專利名稱：乙型肝炎病毒耐藥基因突變的檢測探針、檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體涉及與乙型肝炎病毒的核苷類似物治療耐藥性相關(guān)的基因突變檢測。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(h印atitis B virus, HBV)屬啫肝DNA病毒科，基因組長約3. 2Kb， 為部分雙鏈環(huán)狀DNA。乙型肝炎是全球廣泛分布的傳染病，但不同地區(qū)HBV感染的流行強(qiáng)度差異很大。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約20億人曾感染過HBV，其中3. 5億人為慢性HBV 感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌。2006年全國乙型肝炎流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，我國1 59歲一般人群乙肝病毒表面抗原(HBV surface antigen, HBsAg)攜帶率為7. 18%，5歲以下兒童的HbsAg攜帶率僅為0. 96%。據(jù)此推算， 我國現(xiàn)有的慢性HBV感染者約有9300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例。我國每年因肝病死亡的約有30萬人左右。近年來，慢性乙型肝炎的治療取得了很大改善，目前獲得批準(zhǔn)的用于治療慢性乙型肝炎的藥物有兩大類，一類是干擾素，一類是核苷類似物。目前已經(jīng)上市的核苷類似物藥物有5種，分別是拉米夫定(Lamivudine，LAM, 1998年上市)、阿德福韋酯(Adefovir，ADV, 2002 年上市)、恩替卡韋(Entecavir, ETV，2005 年上市)、替比夫定(Telbivudine, LDT， 2007年上市)、替諾福韋(Tenofovir，TDF)、恩曲他濱(Emtricitabine, FTC)。這類藥物是通過干擾病毒的逆轉(zhuǎn)錄過程和抑制DNA合成來抑制病毒DNA的復(fù)制，使患者的病毒DNA水平快速下降。這類藥物的優(yōu)勢在于口服藥物且安全可靠。但是核苷類似物藥物只能抑制病毒復(fù)制，而不能根除病毒，因此需要長期使用。而隨著核苷類藥物在國內(nèi)使用頻率及年限的增加，HBV耐藥突變率逐年增高，例如1998年批準(zhǔn)使用的拉米夫定(LAM)，治療1 4年的基因耐藥率分別為14%、38%、49%、66%，且呈現(xiàn)繼續(xù)上升趨勢，其他類藥物也出現(xiàn)不同程度的耐藥性。目前報(bào)道的核苷類似物藥物拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋、替比夫定、替諾福韋、恩曲他濱在中國人群中常見的耐藥基因突變位點(diǎn)有18個。rtV173L、rtL179P、rtL180M、 rtA181V/T、rtT184A/G/I/S、rtA194T/M、rtA200V、rtS202G/I、rtM204V/I/S、rtV207M/I/ L、rtS213T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、rtN238T/D、rtK241E、rtM250V。其中， rtV173L、rtM204V/I/S、rtL180M 與恩曲他濱的耐藥有關(guān)；rtV173L、rtL179P、rtL180M、 rtA200V、rtM204V/I/S、rtV207M/I/L、rtS213T 與拉米夫定的耐藥有關(guān)；rtV173L、rtL180M、 rtT184A/G/I/S、rtS202G/I、rtM204V/I/S、rtM250V 與恩替卡韋的耐藥有關(guān)；rtM204V/I/ S與替比夫定耐藥有關(guān)，rtA194T/M與替諾福韋耐藥有關(guān)；rtA181V/T、rtK241E、rtQ215S、 rtN236T、rtP237H、rtN238T/D、rtV214A與阿德福韋酯耐藥有關(guān)。耐藥位點(diǎn)基因突變導(dǎo)致病人對核苷類似物產(chǎn)生耐藥后，病人血清的谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平和病毒DNA水平升高，甚至病情惡化。
因此，建立簡單、快速的乙型肝炎病毒耐藥基因突變檢測方法，能夠監(jiān)測上述18 個耐藥基因突變位點(diǎn)中的一個或數(shù)個的突變情況，及時發(fā)現(xiàn)病人的耐藥性情況，從而調(diào)整用藥和治療方案，這對于促進(jìn)乙型肝炎病毒的臨床治療有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種檢測乙型肝炎病毒的多耐藥基因突變位點(diǎn)方法，檢測探針以及檢測試劑盒。本發(fā)明所能夠檢測的乙型肝炎病毒的耐藥基因突變位點(diǎn)列表如下表1乙型肝炎病毒的耐藥基因突變位點(diǎn)列表
核苷類似物藥物相關(guān)的耐藥基因突變位點(diǎn)拉米夫定 (LAM)rtV173L、rtL 179P、rtL 180M、rtA200V、rtM204V、rtM204I、rtM204S、 rtV207M、rtV207K rtV207L、rtS213T阿德福韋酯(ADV)rtA181V、rtA181T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、rtN238T、 rtN238D、rtK241E替諾福韋 (TDF)rtA194T, rtA194M恩替卡韋 (ETV)rtV173L、rtL180M、rtT184A、rtT184G、rtT184I、rtT184S、rtS202G、 rtS202K rtM204V、rtM204K rtM204S. rtM250V替比夫定 (LDT)rtL 18OM、rtM204V、rtM204I、rtM204S恩曲他濱 (FTC)rtV173L、rtL180M、rtM204V, rtM204I、rtM204S本發(fā)明提供了一種乙型肝炎病毒耐藥基因突變的檢測探針，所述的耐藥基因突變位點(diǎn)為 rtV173L、rtL179P、rtL180M、rtA181V/T、rtT184A/G/I/S、rtA194T/M、rtA200V、 rtS202G/I、rtM204V/I/S、rtV207M/I/L、rtS213T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、 rtN238T/D、rtK241E、rtM250V中的任意一種或幾種，所述的檢測探針為5，-TAGGTCTATTTAC AGGCAGTTTTCG-3’。本發(fā)明還提供了一種乙型肝炎病毒耐藥基因突變的檢測試劑盒，所述的耐藥基因突變位點(diǎn)為 rtV173L、rtL179P、rtL180M、rtA181V/T、rtT184A/G/I/S、rtA194T/M、rtA200V、 rtS202G/I、rtM204V/I/S、rtV207M/I/L、rtS213T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、 rtN238T/D、rtK241E、rtM250V中的任意一種或幾種，所述的試劑盒包含有用于擴(kuò)增所述耐藥基因突變位點(diǎn)的PCR試劑和上述的檢測探針，所述的PCR試劑中包含有一對引物，其序列如下正向引物5，-TTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCAC-3，反向引物5，-TAGGTCTATTTACAGGCAGTTTTCG-3，。
再一方面，本發(fā)明還提供了使用上述的檢測試劑盒來檢測乙型肝炎病毒耐藥基因突變的方法，該方法包括以下步驟(1)取空腹受檢者血清進(jìn)行DNA抽提；(2)使用權(quán)利要求2中所述的PCR試劑對步驟(1)所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)將步驟⑵獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶解；(4)將權(quán)利要求1所述的檢測探針與步驟(3)所獲得的酶解產(chǎn)物混合進(jìn)行測序 PCR反應(yīng)；(5)用測序儀對步驟⑷獲得的測序PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，找出所述各耐藥基因突變位點(diǎn)所在位置的對應(yīng)序列，并與所述各耐藥基因突變位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)序列比較，判斷是否發(fā)生突變。本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中，步驟(2)所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為PCR Buffer 2. 5 μ 1、2· 5mM 的 dNTP Mix 2· 5 μ 1、5 IOU 的 Taq 酶 0. 2 μ 1、0· lug/ulDNA 模板 1μ l、10uM 引物各 1μ l、ddH20 16. 8 μ 1 ；所述的引物為權(quán)利要求2中所述的正向引物和反向引物；在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，1 μ 1 DNA模板大約含有IOOngDNA ；反應(yīng)條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 15秒變性，50°C 15秒退火，72°C 2分鐘延長，循環(huán)25次，最后4°C延長5分鐘以上。本發(fā)明的另一個具體實(shí)施方案中，步驟⑷所述的測序PCR的反應(yīng)條件為960C 1分鐘變性和酶激活，96°C 10秒變性，50°C 5秒退火，60°C 4分鐘延長，循環(huán) 25次，最后4°C延長5分鐘以上。所述的測序試劑可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的測序PCR反應(yīng)所需試劑，例如 BigDye Terminator循環(huán)測序試劑盒。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式
中，驟(4)所述的測序PCR的反應(yīng)體系為所述的步驟(3)獲得的酶解產(chǎn)物3 μ l、BigDye Terminator循環(huán)測序試劑1 μ 1和7pm/ul檢測探針 2μ 1。本發(fā)明能夠非常方便地檢測出乙型肝炎病毒耐藥基因突變情況，運(yùn)用1對PCR擴(kuò)增引物，以及一個檢測探針就能檢測出目前所公開的18個乙型肝炎病毒耐藥基因突變位點(diǎn)中的任意一個或數(shù)個。不僅特異性好，并且所有的突變位點(diǎn)檢測均可在一次檢測過程中完成，操作方便，避免了多次操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準(zhǔn)確率。另外，本發(fā)明提供的檢測方法不僅能夠檢測出乙型肝炎病毒耐藥基因突變情況， 還能夠在同一次操作中也檢測出乙型肝炎病毒的基因分型情況，操作簡單、高效率。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1乙型肝炎病毒耐藥基因突變位點(diǎn)檢測1、取空腹受檢者血清進(jìn)行DNA抽提采集空腹受檢者靜脈血1ml，注入無菌1. 5ml離心管中，于室溫靜置2小時，轉(zhuǎn)入 4°C靜置1小時，8000rpm/分離心5分鐘，吸取200 μ 1上清轉(zhuǎn)入另一無菌1. 5ml離心管中， 獲得血清標(biāo)本；(如測定在5日內(nèi)進(jìn)行，標(biāo)本存放于4°C，如果測定時間延遲，標(biāo)本必須存于-20°C。標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)保存4°C以下。)取50 μ 1濃縮液(主要成分聚乙二醇)到確定數(shù)量的0. 5ml離心管中，再加入上述獲得的血清標(biāo)本50 μ 1，振蕩混勻后4°C靜置5分鐘，15000rpm離心10分鐘，吸棄上清。 加入20 μ 1裂解緩沖液(主要成分NaCl)，劇烈振蕩或用槍頭攪碎至無沉淀后短暫離心，沸水浴10分鐘，15000rpm離心5分鐘，取上清液，即獲得本實(shí)施例的檢測用DNA樣本。2、PCR擴(kuò)增反應(yīng)所采用的一對正反向引物如下正向引物5，-TTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCAC-3，反向引物5，-TAGGTCTATTTACAGGCAGTTTTCG-3，。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為PCR Buffer 2. 5 μ 1、2. 5mM 的 dNTP Mix 2. 5μ1、5 IOU的Taq酶0. 2μ 1、DNA模板1μ l(100ng左右)、IOuM正向引物反向引物各1 μ 1、ddH20 16. 8μ 1 ；反應(yīng)條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 15秒變性，50°C 15秒退火，72°C 2分鐘延長，循環(huán)25次，最后4°C延長5分鐘以上。3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶解上述的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取1 μ 1(檢測用DNA樣本濃度彡5X 103IU/ml)，再向其中加入2μ1酶試劑(其中包含2U SAP酶、IU核酸外切酶)后混勻。37°C 60分鐘，80°C 15分鐘，最后4°C保存。4、酶解后產(chǎn)物的測序PCR反應(yīng)該測序PCR反應(yīng)所采用檢測探針為5’ -TAGGTCTATTTACAGGCAGTTTTCG-3，。測序PCR的反應(yīng)體系為步驟3獲得的酶解產(chǎn)物(取陽性)3μ1、測序試劑 (BigDye Terminator循環(huán)測序試劑盒)1 μ 1和7pm/ul檢測探針2 μ 1。反應(yīng)條件為96°C 1分鐘變性和酶激活，96°C 10秒變性，50°C 5秒退火，60°C 4分鐘延長，循環(huán)25次，最后4°C延長5分鐘以上。5、測序以及結(jié)果分析步驟4獲得的測序PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化后，在自動化的基因測序儀(ABI3730) 上進(jìn)行測序。分析測序結(jié)果，找出表1中所述18個耐藥基因突變位點(diǎn)所在位置的對應(yīng)序列， 并與表1中所述18個耐藥基因突變位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)序列比較，判斷是否發(fā)生突變。具體來說，采用測序結(jié)果分析程序Chromas，按Find快捷鍵，找到第173位乙肝病毒耐藥基因突變位點(diǎn)前的保守序列“CTATGGGA”后，按照順序統(tǒng)計(jì)出第173位-第250位之間的18個耐藥基因突變位點(diǎn)序列；將統(tǒng)計(jì)完成的18個耐藥基因突變位點(diǎn)序列與對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)序列比較，找出發(fā)生突變的耐藥位點(diǎn)。檢測結(jié)果參下表2 ；表2實(shí)施例IDNA樣本的乙肝病毒耐藥基因突變位點(diǎn)檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎病毒耐藥基因突變的檢測探針，所述的耐藥基因突變位點(diǎn)為 rtV173L、rtL179P、rtL180M、rtA181V/T、rtT184A/G/I/S、rtA194T/M、rtA200V、rtS202G/I、 rtM204V/I/S、rtV207M/I/L、rtS213T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、rtN238T/D、 rtK241E、rtM250V中的任意一種或幾種，其特征在于，所述的檢測探針為5，-TAGGTCTATTTA CAGGCAGTTTTCG-3’。
2.—種乙型肝炎病毒耐藥基因突變的檢測試劑盒，所述的耐藥基因突變位點(diǎn)為 rtV173L、rtL179P、rtL180M、rtA181V/T、rtT184A/G/I/S、rtA194T/M、rtA200V、rtS202G/I、 rtM204V/I/S、rtV207M/I/L、rtS213T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、rtN238T/D、 rtK241E、rtM250V中的任意一種或幾種，其特征在于，所述的試劑盒包含有用于擴(kuò)增所述耐藥基因突變位點(diǎn)的PCR試劑和權(quán)利要求1所述的檢測探針，所述的PCR試劑中包含有一對引物，其序列如下正向引物5’ -TTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCAC-3，反向引物5’ -TAGGTCTATTTACAGGCAGTTTTCG-3，。
3.—種乙型肝炎病毒耐藥基因突變的檢測方法，其特征在于，該檢測方法使用如權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其包括以下步驟(1)取空腹受檢者血清進(jìn)行DNA抽提；(2)使用權(quán)利要求2中所述的PCR試劑對步驟(1)所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)將步驟(2)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶解；(4)將權(quán)利要求1所述的檢測探針與步驟(3)所獲得的酶解產(chǎn)物混合進(jìn)行測序PCR反應(yīng)；(5)用測序儀對步驟(4)獲得的測序PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，找出所述各耐藥基因突變位點(diǎn)所在位置的對應(yīng)序列，并與所述各耐藥基因突變位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)序列比較，判斷是否發(fā)生突變。
4.如權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，步驟(2)所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為PCR Buffer 2. 5 μ 1、2· 5mM 的 dNTP Mix 2· 5 μ 1、5 IOU 的 Taq 酶 0· 2 μ 1、0· lug/ul DNA 模板 1 μ IUOuM 引物各 1 μ UddH2O 16. 8 μ 1 ；所述的引物為權(quán)利要求2中所述的正向引物和反向引物；反應(yīng)條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 15秒變性，50°C 15秒退火，72°C 2分鐘延長，循環(huán)25次，最后4°C延長5分鐘以上。
5.如權(quán)利要求3或4所述的檢測方法，其特征在于，步驟(4)所述的測序PCR的反應(yīng)條件為960C 1分鐘變性和酶激活，96°C 10秒變性，500C 5秒退火，60°C 4分鐘延長，循環(huán)25次， 最后4°C延長5分鐘以上。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測乙型肝炎病毒的多耐藥基因突變位點(diǎn)方法，檢測探針以及檢測試劑盒。本發(fā)明能夠非常方便地檢測出乙型肝炎病毒耐藥基因突變情況，運(yùn)用1對PCR擴(kuò)增引物，以及一個檢測探針就能檢測出目前所公開的18個乙型肝炎病毒耐藥基因突變位點(diǎn)中的任意一個或數(shù)個。不僅特異性好，并且所有的突變位點(diǎn)檢測均可在一次檢測過程中完成，操作方便，避免了多次操作過程中存在的諸多不確定因素，可大大提高檢測準(zhǔn)確率。另外，本發(fā)明提供的檢測方法不僅能夠檢測出乙型肝炎病毒耐藥基因突變情況，還能夠在同一次操作中也檢測出乙型肝炎病毒的基因分型情況，操作簡單、高效率。
文檔編號C12Q1/70GK102286645SQ20111025427
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月30日
發(fā)明者潘加奎 申請人:解碼(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司