決現(xiàn)有纖維素產(chǎn)氫方法成本高的問題。本發(fā)明的操作步驟如下1.培養(yǎng)，2.分離，3.配置纖維素溶液，4.制備纖維素糖化液，5.產(chǎn)氫。本發(fā)明優(yōu)點1.本發(fā)明沒有采用商品酶，使產(chǎn)氫的成本降低了60％；2.本發(fā)明使用的綠色木霉所產(chǎn)生的纖維素酶對自然界中的不同種類的纖維素都有降解能力，擴大了纖維素原料的利用范圍；3.本發(fā)明采用纖維素糖化液的產(chǎn)氫量比直接采用纖維素溶液的產(chǎn)氫量提高45倍，提高了產(chǎn)氫效能。本發(fā)明主要用于生產(chǎn)氫氣。
文檔編號C12R1/885GK102286538SQ20111025353
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月30日
發(fā)明者任南琪, 任宏宇, 曹廣麗, 王愛杰, 趙磊 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)