專利名稱：人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的制備方法，尤其涉及利用重組桿狀病毒在昆蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)人乳頭瘤病毒(HPV) 16型和18型衣殼蛋白基因的方法以及由該方法制備得到的產(chǎn)品，屬于人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
子宮頸癌是中國(guó)較常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，是一類嚴(yán)重威脅婦女生命健康的疾病， 發(fā)病率僅次于乳腺癌，而宮頸癌的病死率為婦女惡性腫瘤的首位。全世界每年大約有50萬(wàn)宮頸癌新發(fā)病例，其中約一半死亡。近年來(lái)，宮頸癌有逐年上升的趨勢(shì)，特別在較年輕的城市女性人群中。過(guò)去幾十年的研究證明高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)病重要病因，在80% 90%的宮頸癌組織中可檢測(cè)到HPV16型和(或)HPV18型的存在，HPV16型和HPV18型被認(rèn)為是婦女宮頸癌的主要病原(陳俊等，醫(yī)學(xué)綜述，2007，7-0512-03)。人類乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)(子宮頸癌病毒)屬DNA病毒。 人體皮膚及黏膜的復(fù)層鱗狀上皮HPV的惟一宿主，尚未在體外培養(yǎng)成功。病毒顆粒直徑為 50 55nm。需借助電子顯微鏡才能看到。HPV的類型很多，近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)研究發(fā)展迅速，證實(shí)HPV有60種以上的抗原型，即這一家族里有60多個(gè)相似而又不同的病毒(亞型)，其中16、18型是國(guó)內(nèi)外研究宮頸癌、外陰癌甚至陰莖癌的最熱門(mén)的病毒因子。HPV感染是一種常見(jiàn)的性傳播疾病，盡管大多數(shù)感染為良性，但高危型HPV與肛門(mén)及生殖器區(qū)域的癌前病變及惡性病變有關(guān)。對(duì)多數(shù)患者來(lái)說(shuō)，生殖道HPV存留可達(dá)1年，直到出現(xiàn)另一新型的HPV感染才自然消退。研究顯示，HPV16和HPV18會(huì)存留更長(zhǎng)時(shí)間周期。持續(xù)HPV感染是宮頸上皮癌變的重要危險(xiǎn)因子。與宮頸癌及泌尿生殖道其他癌癥的發(fā)生關(guān)系密切，在 50%的宮頸癌和低分化宮頸上皮不良增生的患者和25%的高分化宮頸上皮不良增生患者中均可檢測(cè)到HPV16DNA的存在。因此防止HPV16持續(xù)性感染的疫苗可從根本上減少宮頸癌的發(fā)病率。但因HPV不能經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)增殖，故HPV基因工程疫苗的研制成為近年來(lái)研究熱點(diǎn)(夏煥章等，中國(guó)生物工程雜志，2008，觀(9) :130-134)。HPV病毒衣殼粒子是主要衣殼蛋白基因Ll和次要衣殼蛋白基因L2完全組裝而成的，而主要衣殼蛋白基因Ll單獨(dú)也可自我組裝成病毒樣顆粒(Viral like particles, VLPs)。Ll主要衣殼蛋白含量是L2蛋白的3 5倍，含多個(gè)抗原表位，其結(jié)構(gòu)保守，具有較強(qiáng)的免疫原性，只能產(chǎn)生特異性抗體而沒(méi)有交叉反應(yīng)，此特性決定了它常常被作為預(yù)防性疫苗的靶抗原。L2蛋白雖然含量少但變異較多，可以產(chǎn)生交叉反應(yīng)，且具有B細(xì)胞抗原表位，可以在皮膚粘膜表面產(chǎn)生中和抗體。Ll和L2的共表達(dá)有可能提高病毒衣殼粒子的裝配效率，且L2蛋白可能存在中和性抗原表位和CTL表位(王建偉等，中國(guó)生物工程雜志， 2007,27(4) :104-109).因此，Ll和L2的共表達(dá)不僅可以提高衣殼粒子的產(chǎn)量，而且可能增加有效的抗原表位以便獲得較強(qiáng)的局部黏膜免疫和系統(tǒng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。由于L1-L2雙基因共表達(dá)會(huì)受到如多啟動(dòng)子互相干擾等問(wèn)題困擾，一直沒(méi)有成功進(jìn)行表達(dá)。 所以目前，臨床應(yīng)用的預(yù)防性子宮頸癌疫苗都是只針對(duì)HPV16和HPV18的Ll基因研發(fā)而成的(郝飛等，免疫學(xué)雜志，(2010)06-0546-05)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有的人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子制備方法中所存在的生產(chǎn)成本過(guò)高、能耗大及安全性差等缺陷，提供一種新的人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子制備方法，該方法利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲(chóng)體內(nèi)安全、高效的表達(dá)一種抗原或由兩種抗原組成的人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子，具有安全、高效、能耗少、成本低等諸多優(yōu)
點(diǎn)ο本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的—種人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的制備方法，包括(1)將人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的主要衣殼蛋白基因或人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的主要衣殼蛋白基因和次要衣殼蛋白基因聯(lián)合表達(dá)的組合轉(zhuǎn)移到桿狀病毒的基因組上，構(gòu)建得到重組桿狀病毒；(2)用所構(gòu)建的重組桿狀病毒感染昆蟲(chóng)宿主或昆蟲(chóng)細(xì)胞；(3)培養(yǎng)被感染的昆蟲(chóng)宿主或昆蟲(chóng)細(xì)胞；(4)收獲并純化所表達(dá)的抗原，即得。其中，所述的人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的主要衣殼蛋白基因優(yōu)選為人乳頭瘤病毒16型的主要衣殼蛋白基因Ll或人乳頭瘤病毒18型的主要衣殼蛋白基因Ll ；其中，所述人乳頭瘤病毒16型的主要衣殼蛋白基因Ll的核苷酸序列為SEQ ID NO 1所示，其氨基酸序列為SEQ ID NO 2所示；所述人乳頭瘤病毒18型的主要衣殼蛋白基因Ll的核苷酸序列為SEQ ID NO 5所示，其氨基酸序列為SEQ ID NO 6所示。所述的人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的主要衣殼蛋白基因和次要衣殼蛋白基因聯(lián)合表達(dá)的組合可以是由人乳頭瘤病毒16型的主要衣殼蛋白基因Ll和人乳頭瘤病毒16型的次要衣殼蛋白基因L2(核苷酸序列為SEQ ID NO :3所示，其氨基酸序列為SEQID N0:4所示)所組成的聯(lián)合表達(dá)的組合；優(yōu)選的，本發(fā)明通過(guò)SEQ ID NO :13所示的IRES核苷酸序列 (內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，Chain A,Structure OfRibosome-Bound Cricket Paralysis Virus Ires Rna.)將人乳頭瘤病毒16型的主要衣殼蛋白基因Ll和次要衣殼蛋白基因L2連接得到核苷酸序列為SEQ ID N0:9所示(其氨基酸序列為SEQID NO: 10所示)的聯(lián)合表達(dá)的組
口 O所述的人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的主要衣殼蛋白基因和次要衣殼蛋白基因聯(lián)合表達(dá)的組合還可以是由人乳頭瘤病毒18型的主要衣殼蛋白基因Ll和人乳頭瘤病毒18 型的次要衣殼蛋白基因L2(核苷酸序列為SEQ ID NO :7，氨基酸序列為SEQ IDNO :8)所組成的聯(lián)合表達(dá)的組合；優(yōu)選的，本發(fā)明通過(guò)SEQ ID NO :13所示的IRES核苷酸序列將人乳頭瘤病毒18型的主要衣殼蛋白基因Ll和人乳頭瘤病毒18型的次要衣殼蛋白基因L2連接得到核苷酸序列為SEQ ID N0:11所示(其氨基酸序列為SEQID N0:112所示)的聯(lián)合表達(dá)的組合。優(yōu)選的，步驟(1)中所述的重組桿狀病毒按照以下方法構(gòu)建得到(a)將人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的主要衣殼蛋白基因或人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的主要衣殼蛋白基因和次要衣殼蛋白基因聯(lián)合表達(dá)的組合克隆到桿狀病毒運(yùn)載載體中，構(gòu)建得到轉(zhuǎn)移表達(dá)載體；(b)將所構(gòu)建的轉(zhuǎn)移表達(dá)載體與桿狀病毒DNA進(jìn)行共轉(zhuǎn)染(以發(fā)生同源重組或轉(zhuǎn)座)，構(gòu)建得到重組桿狀病毒；其中，所述的桿狀病毒運(yùn)載載體的表達(dá)盒優(yōu)選為由多角體蛋白啟動(dòng)子、PlO啟動(dòng)子或ie-Ι啟動(dòng)子與增強(qiáng)子所組合成的表達(dá)盒，例如，所述的桿狀病毒運(yùn)載載體可選自pBM034，pBM93, AcRP23_lacZ，AcRP6_SC， AcUffl-IacZ, BacPAK6, Bac to Pac, Bacmid, BlucBacII (pETL)，p2Bac, p2Blue, p89B310, pAc360,pAc373，pAcAB3，pAcAB 4，PAcAS3,pAcC 129，pAcC4，DZI，pAcGP67，pAcIEl,pAcJPl, pAcMLF2, pAcMLF7, pAcMLF8, pAcMPl, pAcMP2, pAcRP23, pAcRP25, pAcRW4, pAcsMAG, pAcUffl, pAcUW21, pAcUW2A, pAcUW2B, pAcUW3, pAcUW31, pAcUW41, pAcUW42, pAcUW43, pAcUW51, pAcVC2, pAcVC3, pAcYMl, pAcJcC5, pBacl，pBac2，pBlueBacIII,pBlueBacHis, pEV55,mXIV, pIEINeo, ρJVETL, ρJVNhe 1, ρJVP10, pJVrsMAG, pMBac, pPIO, pPAKl, pPBac, pSHONEX 1. 1， pSYN XIV VI+,pSYNVI+wp,pSYNXIV VI-, pVL1391,pVL 1392, pVL 1393, pVL941,pVL 945， PVL 985，ρVTBac, pBM030, pUAC-5或其它類似的桿狀病毒同源重組或轉(zhuǎn)座載體中的任意一種，更優(yōu)選為PVL1393狀病毒運(yùn)載載體。所述的桿狀病毒優(yōu)選自BmNPV、AcMNPV, ApNPV,、HaNPV, HzNPV, LdMNPV, MbMNPV, OpMNPV, SIMNPV, SeMNPV或SpltNPV中的任意一種；更優(yōu)選為家蠶桿狀病毒親本株 Bm-NPV-ZJ8。步驟O)中所述的昆蟲(chóng)宿主優(yōu)選為家蠶(Bombyx mori)、野蠶(Bombyx mandarina)、蓖麻香(Philosamia cynthia ricim)、樟香(Dictyoplocajapanica)、樗香(Philosamia cynthia pryeri)、昨香(Antheraea pernyi)、曰本昨香(Antheraea yamamai)、野天香(Antheraea polyphymus)、苜猜尺蠖(Atographa califorica)、茶 X H (Ectropis obliqua)、1ξ["蘭 * _ (Mamestra brassicae) > ^4 1 ^ (Spodoptera littoralis)、秋粘蟲(chóng)(Spodoptera frugiperda)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)、行軍蟲(chóng) (Thaumetopoea wilkinsoni)、棉鈴蟲(chóng)(Heliothis armigera)、美國(guó)棉鈴蟲(chóng)(Heliothis zea)、煙青蟲(chóng)(Heliothis assulta)、煙草夜蛾(Heliothis virescens)、東方粘蟲(chóng) (Pseudaletia separata)或舞毒蛾(Lymantria dispar)中的任意一種；更優(yōu)選為家蠶 (Bombyx mori)。步驟( 中所述的感染是指重組桿狀病毒通過(guò)吞食或透過(guò)表皮來(lái)感染1-5齡的昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)或蛹體；較佳的，將重組家蠶桿狀病毒感染家蠶細(xì)胞或穿刺接種1-5齡的家蠶幼蟲(chóng)或蛹，在感染3-6天后收集含人乳頭瘤病毒抗原的家蠶幼蟲(chóng)或蛹的體液或組織勻漿；其中， 所述的蛹體最優(yōu)選為1-2天的早期嫩蛹。本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的整體技術(shù)方案如下將人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白基因Ll (SEQ ID NO :1)、人乳頭瘤病毒18型主要衣殼蛋白基因Ll (SEQ IDNO 5)、 人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白基因Ll和次要衣殼蛋白基因L2的聯(lián)合表達(dá)組合(即 HPV16L1-IRES-HPV16L2組合基因，SEQ ID NO 9)或人乳頭瘤病毒18型主要衣殼蛋白基因Ll和次要衣殼蛋白基因L2的聯(lián)合表達(dá)組合(即HPV18L1-IRES-HPV18L2組合基因，SEQ ID NO=Il)克隆到運(yùn)載載體PVL1393上，再通過(guò)體內(nèi)重組將全長(zhǎng)人乳頭瘤病毒HPV16L1、 HPV18L1、HPV16L1-IRES-HPV16L2、HPV18L1-IRES-HPV18L2 基因分別轉(zhuǎn)移到家蠶桿狀病毒親本株Bm-NPV-ZJ8的基因組上，替代基因組上的Polyhedrin基因，通過(guò)空斑篩選技術(shù)和PCR 檢測(cè)技術(shù)，獲得攜帶人乳頭瘤病毒不同基因組合的重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(HPV16Ll)、 rBmNPV(HPV18L1)、rBmNPV (HPV16L1-IRES-HPV16L2)、rBmNPV(HPV18L1-IRES-HPV18L2)。本發(fā)明將所構(gòu)建的兩株重組家蠶桿狀病毒rBmNPV (HPV16L1-IRES-HPV16I^)以及rBmNPV(HPV18L1-IRES-HPV18L2)分別提交到專利認(rèn)可的機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏；其中，重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(HPV16L1-IRES-HPV16I^)的微生物保藏號(hào)是CGMCC No. 5126 ；分類命名是 nucleopolyhedrovirus Bombyx Mori Nucleopolyhedrovirus (Bm NPV)；保藏時(shí)間是2011 年8月15日；保藏單位是中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址是 北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(HPV18L1-IRES-HPV18L2)的微生物保藏號(hào)是CGMCC No. 5127 ；分類命名是nucleopolyhedrovirus Bombyx Mori Nucleopolyhedrovirus (Bm NPV)；保藏時(shí)間是2011年8月15日；保藏單位是中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明進(jìn)一步將所構(gòu)建的重組家蠶桿狀病毒感染家蠶細(xì)胞系或穿刺接種1-5齡的家蠶幼蟲(chóng)或蛹，大量繁殖rBmNPV(HPV16Ll)、rBmNPV(HPV18L1)、 rBmNPV (HPV16L1-IRES-HPV16L2)、rBmNPV (HPV18L1-IRES-HPV18L2)；當(dāng) rBmNPV (HPV16L1)、 rBmNPV (HPV18L1) ,rBmNPV (HPV16L1-IRES-HPV16L2) ,rBmNPV (HPV18L1-IRES-HPV18L2)在蠶體內(nèi)復(fù)制時(shí)，HPV16L1、HPV18L1、HPV16L1-IRES-HPV16L2 或 HPV18L1-IRES-HPV18L2 基因在多角體蛋白基因(Polh)啟動(dòng)子控制下表達(dá)，并自我組裝成為人類乳頭瘤病毒(子宮頸癌病毒)空衣殼粒子；在感染3-6天(最佳為5天，25°C飼養(yǎng)溫度)后收集含子宮頸癌病毒空衣殼粒子的家蠶幼蟲(chóng)或蛹的體液(或整體勻漿)，經(jīng)過(guò)純化后便得到安全、高效的子宮頸癌病毒空衣殼粒子，可用于制備預(yù)防子宮頸癌的注射用疫苗；或者將其經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單純化，經(jīng)脂肪酸乳化后也可制備成預(yù)防子宮頸癌的口服型疫苗。本發(fā)明采用基因重組技術(shù)將來(lái)源于人乳頭瘤病毒的不同基因組合，包括人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白Li、人乳頭瘤病毒18型主要衣殼蛋白Li、人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白基因Ll和次要衣殼蛋白基因L2的基因聯(lián)合表達(dá)組合(HPV16L1-IRES-HPV16L2) 或人乳頭瘤病毒18型主要衣殼蛋白基因Ll和次要衣殼蛋白基因L2的基因聯(lián)合表達(dá)組合 (HPV18L1-IRES-HPV18L2)構(gòu)建到由啟動(dòng)子為多角體蛋白，plO，ie-1等及與增強(qiáng)子組合所驅(qū)動(dòng)的桿狀病毒表達(dá)所用表達(dá)盒的桿狀病毒表達(dá)轉(zhuǎn)移運(yùn)載載體上，在多角體啟動(dòng)子、PlO啟動(dòng)子或別的病毒和真核生物的強(qiáng)啟動(dòng)子控制之下，通過(guò)體內(nèi)或體外(in vivo/in vitro)重組，使 HPV16L1、HPV18L1、HPV16L1-IRES-HPV16L2、HPV18L1-IRES-HPV18L2 整合到桿狀病毒的基因組上，得到重組桿狀病毒；重組桿狀病毒可通過(guò)經(jīng)口食下或采用各種手段透過(guò)表皮感染1-5齡(最優(yōu)時(shí)間為四或五齡)的昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)或蛹體(最優(yōu)時(shí)間為1-2天的早期嫩蛹)， 表達(dá)生產(chǎn)各種子宮頸癌病毒空衣殼粒子。同時(shí)為探究不同的HPV16L1基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)量的關(guān)系，本發(fā)明將HPV16L1基因 (SEQ ID NO 1)的 N 端的 26 個(gè)氨基酸(MQVTFIYILVITCYENDVNVYHIFFQ)刪去或?qū)?HPV16L1 基因的C端的；34個(gè)氨基酸(AGLKAKPKFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKL)刪去構(gòu)建不同長(zhǎng)度的表達(dá)載體HPV16L1N或HPV16L1C，并進(jìn)行重組或表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HPV16L1的蛋白表達(dá)量和空衣殼病毒粒子的組裝效率并沒(méi)有很大的改善。本發(fā)明方法采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在家蠶生物反應(yīng)器中安全、高效生產(chǎn)的人乳頭瘤病毒衣殼蛋白粒子，其生產(chǎn)成本僅為現(xiàn)有的制備子宮頸癌病毒空衣殼粒子方法(例如通過(guò)昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)抗原蛋白的方法)成本的幾十分之一，甚至百分之一。本發(fā)明方法建廠，三廢，電力和水資源等能源消耗極少。此外，家蠶為食藥兼用昆蟲(chóng)，本發(fā)明方法所制備的抗原具有極高的安全性。總之，本發(fā)明方法可以大幅度降低子宮頸癌病毒空衣殼粒子的生產(chǎn)成本，具有安全、高效、能耗少、成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)。


圖1HPV16L1-HPV16L2病毒樣顆粒的電鏡觀察。圖2HPV16L1-HPV16L2病毒樣顆粒的免疫電鏡觀察，樣品40倍稀釋，所用的一抗為 HPV16L1。圖3HPV16L1-HPV16L2病毒樣顆粒的免疫電鏡觀察，樣品40倍稀釋，所用的一抗為 HPV16L2。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明的制備方法及有益效果，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。試驗(yàn)材料1.大腸桿菌株E. coli DH5a購(gòu)自!Iomega公司；克隆載體pEASY_T3購(gòu)自全式金公司；克隆載體Pmdl8-T購(gòu)自TAKARA公司；運(yùn)載載體pVL1393購(gòu)自于hvitrogen公司、家蠶細(xì)胞BmN由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所保存；人乳頭瘤病毒抗體購(gòu)自santa公司；家蠶核型多角體病毒親本株Bm-NPV-ZJS和高表達(dá)家蠶品種JYl由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所保存(同時(shí)也可向中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所或中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所購(gòu)買(mǎi)獲得)。2.酶與試劑限制性內(nèi)切酶、PNK酶、連接酶為!Iomega公司產(chǎn)品。3.生化試劑IPTG、X-Gal為!Iomega公司產(chǎn)品?；蚪MDNA提取試劑為T(mén)aKaRa 公司產(chǎn)品。Lipofectin、低融點(diǎn)瓊脂糖LMP、PCR試劑盒、T4DNA連接酶、RNA酶、Proteinase K、胎牛血清及其他試劑購(gòu)于hvitrogen公司，細(xì)胞培養(yǎng)基TC-100購(gòu)于Sigma公司。4.培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B(1%蛋白胨、0. 5%酵母提取物、l%NaCl， pH7. 0)；家蠶細(xì)胞培養(yǎng)基為T(mén)C-100。實(shí)施例一人乳頭瘤病毒(HPV) 16型主要衣殼蛋白基因Ll在家蠶生物反應(yīng)器中的表達(dá)及免疫實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)方法1. 1.有關(guān)溶液和培養(yǎng)基的配置溶液I :50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl (ρΗ8· 0)，10mmol/L EDTA。溶液II :0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS(現(xiàn)配現(xiàn)用)。溶液III IOOmL 體系，5mol/L 醋酸鉀 80mL，冰乙酸 12mL，ddH208mL。TAE(50X) :242gTris 堿，57. ImL 冰乙酸，IOOmL 0. 5mol/L EDTA(ρΗ8· 0)，無(wú)菌水定容至1000mL。TER 溶液胰 RNAse(RNAse Α)溶解于 IOmM Tris-HCl U 5mMNaCl 中，配成 10mg/mL 的儲(chǔ)存液_20°C凍存，再用1 XTE buf稀釋成20 μ g/mL的工作液4°C保存。PPt Buffer 異丙醇 22mL ；5mol/mL KAc ImL ；ddH202mLoPEG溶液稱取一定質(zhì)量的NaCl，配成1. 6M的鹽溶液，加入一定量的PEG，使其終濃度為13%。6mol/L NaI 將 0. 75g Na2SO3溶于 40mL ddH20 中，加入 45gNaI 并攪拌至完全溶解， 4°C儲(chǔ)存。玻璃奶(Glassmilk)將IOg (100mg/mL，Sigma S-5631)的 Silica 溶于 IOOmL PBS 中，沉淀2h，棄上清，重復(fù)該步驟2 3次；2000g離心2min，將沉淀物溶于3mol/L的NaI 中，終濃度為100mg/mL，4°C下避光保存。New Wash 洗液Tris_HCl (pH 7. 4) 20mmol/L ；EDTA lmmol/L ；NaCl 1 OOmmo 1/L ；與等體積的無(wú)水乙醇配制而成。LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，調(diào)整pH值到7. 0 (固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂)。蛋白上樣緩沖液QX) :100mmol/L Tris-HCl (ρΗ6· 8)、200mmol/L 二硫蘇糖醇 (DTT)、4% SDS,0. 2%溴酚藍(lán)、10%甘油。30%丙烯酰胺溶液^g 丙烯酰胺，IgN, N'-亞甲叉丙烯酰胺，溶于IOOmL水，過(guò)
濾ο考馬斯亮藍(lán)染液0. 24g考馬斯亮藍(lán)R250溶于90mL甲醇水(1 l,v/v)和IOmL 冰乙酸中。脫色液10%冰乙酸。1. 2.人乳頭瘤病毒(HPV) 16型主要衣殼蛋白基因Ll的獲得1. 2. IDNAiso (TaKaRa公司)試劑法提取基因組DNA(1)將子宮頸癌患病組織放入盛有DNAiso (25 50mg組織/ImL)的玻璃勻漿器中勻漿，直至沒(méi)有明顯塊狀組織沉淀。(2)將勻漿液在室溫下放置，以使核蛋白質(zhì)復(fù)合體完全裂解。(3)將裂解液移至離心管中，4°C，IOOOOg離心10分鐘。(4)將上清移至新的離心管，加入DNAisol/2體積量的無(wú)水乙醇。反復(fù)顛倒混勻 1 3分鐘。(5)管中出現(xiàn)的云霧狀DNA沉淀，將上清液輕輕倒出。(6)用lmL75%乙醇沿管壁緩慢加入，輕輕上下顛倒洗滌；然后4°C，12000g離心5 分鐘。(7)棄上清，干燥；沉淀重溶于30 μ L DEPC處理的雙蒸水(ddH20)。1. 2. 2目的基因的引物設(shè)計(jì)與合成設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增出人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白Ll基因(SEQID NO :1)。所設(shè)計(jì)的人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白Ll基因的擴(kuò)增引物為HPV16L1 上游5 ‘ -CGAGATCTAACATGCAGGTGACTTTTATTTACATCC-3‘BglIIHPV16L1 下游5 ‘ -CGTCTAGATTACAGCTTACGTTTTTTGCGTTTAGC-3‘XbaI1. 2. 3HPV16L1 基因擴(kuò)增的 PCR 反應(yīng)
50 μ L反應(yīng)體系PCR反應(yīng)程序10XPCR buffer5 μ L95°C預(yù)變性5min
dNTP(IOmM)1 μ L94 °CImin
模板DNA 1 μ L60 °C40sec
primer1(20pmol/'PL)72 °C2min
Primer2(20pmol/'PL)以上三步為--個(gè)循環(huán)，循環(huán)30次
Taqgl 1 μ L72°C延伸 IOmin
ddH20 40 μ LPCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5. 0 μ L反應(yīng)產(chǎn)物用1. 0%的TAE瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠中含有0. 5 μ g/mL的溴化乙錠，電泳緩沖液為1 X TAE, 80 100V，大約10 20min于紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察片段大小，與標(biāo)準(zhǔn)的DNA Marker比較，進(jìn)行分析。1. 3玻璃奶純化回收DNA片段1. 4PCR產(chǎn)物與克隆載體pEASY-T3的連接連接體系如下pEASY-T3 1 μ L目的 DNA 2 μ LddH202 μ L混勻后，25°C連接15min，連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。1.5連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化1. 51感受態(tài)細(xì)胞的小量制備(1)-20°C凍藏的DH5a甘油菌在LB平板上復(fù)蘇；(2)用滅菌牙簽挑取單菌落，放入4mL LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，取100 μ L 過(guò)夜培養(yǎng)物接種到另一 4mL LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2 2. 5h，使OD值在0. 6左右；(3) 5，OOOg離心4min收集菌體，將菌體重懸于800 μ L75mmol/L冷CaCl2中，冰浴 30min,；(4) 5，OOOg離心％iin，棄上清，加入200 μ L75mmol/L冷CaCl2,輕輕敲打管壁，使混合均勻，冰上放池后用于轉(zhuǎn)化。1.52感受態(tài)細(xì)胞的大量制備(1)-70°C凍藏的DH5a甘油菌在LB平板上復(fù)蘇；(2)挑取單菌落(直徑約2 3mm)，放入4mL LB培養(yǎng)基中(不含Amp)，另外挑一個(gè)放入加有Amp抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)他；在前者生長(zhǎng)后者不生張說(shuō)明沒(méi)有污染。前者取ImL接種IOOmL新鮮的LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)2 池；(3)培養(yǎng)物收集在滅菌的離心管中，5，000r/min 4°C離心5min，將菌體重懸于 20 30mL 75mmol/L的預(yù)冷CaCl2溶液中，冰浴30min ；(4)5，00017^11低溫離心51^11，棄上清，加入IOmL含10 %甘油的75mmol/L冷 CaCl2溶液，輕輕敲打管壁，使混合均勻，冰上放3 4h后分裝小管，_70°C凍存。1.53連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化(1)質(zhì)粒DNA20 IOOng或連接混合物5 μ L加到100 μ L上述制備的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min ；
(2)進(jìn)行熱休克(42°C保溫90sec)，迅速置冰上1 2min，加入ImL已溫育至37°C 的LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)lh，(3)稍離心，去部分上清后重懸沉淀，涂布于數(shù)個(gè)含相應(yīng)抗生素的LB平板上。370C 倒置培養(yǎng)過(guò)夜。1.6重組質(zhì)粒的鑒定1. 61細(xì)胞破碎法快速鑒定重組后的質(zhì)粒與原來(lái)的質(zhì)粒分子量有一定差別時(shí)可用此法檢出重組子(Beuken， et al.，998)。(1)分別挑取多個(gè)單菌落轉(zhuǎn)化子接種于4mL含80 μ g/mLAmp抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；(2)取300 500 μ L菌液于離心管中，12，OOOg離心IOsec,棄上清，加入30 μ L緩沖液(6%蔗糖，0. 溴酚藍(lán))，再加入20yL酚/氯仿(1 1)，充分振蕩將菌體彈起；(3) 12，OOOg離心5min，取上清上樣電泳，觀察結(jié)果。1. 62重組質(zhì)粒的進(jìn)一步酶切鑒定(1)質(zhì)粒DNA的提取(2)重組質(zhì)粒的酶切鑒定鑒定體系如下
權(quán)利要求
1.一種人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的制備方法，包括(1)將人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的主要衣殼蛋白基因或人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的主要衣殼蛋白基因和次要衣殼蛋白基因聯(lián)合表達(dá)的組合轉(zhuǎn)移到桿狀病毒的基因組上，構(gòu)建得到重組桿狀病毒；(2)用所構(gòu)建的重組桿狀病毒感染昆蟲(chóng)宿主或昆蟲(chóng)細(xì)胞；(3)培養(yǎng)被感染的昆蟲(chóng)宿主或昆蟲(chóng)細(xì)胞， 收獲并純化所表達(dá)的抗原。
2.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的主要衣殼蛋白基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:5所示；所述的人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的主要衣殼蛋白基因和次要衣殼蛋白基因聯(lián)合表達(dá)的組合由SEQ ID NO: 1所示的人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白基因Ll和SEQ ID NO:3 所示的人乳頭瘤病毒16型次要衣殼蛋白基因L2所組成的聯(lián)合表達(dá)的組合；優(yōu)選的，通過(guò) SEQ ID NO: 13所示的IRES核苷酸序列將人乳頭瘤病毒16型的主要衣殼蛋白基因Ll和次要衣殼蛋白基因L2連接得到核苷酸序列為SEQ ID N0:9所示的聯(lián)合表達(dá)的組合；所述的人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的主要衣殼蛋白基因和次要衣殼蛋白基因聯(lián)合表達(dá)的組合還可以是由SEQ ID N0:5所示的人乳頭瘤病毒18型主要衣殼蛋白基因Ll和SEQ ID N0:7所示的人乳頭瘤病毒18型次要衣殼蛋白基因L2所組成的聯(lián)合表達(dá)的組合；優(yōu)選的，通過(guò)SEQ ID NO: 13所示的IRES核苷酸序列將SEQ ID NO:5所示的人乳頭瘤病毒18型的主要衣殼蛋白基因Ll和SEQ ID N0:7所示的人乳頭瘤病毒18型的次要衣殼蛋白基因L2 連接得到核苷酸序列為SEQ ID NO: 11所示的聯(lián)合表達(dá)的組合。
3.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的重組桿狀病毒按照以下方法構(gòu)建得到(a)將人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的主要衣殼蛋白基因或人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的主要衣殼蛋白基因和次要衣殼蛋白基因聯(lián)合表達(dá)的組合克隆到桿狀病毒運(yùn)載載體中構(gòu)建得到轉(zhuǎn)移表達(dá)載體；(b)將所構(gòu)建的轉(zhuǎn)移表達(dá)載體與桿狀病毒DNA進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，得到重組桿狀病毒。
4.按照權(quán)利要求1或3所述的制備方法，其特征在于所述的重組桿狀病毒的微生物保藏號(hào)是 CGMCC No. 5126 或 CGMCC No. 5127。
5.按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的桿狀病毒運(yùn)載載體的表達(dá)盒為由多角體蛋白啟動(dòng)子、PlO啟動(dòng)子或ie-l啟動(dòng)子中的任意一種與增強(qiáng)子所組合成的表達(dá)盒。
6.按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于例如，所述的桿狀病毒運(yùn)載載體選自 pBM034, pBM93, AcRP23-7acZ, AcRP6_SC, AcUffl-7acZ, BacPAK6, Bac to Pac, Bacmid, BlucBacII(pETL)， p2Bac, p2Blue, p89B310, pAc360, pAc373, pAcAB3, pAcAB 4，PAcAS3, pAcC129，pAcC4，DZI, pAcGP67, pAcIEl, pAcJPl, pAcMLF2,pAcMLF7,pAcMLF8, pAcMPl, pAcMP2, pAcRP23, pAcRP25, pAcRW4, pAcsMAG, pAcUffl, pAcUW21, pAcUW2A, pAcUW2B，pAcUW3，pAcUW31，pAcUW41，pAcUW42，pAcUW43，pAcUW51，pAcVC2，pAcVC3，pAcYMl， pAcJcC5, pBacl, pBac2, pBlueBacIII, pBlueBacHis, pEV55, mXIV, pIEINeo, ρJVETL, ρJVNhe1, pJVPIO, pJVrsMAG, pMBac, pPIO, pPAKl, pPBac, pSHONEX 1. 1, pSYN XIV VI+, pSYNVI+wp,pSYNXIV VI-, pVL1391,pVL 1392, pVL 1393, pVL941, pVL 945, pVL 985， pVTBac, pBM030 或 pUAC-5 ；所述的桿狀病毒選自 BmNPV、AcMNPV, ApNPV,、HaNPV, HzNPV, LdMNPV, MbMNPV, OpMNPV,SIMNPV、SeMNPV 或 SpltNPV。
7.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的昆蟲(chóng)宿主為家香(Bombyx mori)、野香(Bombyx mandarina)、蓖麻香(Philosamia cynthia ricim)、^(Dictyoploca japanica)、_ ^(Philosamia cynthia pryeri)、豐乍 Antheraea pernyi)、日本昨香(Antheraea yamamai)、野天香(Antheraea poIyphymus)、苜猜尺蠖 (Atographa califorica)、荼尺蠖(Ectropis obliqua)、甘蘭夜蛾(Mamestra brassicae)、 斜紋夜蛾(Spodoptera littoralis)、秋粘蟲(chóng)(Spodoptera frugiperda)、粉紋夜蛾 (Trichoplusia ni)、行軍蟲(chóng)(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉鈴蟲(chóng)(Heliothis armigera)、 美國(guó)棉鈴蟲(chóng)(Heliothis zea)、煙青蟲(chóng)(Heliothis assulta)、煙草夜蛾(Heliothis virescens)、東方粘蟲(chóng)(Pseudaletia separata)或舞毒蛾(Lymantria dispar)。
8.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的感染是指重組桿狀病毒通過(guò)吞食或透過(guò)表皮來(lái)感染1-5齡的昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)或蛹體；優(yōu)選的，將重組家蠶桿狀病
9.由權(quán)利要求1-8任何一項(xiàng)制備方法得到的產(chǎn)品。
10.權(quán)利要求9所述的產(chǎn)品在制備預(yù)防子宮頸癌的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的制備方法及其產(chǎn)品，所述制備方法包括(1)將人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的主要衣殼蛋白基因或人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的主要衣殼蛋白基因和次要衣殼蛋白基因聯(lián)合表達(dá)的組合轉(zhuǎn)移到桿狀病毒的基因組上，構(gòu)建得到重組桿狀病毒；(2)用所構(gòu)建的重組桿狀病毒感染昆蟲(chóng)宿主或昆蟲(chóng)細(xì)胞；(3)培養(yǎng)被感染的昆蟲(chóng)宿主或昆蟲(chóng)細(xì)胞，收獲并純化所表達(dá)的抗原，即得。本發(fā)明制備方法采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在家蠶生物反應(yīng)器中安全、高效的生產(chǎn)人乳頭瘤病毒衣殼蛋白粒子，本發(fā)明方法能夠大幅度降低人類乳頭瘤病毒空衣殼粒子的生產(chǎn)成本，具有安全、高效、能耗少、成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/37GK102321635SQ201110258298
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月2日
發(fā)明者張志芳, 易詠竹, 李軼女, 楊標(biāo), 沈桂芳, 王國(guó)增, 舒惠國(guó), 邊大勇 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所