專利名稱：一種真核表達重組質粒及其構建方法與穩(wěn)定表達該質粒的Vero細胞系的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程技術領域，特別涉及一種真核表達重組質粒及其構建方法與穩(wěn)定表達該質粒的Vero細胞系。
背景技術：
犬瘟熱(Canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV) 引起的一種犬科、鼬科等動物易患高度接觸性傳染病。該病是養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)危害最大的傳染病之一，以厭食、雙相熱、結膜炎、胃腸炎和神經(jīng)癥狀為典型特征，可引起大批犬、狐、貉等動物發(fā)病，發(fā)病死亡率為30 80%。近年來，犬瘟熱病毒感染宿主的范圍日益擴大，靈長目的獼猴，鰭足目海豹科的海豹、大熊貓、貓科中大型動物獅子、非洲的野狗等均有報道感染犬瘟熱病毒。在我國，隨著近幾年來軍犬、警犬、實驗用犬和毛皮動物狐、貉等飼養(yǎng)量的大幅度增加以及異地交流的增多，犬瘟熱在犬、狐、貉中的發(fā)病率和致死率均有升高的趨勢，因此犬瘟熱防控顯得尤為重要。病毒分離技術是對犬瘟熱病毒致病機制研究的重要手段，但具有囊膜的犬瘟熱病毒不易在環(huán)境中存活，因此難以用普通方法分離成功。目前，針對犬瘟熱病毒野毒株的分離一般通過易感動物肺巨噬細胞與Vero或MCDK等傳代細胞系共培養(yǎng)的方法，但此類方法存在操作復雜、耗費時間長和分離得到病毒效價不穩(wěn)定等缺點外，而且由于以上傳代細胞為犬瘟熱病毒非敏感細胞，對于分離到的犬瘟熱病毒很可能在適應細胞的過程中發(fā)生了毒力基因的突變，造成病毒株的致弱。由于犬瘟熱病毒(尤其強毒株)在體外培養(yǎng)時缺乏敏感且適用的細胞或細胞系，造成犬瘟熱病毒分離成功率較低(一般低于20% )，嚴重阻礙了對犬瘟熱病毒病原學生物學及致病機制方面的研究。2001年，Tatsuo等將⑶V野毒株在人工表達犬信號淋巴細胞激活分子(SLAM又稱⑶150)的CHO細胞上感染，試驗證實犬的SLAM為⑶V感染的受體，⑶V H蛋白通過識別 SLAM而吸附到細胞表面起始病毒的感染過程。2003年，Seki等應用建立的穩(wěn)定表達犬SLAM 的Vero細胞系(Vero. DogSLAMtag)較Vero和B%a細胞更快速且敏感地從疑似犬瘟熱病犬體內分離到犬瘟熱病毒。由于Vero. DogSLAMtag中表達的tag標簽為禽流感病毒HA蛋白的抗原表位，因此對該陽性Vero細胞系鑒定需要借助針對該表位的單克隆抗體進行免疫印跡或間接免疫熒光方法。因此，從該細胞系的構建立及鑒定所用方法較為繁瑣。此外， 由于該陽性Vero細胞系中犬SLAM表達量較低，造成病毒分離的敏感性不高，直接影響了犬瘟熱病毒的分離效率。2010年，趙建軍等成功克隆了狐、貉和水貂的SLAM基因，并證實其均能作為犬瘟熱病毒感染的受體。因此，構建一種高效表達且病毒嗜性敏感的SLAM基因的重組質粒并導入Vero細胞中，獲得穩(wěn)定表達該SLAM基因的Vero細胞系，對于快速且敏感的分離犬瘟熱病毒及其對其致病機制研究具有現(xiàn)實意義。

發(fā)明內容
有鑒于此，本發(fā)明提供一種真核表達重組質粒及其構建方法與穩(wěn)定表達該質粒的 Vero細胞系。該真核表達重組質粒具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列。應用該Vero細胞系，可以對犬瘟熱病毒強毒株進行高效分離及應用于犬瘟熱病毒致病機制的研究中。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案本發(fā)明提供了一種真核表達重組質粒具有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列。該真核表達重組質粒，由GeneBank登錄號為EU678639的貉SLAM基因(rSLAM)、編碼6個組氨酸(6 Xhis)的核苷酸序列和Kozak序列的融合基因，Pcmv, IRESjEGFP和SV40pA 組成，如圖15所示。其中，所述質粒的5’至3’端依次為Pcmv，所述融合基因，IRES，EGFP 和SV40pA，如圖13所示。Kozak序列，為存在于真核生物mRNA的一段序列，在翻譯的起始中有增強蛋白表達量的作用。真核生物基因中起始密碼子上、下游的最佳序列為，-3位為嘌呤堿基；+4位為G，起始密碼子AUG中的A處于+1位。作為優(yōu)選，所述Kozak序列具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。本發(fā)明采用真核表達載體PIRES2-EGFP，購自美國Clontech公司，真核表達載體 PIRES2-EGFP為一種雙元表達載體，在多克隆位點(MCQ處插入的目的基因和EGFP在CMV 啟動子下共表達，既能對表達進行監(jiān)控(通過熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達來反應目的蛋白的表達情況)，又能很好地保持目的蛋白本身生物學特性。該表達載體含有(1)用于克隆外源基因的多克隆位點MCS ；(2)允許一條mRNA分子上的兩個編碼基因得到分宜的人腦心肌炎病毒核糖體內部進入位點IRES ；(3)使用增強型綠色熒光蛋白基因EGFP ；(4)使mRNA分子加上polyA尾巴的SV40polyA信號區(qū)；(5) Pcmv使后面的外源基因和EGFP基因組成型表達。經(jīng)Bio I和EcoR I雙酶切后,得到 Pcmv，IRES, EGFP 和 SV40pA。真核表達載體pIRES2-EGFP的序列具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列，環(huán)狀圖譜見圖14。其中，Pcmv具有SEQ ID NO 6所示核苷酸序列，IRES具有SEQ ID NO 7所示核苷酸序列，EGFP具有SEQ ID NO :8所示核苷酸序列，SV40pA具有SEQ ID NO :9所示核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種真核表達重組質粒的制備方法，包括步驟1 以克隆有rSLAM的質粒pMD18_T_rSLAM為模板，在上游引物、下游引物的存在下擴增獲得所述融合基因，所述上游引物序列如SEQ No. 2所示，所述下游引物序列如 SEQ No. 3 所示；步驟2 :pIRES2-EGFP 載體經(jīng)酶切，獲得 Pcmv、IRES、EGFP 和 SV40pA。步驟3 取所述融合基因酶切后，與步驟2中所述Pcmv、所述IRES、所述EGFP和所述SV40pA連接，轉化受體菌，鑒定陽性克隆，獲得所述質粒。以質粒pMD18-T_rSLAM為模板，以序列如SEQ No. 2所示的P1 5，-CCG ICTCGAGjGCCACC ATGGATTCCAGGGGCTTCCTC-3，為上游引物，以序列如 SEQNo. 3 所示的 p2 :5，-ccg |gaattc| tcagtgatggtgatggtgatggctctctgggaacgtcac-3’ 為下
游引物(方框為限制酶切位點，加粗的為Kozak序列，下劃線為組氨酸標簽基因)；進行PCR 擴增，以獲得目的基因。反應體系可以為=DNA模板1 μ L(0. 2ng/ μ L)，上下游引物各1 yL(20pmoL/L)，Ex taq 酶 0. 3 μ L (5U/ μ L)，dNTP (各 2. 5mmol/L) 2 μ L，10 X PCRbuffer 2. 5 μ L, ddH20 補足 25 μ L0 擴增程序為95°C預變性 5min ；95°C變性 30s, 61. 8°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，35 個循環(huán)；72°C總延伸IOmin ；4°C保存lOmin。PCR產物通過1 %瓊脂糖凝膠回收，然后連入到 pMD18-T-simple載體，酶切鑒定。作為優(yōu)選，所述酶切為β ο i和ecor i雙酶切。所述貉SLAM基因由所述質粒pMD18-T_rSLAM分別經(jīng)Xho I和EcoR I雙酶切獲得。所述Pcmv，IRES, EGFP 和 SV40pA 由 pIRES2_EGFP 載體經(jīng) Xho I 和 EcoR I 雙酶切獲得。一種Vero細胞系，Vero細胞基因組中克隆有上述真核表達重組質粒基因，細胞表面能穩(wěn)定表達有犬瘟熱病毒受體貉SLAM(rSLAM)。Vero細胞系的構建方法可以為設計1對引物以克隆有貉SLAM基因的 pMD18-T-rSLAM質粒為模板，通過PCR方法獲得Kozak序列+貉SLAM+6 Xhis融合基因后， 構建 pIRES2-EGFP-rSLAMhis 質粒；將所述 pIRES2_EGFP_rSLAMhis 質粒轉染 Vero 細胞，通過觀察EGFP表達及采用G418壓力培養(yǎng)克隆篩選穩(wěn)定表達SLAM的Vero細胞系。本發(fā)明還提供了上述Vero細胞系在犬瘟熱強毒株快速、敏感地分離和犬瘟熱病毒研究中的應用。本發(fā)明通過構建并轉染真核表達重組質粒pIRES2-EGFP_rSLAMhis (由GeneBank 登錄號為EU678639的貉SLAM基因、編碼6個組氨酸的核苷酸序列和Kozak序列的融合基因，Pcmv, IRES, EGFP和SV40pA組成，其中，所述質粒的5，至3，端依次為Pcmv，所述融合基因，IRES，EGFP和SV40pA。)到Vero細胞系，通過克隆篩選獲得表面穩(wěn)定、高表達量的犬瘟熱病毒受體rSLAM的Vero細胞，進而接種含犬瘟熱病毒的組織樣品分離病毒，接毒試驗結果表明，轉染rSLAM后的Vero細胞增強了對CDV的敏感性，能夠有效分離犬瘟熱毒株。本發(fā)明同時提供了由上述Vero細胞系分離得到的犬瘟熱強毒株LN(IO)H株。本發(fā)明提供一種真核表達重組質粒及其構建方法，以及穩(wěn)定表達該質粒的Vero 細胞系。為了加強目的蛋白基因(rSLAM)的翻譯效率，便于蛋白表達的檢測，本發(fā)明設計引物時，在rSLAM基因的上游和下游分別引入了 Kozak序列。本發(fā)明在要表達蛋白的羧基端引入6個組氨酸標簽，便于應用組氨酸標簽單抗(該單抗在國內外已商品化)用Western blot和細胞免疫組化對SLAM蛋白的表達進行半定量評價，對于構建穩(wěn)定表達細胞系的鑒定具有重要作用。Kozak序列在質粒表達時可以顯著提高SLAM蛋白的表達量，有利于提高cdv與其結合效率，使表達細胞系病毒的分離效率提高。本發(fā)明采用真核表達載體 PIRES2-EGFP，為一種雙元表達載體，插入的目的基因和EGFP在CMV啟動子下共表達，既能對表達進行監(jiān)控，又能很好地保持目的蛋白本身屬性，可以在細胞篩選初期通過綠色熒光蛋白定位陽性細胞，并進行表達蛋白細胞的單克隆化挑選，結合G418抗性篩選，提高篩選的成功率。將pIRES2-EGFP-rSLAMh質粒轉染到Vero細胞中，待轉染細胞生長48h，發(fā)現(xiàn) pIRES2-EGFP-rSLAMh質粒轉染后，EGFP的表達率較高。連續(xù)篩選10代后，EGFP依然表達。
本發(fā)明通過針對6個組氨酸標簽的細胞免疫組化成功檢測到轉染后SLAM融合蛋白的表達，通過瞬時轉染Vero細胞的接毒實驗，證明轉染SLAM后確實增強了細胞對CDV的敏感性，也同樣說明在SLAM的C’端融合6個His標簽蛋白并沒有使SLAM蛋白失去與CDV H蛋白的識別和結合能力。為穩(wěn)定轉染細胞的建立的可行性提供可靠的實驗基礎。轉染組細胞連續(xù)篩選10代后，用細胞免疫組化細胞內檢測到SLAM融合蛋白的表達，同時也能檢測到EGFP蛋白的表達。由繪制的轉染細胞(V-p-rSLAMh細胞)和未轉染Vero細胞的生長曲線，可計算Vero細胞和V-p-rSLAMh細胞的細胞倍增時間，Vero細胞的倍增時間最短為 16. 69h，V-p-rSLAMh細胞的倍增時間大于16. 69h，說明表達外源蛋白后的細胞的生長速度變慢，表達外源蛋白增加細胞的代謝負擔加重，生長速度變自然變慢，另外V-p-rSLAMh細胞在外型上大小上較Vero細胞大。本發(fā)明成功建立穩(wěn)定表達貉SLAM的Vero細胞系，對于 CDV的快速分離和研究平臺的建立具有重要意義。用V-p-rSLAMh細胞和Vero細胞分別接種3份來源死亡狐貍或貉犬瘟熱疑似組織樣品，V-p-rSLAMh細胞在接種第一代36 48h即可形成可見典型⑶V CPE,而Vero細胞連續(xù)盲傳6代仍未見CPE的形成。證實V-p-rSLAMh細胞較Vero細胞對⑶V敏感。經(jīng)RT-PCR 驗證所分離到的3株毒均為CDV，對分離的3株CDV H基因克隆測序后比對，結果表明3毒株CDV均為Asia-I基因型野毒株；以其中1株[命名為LN(IO) fl株]在V-p-rSLAMh細胞連傳4代后進行動物攻毒實驗驗證其毒力強弱，以4X 102_39TCID5tl/只的攻毒劑量可使攻毒組的貉和狐貍(每種動物各3只)全部死亡。證實經(jīng)V-p-rSLAMh細胞分離的⑶V保持其強毒毒力，對接種動物的致死率可達100%。本發(fā)明建立了穩(wěn)定表達貉SLAM受體的Vero細胞系，并對表達貉SLAM受體的Vero 細胞系穩(wěn)定性及對CDV敏感性進行了系統(tǒng)的評價，證實該細胞系目的基因表達穩(wěn)定，對CDV 病毒敏感，分離得到⑶V毒力較強。穩(wěn)定表達貉⑶V SLAM的Vero細胞系的建立，為⑶V的分離和研究提供了一個平臺。此外，預防CD的疫苗研制過程中，疫苗效力評定中毒力穩(wěn)定的CDV強毒不可或缺，LN(IO) Π株CDV細胞強毒的獲得，將提供高效疫苗的評價工具，對CD 的防疫具有重大意義。


圖1示PCR后膠回收rSLAM目的片段；其中，泳道1為IOObp DNA Ladder Marker, 泳道2為以質粒pMD18-T-rSLAM為模板經(jīng)PCR擴增后的目的片段，大小約為1 IOObp。圖2示重組表達載體酶切鑒定結果；其中，泳道1為IOObp DNALadder Marker,泳道2為DL15000DNA Ladder Marker,泳道3為pIRES2_EGFP_rSLAMh經(jīng)雙酶切生成大小約為 IlOObp 和 5300bp 兩條帶。圖3示G418工作濃度的確定；其中，圖3(a)為無G418的Vero細胞；圖3 (b)為含 200 μ g/mL G418 的 Vero 細胞；圖 3 (c)為含 600 μ g/mL G418 的 Vero 細胞；圖 3 (d)為含 800 μ g/mL G418 的 Vero 細胞。圖4示重組質粒瞬時轉染Vero細胞48h后EGFP的表達；其中，圖4(a)為未轉染的 Vero 細胞；圖 4 (b)為 pIRES2_EGFP 轉染的 Vero 細胞；圖 4 (c)為 pIRES2_EGFP_rSLAMh 轉染的Vero細胞。圖5示重組質粒瞬時轉染Vero細胞后⑶V接毒60h細胞病變(CPE)；其中，圖5 (a)為未轉染的Vero細胞；圖5(b)為pIRES2_EGFP轉染的Vero細胞；圖5 (c)為 pIRES2-EGFP-rSLAMh轉染的Vero (箭頭指示細胞病變位置)。圖6示將轉染48h的Vero細胞，換G418含量為800 μ g/mL的10% FBS的篩選培養(yǎng)基，篩選培養(yǎng)10天左右，用胰酶消化細胞后按1 40傳至IOOmm的細胞培養(yǎng)皿，繼續(xù)加篩選培養(yǎng)基篩選得到轉染的Vero細胞簇。圖7示細胞免疫組化檢測結果；其中，圖7 (a)為Vero細胞，圖7 (b)為轉染空載體的Vero細胞，圖7 (c)為轉染重組質粒Vero細胞(示SLAMh蛋白表達)。圖8示轉染細胞與未轉染細胞的生長曲線；其中，+示Vero細胞，+示 pIRES2-EGFP-rSLAMh 轉染后的 Vero 細胞(V-p-rSLAMh 細胞)。圖9示接毒后的細胞病變；其中，圖9(a)為接毒后的Vero細胞，圖9 (b)為接種 JL(10)rl 株 CDV 48h 的 V-p-rSLAMh 細胞， 9(c)為接種 HeB(IO)H 株 CDV 48h 的 V-p-rSLAMh 細胞，圖 9 (d)為接種 LN(IO) Π 株 CDV 24h 的 V-p-rSLAMh 細胞。圖10示V-p-rSLAMh細胞分離CDV的RT-PCR擴增結果。其中，泳道1為IOObp DNALadder Marker,泳道 2 為 JL (10) rl 株，泳道 3 為 HeB (10) fl 株，泳道 4 為 LN (10) fl 株， 泳道5為陽性對照。圖11示攻毒和對照貉的體溫；其中，+示1號貉的體溫，+示2號貉的體溫，+ 示3號貉的體溫，+示對照貉的體溫。圖12示攻毒和對照狐貍的體溫；其中，+示1號狐貍的體溫，+示2號狐貍的體溫，.示3號狐貍的體溫，+示對照狐貍的體溫。圖13示真核表達載體pIRES2-EGFP圖譜。圖14示真核表達載體pIRES2-EGFP環(huán)狀圖譜。圖15示本發(fā)明提供的真核表達重組質粒圖譜。
具體實施例方式本發(fā)明公開了一種真核表達重組質粒及其構建方法，以及穩(wěn)定表達該質粒的Vero 細胞系，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是， 所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發(fā)明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。真核表達載體pIRES2-EGFP購自美國Clontech公司；限制性內切酶BioI、EcoR I載體購自寶生物(大連)有限公司；Vero細胞為中國農業(yè)科學院特產研究所預防獸醫(yī)研究室保存；Midipr印High-pure質粒提取試劑盒購于hvitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基購自 Gibco BRL 公司；G418 購自 Promega 公司；轉染試劑FuGENE :HD Transfection Reagent 購自Roche公司；His.Tag Monoclonal Antibody購自Novagen公司；細胞免疫組化試劑盒SP kit (Mouse)購自北京博奧森生物技術有限公司；Trizol購自美國hvitrogen公司； 倒置熒光顯微鏡購(DMI3000B)自德國徠卡公司；疑似犬瘟熱狐貍組織樣品為中國農業(yè)科學院特產研究所預防獸醫(yī)研究室保存。下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明
實施例1構建真核表達重組質粒pIRES2-EGFP-rSLAMhPCR擴增與基因克隆以質粒pMD18-T_rSLAM為模板，以P1S，-CCG ICTCGAGjGCCACC ATGGATTCCAGGGGCTTCCTC-3，為上游引物，以 p25’ -ccg Igaatt^ tcagtgatggtgatggtgatggctctctgggaacgtcac-3’ 為下游引物(方框
為限制酶切位點，加粗的為Kozak序列，下劃線為組氨酸標簽基因)，進行PCR擴增，以獲得目的基因，反應體系為:DNA模板1 μ L(0. 2ng/ μ L)，上下游引物各1 μ L(20pmol/L),Ex taq 酶 0· 3 μ L (5U/ μ L)，dNTP (各 2. 5mmol/L) 2 μ L，10 X PCR Buffer 2. 5 μ L, ddH20 補足 25 μ L。擴增程序為95°C預變性5min ；95°C變性 30s,61. 8°C退火 lmin，72°C延伸 lmin， 35個循環(huán)；72°C總延伸IOmin ；4°C保存lOmin。PCR產物通過1 %瓊脂糖凝膠回收，然后連入到pMD18-T載體，酶切鑒定。以稀釋后質粒pMD18-T-rSLAM為模板，PCR擴增目的片段，所得的目的片段經(jīng)1 % 的瓊脂糖膠回收純化，經(jīng)的瓊脂糖，IOOV電壓下電泳45min，在紫外透射儀下可見到預期大小約為IlOObp的條帶，ImageQuant 3000凝膠成像系統(tǒng)(GE公司)采集圖像，如圖1所
7J\ ο真核表達載體的構建質粒pMD18-T_rSLAMh用BioI和EcoRI雙酶切，膠回收目的片段在T4連接酶的作用下插入到經(jīng)BioI和EcoRI雙酶切的pIRES2_EGFP膠回收的載體片段。將連接的載體轉化到克隆菌株DH5 α中，涂在有卡納青霉素(30yg/mL)抗性的LB平板上；培養(yǎng)24h后，無菌挑單克隆菌株于3 4mL有卡納青霉素(30 μ g/mL)抗性的液體LB 的試管中，將試管放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱(37°C，200r/min)過夜；用質粒提取試劑盒(杭州博日)按說明書操作提取質粒。酶切鑒定PIRES2-EGFP-rSLAMh重組質粒經(jīng)雙酶切生成大小約為1 IOObp和 5300bp兩條帶。結果如圖2所示，表明成功構建真核表達質粒，pIRES2-EGFP-rSLAMh連入目的片段。將構建的真核表達質粒送生物公司測序，序列具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列。實施例2建立穩(wěn)定表達pIRES2-EGFP_rSLAMh的Vero細胞系G418最適濃度的確定復蘇的Vero細胞用10 % FBS的DMEM傳2 3代后，把要傳代的細胞胰酶消化，按每孔IX IO4個/孔的量鋪96孔板，第2日鋪滿板后吸除培養(yǎng)基，PBS 洗細胞一次，加篩選培養(yǎng)基。G418的濃度依次為0、200、300、400、500、600、700、800、900、 1000 μ g/mL,每個梯度設3個重復，每3天左右視培養(yǎng)基的顏色，換篩選培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)10 天，每天觀察細胞死亡情況，以第10天細胞全部死亡的最低的G418濃度為最適篩選濃度。 加不同濃度G418的Vero細胞，第2天篩選組均有少量細胞死亡；篩選8天時，800 μ g/mL 組有95 %的細胞死亡，900 μ g/mL組有99 %的細胞死亡，1000 μ g/mL的100 %細胞死亡；篩選10日(見圖幻，200 μ g/mL組有40 %的細胞死亡，600 μ g/mL組也有90 %的細胞死亡， 800 μ g/mL以上組細胞都死亡，確定Vero細胞G418最適的篩選濃度為800 μ g/mL。轉染用高純度質粒的制備將pIRES2-EGFP和實施例1制得的 pIRES2-EGFP-rSLAMh的菌種，分別接于IOOmL Kan抗性的LB培養(yǎng)液中，37°C，200r/min,過夜。用Midipr印High-pure質粒提取試劑盒按操作說明書，純化提取雙表達載體。按照按說明書操作步驟提取質粒。細胞瞬時轉染將生長狀態(tài)良好的細胞以每孔IXlO5個細胞的密度鋪6孔板(6孔分別設置為未轉染質粒組、轉染PIRES2-EGFP空載體組、轉染pIRES2_EGFP_rSLAMh組，轉染空載體和重組質粒的Vero細胞分別命名為V-p和V-p-rSLAMh)，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，當細胞匯合度約為80%時按照以下操作步驟進行細胞轉染轉染前把無血清的DMEM、純化質粒和轉染試劑放在室溫環(huán)境；在1. 5mL無菌無硅化的EP管中加入100 μ L無血清和抗生素的DMEM，然后加入2μ g的質粒充分混勻，使用無硅化移液槍頭的移液器，懸空滴入9 μ L的HD Transfaction Reagen (加轉染試劑前混勻)，顛倒混勻；室溫孵育15min， 以便形成轉染復合物；將EP管內的轉染復合物逐滴加入到對應的6孔板中，在滴加過程中輕輕轉動6孔板以確保轉染復合物均勻的分布于細胞表面；37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h 后，熒光顯微鏡下采集圖像。如圖4(a)至圖4(c)，發(fā)現(xiàn)pIRES2-EGFP-rSLAMh質粒轉染后， EGFP的表達率較高。轉染該重組質粒組的接種⑶V后60h即可看到明顯的CPE，未轉染組和轉染空質粒組的Vero沒有出現(xiàn)可見的CPE，見圖5 (a)至圖5 (c)，由此可見轉染后rSLAM 的表達可顯著提高CDV對細胞的易感性。瞬時轉染后SLAM表達的驗證將轉染后的細胞板在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)4 后，熒光顯微鏡觀察后， 選擇一板細胞每孔接種200 μ L處理的犬瘟熱狐貍臟器毒LN(IO) f 1株(吸附Ih后換2% FBS的DMEM細胞維持液)，接種后每天觀察是否出現(xiàn)典型CDV感染的細胞病變情況。臟器病毒的處理過程如下取病變嚴重的肺組織放入研缽中，用小剪刀將組織絞碎，加少量石英砂和PBS在冰上迅速研磨；病料與PBS之比約為1 5(g/mL)，放入_80°C冰箱凍融一次；4°C，3000r/ min離心30min后，取上清用0. 22 μ m的濾器過濾除菌；接毒前將細胞的培養(yǎng)液吸掉后，用 PBS洗滌3次，每孔接毒200 μ L吸附Ih后，加含2% FBS的DMEM的細胞維持液。穩(wěn)定表達SLAM細胞的克隆篩選采用G418壓力選擇和細胞克隆環(huán)相結合的進行穩(wěn)定轉染細胞克隆篩選。將轉染后細胞板在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天后換含800 μ g/ mL G418的10% FBS的DMEM篩選培養(yǎng)基，每天觀察細胞的生長狀態(tài)，每3天換新的的篩選培養(yǎng)基，直至對照孔細胞99%以上都死掉，用0.25%的胰酶消化細胞，按1 30的稀釋度傳IOOmm大板。用含800 μ g/mL G418的10% DMEM的篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3天換新的的培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)10天左右，熒光顯微鏡下觀察蛋白表達情況，用記號筆標出有綠色熒光且是細胞簇的位置，用克隆環(huán)消化該位置細胞轉入IOOmm的大板，如此反復操作3 4次，即可得到較純的穩(wěn)定表達的細胞。在細胞的傳代的過程中每間隔5代凍存細胞。將轉染4 的Vero細胞，換G418含量為800 μ g/mL的10% FBS的篩選培養(yǎng)基，每 3天換一次篩選培養(yǎng)基，篩選培養(yǎng)10天左右，正常對照細胞全部死掉，按用胰酶消化細胞后按1 40傳至直徑IOOmm的細胞培養(yǎng)皿，繼續(xù)加篩選培養(yǎng)基篩選轉染的Vero細胞。在顯微鏡下可見到有細胞簇形成(如圖6所示)。熒光顯微鏡觀察，用記號筆將有細胞簇形成且有大量EGFP表達的標記用克隆環(huán)消化后，在6孔板內篩選培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)3-4次即可得比較純的克隆細胞系。將得到的細胞系標記好代次凍存，V-p和V-p-rSLAMh組連續(xù)篩選了 10代后，EGFP依然穩(wěn)定表達。穩(wěn)定表達細胞系SLAM蛋白表達的驗證將穩(wěn)定轉染的表達不同受體的細胞與正常細胞和空載體的細胞鋪6孔板。用細胞免疫組化技術來驗證穩(wěn)定細胞系蛋白的表達。細胞培養(yǎng)3 4d后，PBS 37°C孵育30min ；用2mL甲醇4°C，4h，固定；PBS沖洗!BminX 3次，甲醇沖洗:3minX3次；室溫干燥后，用Tween-20的PBS沖洗!BminX3次；3% H2O2的去離子水孵育10 15min，以消除內源過氧化物酶的活性；用封閉液室溫孵育10 15min，傾去勿洗；滴加1 1200稀釋的組氨酸一抗，37°C孵育2 池或4°C過夜；PBS沖洗，3minX3 次；滴加生物素標記山羊抗小鼠IgG室溫或37°C孵育10 15min ；PBS沖洗，3minX3次； 滴加辣根酶標記的卵白素，室溫或37°C孵育10 15min ；PBS沖洗，3minX3次；DAB顯色劑顯色5 15min，PBS充分沖洗；蘇木精復染；PBS沖洗干凈，顯微鏡觀察。篩選5代轉染組細胞和未轉染Vero細胞鋪6孔板，Vero細胞正常DMEM培養(yǎng)基，轉染組用篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中3天，用細胞免疫組化試劑盒SP kit (Mouse)檢測目的蛋白表達，結果在轉染組細胞內都檢測有棕黃色沉淀生成，證明有 SLAM的表達，見圖7 (c)，而在Vero細胞組和空載體組，見圖7 (a)和圖7 (b)，沒有棕黃色沉淀生成。繪制細胞生長曲線復蘇凍存穩(wěn)定篩選2代的表達犬瘟熱病毒受體的細胞與正常的Vero細胞，傳2代后，鋪M孔板，每24h或1 細胞計數(shù)一次，根據(jù)計數(shù)結果繪制細胞生長曲線，見圖8。在72 10 間各組細胞生長旺盛；過10 后Vero細胞開始減少。實施例3細胞系對⑶V的敏感性比較當Vero和V-p-rSLAMh細胞生長狀態(tài)好的時候，用兩種細胞鋪六孔板(丹麥Nunc公司)中各3個孔，Vero細胞用10% FBS的DMEM細胞生長液，V-p-rSLAMh細胞生長液中還加入了 800 μ g/mL的G418，在37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 后，分別進行吸附接毒，V-p-rSLAMh細胞的維持液中還含有800 μ g/mL的G418，每 1 觀察細胞的病變情況。接種的3種野毒株分別是2010年河北狐貍臟器毒[HeB(10)fl]； 2010年吉林九臺貉臟器毒[JL(10)rl] ；2010連寧錦州狐貍臟器毒[LN(IO) fl) ]0以上3份犬瘟熱樣品經(jīng)RT-PCR檢測均為犬瘟熱病毒核酸陽性。對沒有出現(xiàn)病變的細胞進行盲傳，盲傳6代仍未出現(xiàn)CPE的視為陰性。兩種細胞對3株野毒株的分離結果V-p-rSLAMh細胞接毒第一代36 48h，3株野毒株都出現(xiàn)明顯的細胞融合CPE。 LN(IO) fl在36h即出現(xiàn)明顯的CPE，而其余2株都在48h出現(xiàn)明顯的CPE，見圖9(b)、圖 9 (c)、圖 9 (d)。Vero細胞3株野毒株在第一代中未出現(xiàn)可見CPE，此后細胞盲傳6代仍未見CPE， 視為病毒分離陰性。見圖9(a)分離病毒的RT-PCR驗證及H基因序列分析由V-p-rSLAMh細胞分離到的3株CDV，凍融后分別提病毒RNA，反轉錄cDNA， RT-PCR驗證，證實分離到的3株病毒都為⑶V，如圖10所示。引物的設計與合成根據(jù)Genbank上發(fā)表的⑶V N和H基因序列分別在其保守區(qū)設計一對檢測引物，擴增片度為430bp，上游引物(Pl) :5’-ACCAGACAAAGTTGGCTAWGGAT-3’， 下游弓I 物(P2) :5，-ATGCTTGGTATTACCTCTACTAACTTG-3，；一對擴增引物，擴增長度為 1879bp，上游引物(P3) :5，-TTAGGGCTCAGGTAGTCCA-3，，下游引物(P4) 5，-CTAAGKCCAATTGARATGTGT-3，，設計的引物由大連寶生物工程有限公司合成。
病毒RNA的提取、cDNA的合成和PCR擴增用Trizol法按說明書對提?、荲病毒 RNA，接著反轉錄合成cDNA，反轉錄系統(tǒng)如下
5 xRT Buffer6\\L·IOmMdNTPΙΟμΜ -merRnase 抑制劑(HPRI)AMV反轉錄酶(IOU/uL)IpLRNA模板IOpLDEPC處理的水
42 0C 2h以cDNA為模板應用PCR擴增特異片段，PCR反應體系為DNA模板1 μ L、上下游引物各 lyU20pmol/L)、Ex Taq DNA 聚合酶 0. 3 μ LUOXPCR Buffer2. 5 μ L, dNTP(各 2. 5mmol/L) 2 μ L，用 ddH20補足 25 μ L。PCR擴增程序95°C預變性 5min，94°C變性 30s，52°C 退火40s(aiiin)，72°C延伸40s(aiiin)，35個循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0 的瓊脂糖鑒定 PCR產物。將PCR擴增產物膠回收后，分別將其克隆入pMDIS-T載體。酶切鑒定后每個片段挑取3個陽性克隆送大連寶生物公司測序，以確定一致序列。CDV H序列分析將測序正確的H基因，用DNAMar軟件MegAl ign/Clustal W與 GenBank登錄的其他CDV毒株基因序列進行比較分析并構建系統(tǒng)進化樹，并應用NetNGlyc 1. OServer軟件來預測的H蛋白潛在N-連接糖基化位點。V-p-rSLAMh 細胞分離到的 LN (IO)H、[JL(IO) rl]禾口 [HeB(IO)H]株 CDV 的 H 基因序列與其他毒株序列比對后表明3株病毒均為CDV，且都屬于Asia-I基因型野毒株。H基因潛在的N-連接的糖基化位點個數(shù)，野毒株一般有8 9個，疫苗株有4個(Onderstepoort) 或7個(⑶V3)，309 311位的N-連接糖基化位點是野毒株特有的糖基化位點，所擴增的3 株CDV H基因含有包括309 311位在內共有9個糖基化位點，符合致病性野毒株(強毒株)的特征。其中LN(IO)H株H基因核苷酸序列與疫苗株Onderst印oort(AF305419)和 ⑶V3的同源性僅為91.2%，而與Asia-I基因型的HBF-I野毒株(EU325721)的同源性為 98. 4%。證實所分離到的LN(IO)H株⑶V為Asia-I基因型的野毒株。⑶V病毒含量的測定選擇生長狀態(tài)良好的V-p-rSLAMh細胞，用0. 25%胰酶消化后，用含10%的FBS的DMEM生長液(含有800 μ g/mL的G418)將細胞濃度為3X 105/mL。 用排槍以每孔100μ L加到96孔板中。將培養(yǎng)板置于5% CO2培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)12_18h， 使細胞長成單層。將待測病毒用含2% FBS的DMEM維持液10倍系列稀釋，使病毒的液濃度分別為KT1 10_6。棄去培養(yǎng)板生長液，各孔細胞用PBS液洗滌2次，從病毒液從10_2稀釋度開始，每孔加入不同稀釋度的病毒液100 μ L，每個稀釋度8孔一個重復，剩兩排一排做陽性對照，一排做未加病毒液正常對照，37 °C吸附Ih后，各孔再加入維持液(含有800 μ g/mL 的G418)100yL，輕輕搖勻后，37°C、5%C02培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)。逐日觀察各孔細胞病變，連續(xù)觀察5天，用Reed-Munch法計算TCID5(1。
LN(IO) f 1株動物攻毒實驗將分離到的LN(IO) f 1株在V_p_rSLAMh細胞連續(xù)傳4 代，將細胞凍融2次用來狐貍(貉)攻毒，攻毒前測定病毒含量。選5只犬瘟熱病毒中和抗體陰性(小于1 4)的狐貍(貉)，3只實驗組，2只作為對照組。采用皮下多點注射的方式，對實驗組每狐貍(貉)的攻毒，攻毒劑量為4X IO2 39TCID5tl/只，對照組皮下多點注射同樣劑量的DMEM營養(yǎng)液。每日上午測定每只狐貍(貉)的體溫，且觀察記錄每只狐貍(貉) 的狀態(tài)。攻毒貉臨床癥狀攻毒組從4天開始，體溫開始升高到39. 5°C以上，在5 9天體溫達到最高(41°C 以上)，隨后2、3貉體溫下降，2號貉11天開使體溫又開始上升，如圖11所示，攻毒貉在 11 13天死亡。對照組貉試驗全程體溫正常(39. 50C以下)。攻毒狐貍臨床癥狀狐貍攻毒的病程較長，攻毒組從4天開始，體溫開始升高到40°C以上，3號狐貍在第10天的肛門拭子CDV陽性；第12 13天，攻毒組都開始出現(xiàn)食欲下降，有結膜炎，拉血便、鼻干、足墊有嚴重增厚發(fā)炎；3只攻毒狐貍第18 22天死亡，對照組食欲和精神狀態(tài)良好，體溫正常(39. 5°C以下)，如圖12所示。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種真核表達重組質粒，其特征在于，具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列。
2.如權利要求1所述質粒的制備方法，其特征在于，包括步驟1 以pMD18-T-rSLAM質粒為模板，在上游引物、下游引物的存在下擴增獲得所述融合基因，所述上游引物序列如SEQ No. 2所示，所述下游引物序列如SEQ No. 3所示； 步驟 2 :pIRES2-EGFP 載體經(jīng)酶切，獲得 Pcmv、IRES、EGFP 和 SV40pA ； 步驟3 取所述融合基因酶切后，與步驟2中所述Pcmv、所述IRES、所述EGFP和所述 SV40pA連接，轉化受體菌，鑒定陽性克隆，獲得所述質粒。
3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述酶切為B10I和EcoR I雙酶切。
4.一種Vero細胞系，其特征在于，Vero細胞中轉染如權利要求1所述的真核表達重組質粒后，經(jīng)克隆及篩選，獲得細胞表面穩(wěn)定表達有犬瘟熱病毒受體貉SLAM的細胞系。
5.如權利要求4所述的Vero細胞系在犬瘟熱強毒株的分離及其在犬瘟熱病毒研究中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程技術領域，具體涉及一種真核表達重組質粒及其構建方法與穩(wěn)定表達該質粒的Vero細胞系。該真核表達重組質粒具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列。應用穩(wěn)定表達該質粒的Vero細胞系，可以對犬瘟熱病毒強毒株進行高效分離及用于犬瘟熱病毒致病機制的研究。
文檔編號C12N5/10GK102321661SQ201110257669
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月1日 優(yōu)先權日2011年9月1日
發(fā)明者趙建軍, 閆喜軍, 閆如勛 申請人:中國農業(yè)科學院特產研究所