專利名稱：一種對重金屬銅高度敏感的生物傳感器的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過分子生物學(xué)手段，利用代謝工程改造的細(xì)菌菌株，具體涉及一種對重金屬銅離子高敏感的大腸桿菌生物傳感器的制備方法及其產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
銅是動植物所必需的微量元素，人體缺銅會造成貧血、腹瀉等疾病，但過量的銅對人和動、植物也可造成危害。研究發(fā)現(xiàn)過量的重金屬銅對于所有的生命體都是有毒的，人體內(nèi)銅的過量沉積參與了很多疾病的發(fā)生和發(fā)展，銅可蓄積于人體重要器官，如肝、腎、腦等， 特別是某些患有染色體隱性疾病的人，由于膽汁排泄銅的功能紊亂，銅蓄積于肝，引起肝臟損壞，出現(xiàn)慢性、活動性肝炎癥狀，如印度兒童肝硬化、Tyrolean嬰兒慢性間質(zhì)性肝炎和 Wilson病，當(dāng)銅蓄積于腦部，可引起神經(jīng)組織病變，出現(xiàn)小腦運動失常甚至出現(xiàn)帕金森綜合癥或阿爾茨海默病。當(dāng)銅沉積在近側(cè)腎小管時，則可引起氨基酸尿、糖尿、蛋白尿、磷酸鹽尿和尿酸尿。當(dāng)銅沉積在眼角膜周圍時，在后彈力層上出現(xiàn)鐵銹樣環(huán)，影響眼睛的正常功能。 研究顯示銅對原核細(xì)胞作用靶點主要是一些具有重要功能的鐵硫蛋白的鐵硫中心。隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，很多含有銅離子的污染物排放入江河湖泊中，污染土壤、水源甚至是日常食用的糧食蔬菜，其中在金屬礦山開采、冶金、金屬加工、機械制造、有機合成及其它工業(yè)所產(chǎn)生的廢水中大多含有銅，其中以金屬加工、電鍍工廠所排廢水中含銅最高，每升廢水含銅幾十至幾百毫克。水體中含銅量達(dá)0.01mg/L時對水體自凈有明顯的抑制作用； 超過:3mg/L，會產(chǎn)生異味；超過15mg/L，就無法飲用。若用含銅廢水灌溉農(nóng)田，銅在土壤和農(nóng)作物中積累，會對農(nóng)作物，特別是對水稻和大麥生長不利，并會污染糧食。還有銅鹽的廣泛使用，如常見的波爾多液、硫酸銅、氧化銅、王銅、三氯化銅等作為農(nóng)藥會污染蔬菜。人們過多的暴露于高銅的環(huán)境以及高銅飲食都是很強的致病因素，最近研究還顯示銅對于男性生殖具有不利影響，因此對環(huán)境以及食品中銅離子檢測已不容忽視?，F(xiàn)有的對銅的分析檢測方法主要有極譜法、原子吸收分光光度法和電感耦合法，但這些方法，往往存在操作繁瑣， 需要專用的儀器及實驗室配備等弊端。利用模式生物對特定化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)的生物檢測技術(shù)克服了如上不足，因此有必要發(fā)展一種快速、特異、敏感的生物傳感器來檢測環(huán)境中銅離子的含量。生物檢測技術(shù)的基本原理即是利用模式生物對特定化學(xué)物質(zhì)的分子反應(yīng)機理。對于生物檢測技術(shù)而言需要三種必需的元件針對特定或具有相似性質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)的感應(yīng)器；由感應(yīng)器控制的啟動子；受此啟動子控制的報告基因。在設(shè)計生物檢測技術(shù)時，由于細(xì)菌具有在環(huán)境中大量存在、生長快速、低成本及易維護等優(yōu)點而受到研究人員普遍親睞。在過去的研究中利用生物檢測法來檢測環(huán)境中的特定污染物已經(jīng)引起了極大的關(guān)注，至今已經(jīng)研發(fā)了一系列針對特定有機物和無機化合物的生物傳感器，如重金屬、甲苯及其衍生物寸?，F(xiàn)在對銅離子測定的生物檢測技術(shù)也有所研發(fā)，其中比較清楚大腸桿菌針對銅離子的反應(yīng)機理，大腸桿菌具有精細(xì)的調(diào)控系統(tǒng)使得細(xì)胞內(nèi)銅離子保持在較低的水平，CopA 是一類P-型ATPase，作用是將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的銅離子向核周質(zhì)泵出；CueO是一類氧化酶，作用是在核周質(zhì)內(nèi)將Cu+氧化為Cu2+，防止核周質(zhì)內(nèi)銅離子進入細(xì)胞質(zhì)(銅離子只有一價形式可以穿過細(xì)胞膜)；當(dāng)大腸桿菌處在低濃度的銅離子環(huán)境中，CopA和CueO會被大量的誘導(dǎo)表達(dá)，其受到CueR調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)。高濃度的銅離子會激活Cus系統(tǒng)，使得銅離子從核周質(zhì)向外環(huán)境泵出。這個機理提供了一個很好的檢測模式，研究人員嘗試?yán)肅OpAp::luX和 CueRCopA: LuxCDABE融合報告基因以野生型E. coli作為宿主菌來檢測銅離子，這些方法特異性不錯，但是敏感性不是很高，更重要的是野生型大腸桿菌長期處于高銅的環(huán)境會由于自身的保護機制而產(chǎn)生銅離子耐受，其作為檢測銅的宿主菌會造成檢測結(jié)果的不穩(wěn)定， 所以必須采用新的方法提高生物學(xué)檢測方法檢測銅離子的敏感度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過基因敲除、基因融合技術(shù)構(gòu)建一種對銅離子高度敏感的大腸桿菌生物傳感器來快速、靈敏檢測銅離子，以解決以野生型大腸桿菌作為宿主菌的生物檢測法敏感性不高等問題，并可以克服物理化學(xué)等方法存在的操作繁瑣、需要專用的儀器及實驗室配備等弊端。本發(fā)明所述大腸桿菌報告菌株，名稱為E. coli WMC-006，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會，普通微生物中心，編號CGMCC No. 46M。實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一種對重金屬銅離子高敏感的大腸桿菌生物傳感器的制備方法的技術(shù)方案是包含以下步驟(1)利用條件復(fù)制質(zhì)粒pKD46和pCP20，利用Red重組系統(tǒng)，敲除野生型大腸桿菌 E. coli MC4100 基因組中 copA、cueO 和 cusA 三個基因，構(gòu)建 AcopA-AcueO-AcusAHS 因突變菌株；(2)利用交叉PCR反應(yīng)構(gòu)建含有報告基因gfpmut2與大腸桿菌copA基因啟動子 PcopA及轉(zhuǎn)錄終止子SoxS相融合的融合報告基因PcopA: :gfpmut2 ；(3)將步驟2所得片段克隆到PMD18-T載體上，構(gòu)建PcopA: :gfpmut2-T重組載體；(4)測序分析正確的重組載體PcopA: :gfpmut2-T經(jīng)雙酶切切下目的條帶連接到 pET28a載體上，構(gòu)建融合報告載體PcopA: gfpmut2-pET28a ；(5)將步驟(4)所得融合報告載體轉(zhuǎn)入步驟1構(gòu)建的Δ copA-Δ cueO-Δ cusA三基因突變菌株。通過上述步驟可以方便地構(gòu)建一種對重金屬銅離子高敏感的大腸桿菌生物傳感
ο上述制備方法的進一步設(shè)置是步驟(1)中Δ copA-Δ cueO-Δ cusA三基因突變菌株的制備依次包括有如下步驟1、引物信息及合成；2、單突變菌AcopA的制備；3、雙突變菌Δ copA-AcueO的制備；4、三突變菌Δ copA-Δ cueO-Δ cusA的制備；其中上述步驟2中的單突變菌AcopA的制備具體是一、pKD46/MC4100菌株制備；二、帶FRT位點的 cat基因PCR擴增；三、pKD46/MC4100電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備；四、電轉(zhuǎn)化cat基因；五、 cat基因的PCR鑒定；六、pCP20的轉(zhuǎn)化；七、cat抗性基因的消除；八、Δ copA單突變菌的純化；所述的報告基因選用選用編碼增強型綠色熒光蛋白的gfpmut2基因，融合報告基因PcopA::gfpmut2的制備依次包括有如下步驟1、引物信息及合成；2、E. coli MC4100細(xì)菌基因組DNA的提??；3、PCR擴增PcopA ；4、PCR擴增gfpmut2-soxSCo基因；5、交叉PCR獲得融合報告基因PcopA: :gfpmut2 ；6、PCR產(chǎn)物膠回收；融合報告載體PcopA::gfpmut2-pET a 制備依次包括有如下步驟(一)試劑盒提取質(zhì)粒pET28a ； (二)pED8a質(zhì)粒的雙酶切及其回收；(三)目的片斷與載體的連接反應(yīng)；(四)將連接好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中；(五)陽性克隆的鑒定。本發(fā)明進一步設(shè)置中報告基因選用選用編碼水母Aequorea Vicroria綠色熒光蛋白(GFP)的GFP基因的優(yōu)點是(1)易于檢測。GFP熒光反應(yīng)不需要外加底物和輔助因子， 只需紫外光或藍(lán)光激發(fā)，即可發(fā)出綠色熒光，用熒光顯微鏡甚至肉眼就可以觀察到，且靈敏度高，對于單細(xì)胞水平的表達(dá)也可識別；(2)熒光穩(wěn)定。GFP對光漂白有較強的耐受性，能耐受長時間的光照；GFP在ρΗ7-12 范圍內(nèi)也能正常發(fā)光；對高溫(70°C )、堿性、除垢劑、鹽、有機溶劑和大多數(shù)都有較強抗性；(3)無毒害。從目前的研究結(jié)果來看，GFP對生活的細(xì)胞基本無毒害，對目的基因的功能也沒有影響，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞仍可連續(xù)傳代；(4)通用性。表現(xiàn)在GFP的表達(dá)幾乎不受種屬范圍的限制，在微生物、植物、動物中都獲得了成功的表達(dá)；其次是GFP沒有細(xì)胞種類和位置上的限制，在各個部位都可以表達(dá)發(fā)出熒光；(5)易于構(gòu)建載體。由于GFP分子量較小，僅為27 30kD，編碼GFP的基因序列也很短，所以很方便地同其它序列一起構(gòu)建多種質(zhì)粒，而不至于使質(zhì)粒過大影響轉(zhuǎn)化頻率。(6)可進行活細(xì)胞定時定位觀察。對活細(xì)胞中蛋白的功能研究，更能接近自然真實的狀態(tài)。穩(wěn)定的GFP蛋白較之細(xì)菌性熒光素酶( 0. 1)有更高的量子產(chǎn)量(0. 88)。而且，只需大約IO5 IO6個GFP分子即可檢測出熒光信號。在此，我們使用一種由GFPmut2基因編碼的GFP蛋白，它比野生型GFP蛋白亮100 多倍。從pGFPmut2質(zhì)粒(購自Clonetech) DNA中獲得含GFPmut2基因的DNA片段，利用交叉PCR技術(shù)進行基因融合，將copA啟動子序列與gfpmut2基因及轉(zhuǎn)錄終止子SoxS序列融合后連接到T載體，經(jīng)測序正確后切下融合目的基因連接到pET28a載體形成融合報告載體 PcopA: :gfpmut2-pET28a0在此構(gòu)建中，基因組中cueR基因編碼產(chǎn)生的CueR蛋白結(jié)合于 copA啟動子序列。當(dāng)存在銅離子時，刺激PcopA: :gfpmut2融合基因的表達(dá)，產(chǎn)生GFPmut2 蛋白，產(chǎn)生的GFPmut2蛋白的量或其熒光強度與銅離子呈劑量依賴關(guān)系，所以通過測定熒光強度可以反映銅離子的含量。本發(fā)明的對銅離子高敏感的大腸桿菌生物傳感器的技術(shù)方案是由野生型大腸桿菌E. coli MC4100缺失copA、cueO和cusA三個基因，并轉(zhuǎn)化入融合報告載體 PcopA: :gfpmut2-pEI^8a，命名為E. coli WMC-006，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號CGMCC No. 46 ，保藏地點北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏時間2011年2月28日，分類名稱大腸埃希氏菌hcherichina coli。本發(fā)明的對銅離子高敏感的大腸桿菌生物傳感器解決了野生型大腸桿菌作為宿主菌的生物檢測法敏感性不高等問題，可以克服物理化學(xué)等方法受到實驗條件限制等的弊端，并且特異性好，敏感性高。


圖1單基因敲除流程圖；圖2利用交叉PCR技術(shù)進行基因融合示意圖；圖3融合報告載體PcopA: gfpmut2-pET28a的構(gòu)建流程圖；圖^at基因PCR電泳圖；圖 5copA: :cat/MC4100 菌株 PCR 鑒定電泳圖；M :lkb DNA ladder ； 1-2 引物 CopA-No/Co，copA: cat 突變菌與野生型細(xì)菌PCR產(chǎn)物大小分別為2044bp、353^p ；3-4 引物CueO-No/Co，cueO: cat突變菌與野生型細(xì)菌PCR 產(chǎn)物大小分別為2044bp、2586bp圖6單突變菌的PCR鑒定電泳圖；M :lkb DNA ladder1-3 引物CopA-No/Co，野生型細(xì)菌、copA: :cat突變菌、ACOpA(copA基因已缺失)4-6 引物Cue0-No/Co，野生型細(xì)菌、cueO: cat突變菌、AcueO (cueO基因已缺失)7-9 引物CusA-No/Co，野生型細(xì)菌、cusA: :cat突變菌、AcusA(cusA基因已缺失)圖7雙突變菌的PCR鑒定電泳圖；M :lkb DNA ladder ； 1-3 Δ copA-Δ cueO 突變菌 CueO-No/Co、CopA-No/Co、 CusA-No/Co 三對引物 PCR 產(chǎn)物；4-6 Δ cusA- Δ cueO 突變菌 CueO-No/Co、CopA-No/Co、 CusA-No/Co 三對引物 PCR 產(chǎn)物；7-9 Δ cusA- Δ copA 突變菌 CueO-No/Co、CusA-No/Co、 CopA-No/Co三對引物PCR產(chǎn)物圖8三突變菌的PCR鑒定電泳圖；M :lkb DNA ladder1-3 Δ cusA- Δ copA- Δ cueO 突變菌 CueO-No/Co、CopA-No/Co、CusA_No/Co 三對引物PCR產(chǎn)物圖9 E. coli MC4100基因組DNA提取電泳鑒定圖；M :lkb DNA ladder ； 1-2 基因組 DNA圖10 PCR擴增PcopA基因電泳圖；M :lkb DNA ladder ； 1-2 =PcopA 目的基因條帶圖 11 PCR 擴增 gfpmut2_soxSCo 基因電泳圖；M :lkb DNA ladder ； 1-3 :gfpmut2_soxSCo 目的基因圖 12 交叉 PCR 擴增 PcopA: gfpmut2 電泳圖；M :lkb DNA ladder ；1 :PcopA基因；2 :gfpmut2_soxSCo 基因 3 :gfpmut2_soxSCo 與 PcopA交叉PCR產(chǎn)物圖 13 生物傳感器 PcopA: gfpmut2-pET28a/ Δ cusA- Δ copA- Δ cueO 焚光蛋白的誘導(dǎo)及鑒定圖；A :PcopA: :gfpmut2_pET28a/AcusA-AcopA-AcueO 被不同濃度0_8，0， 1.0Xl(T8，1.0Xl(T7，1.0Xl(r6，1.0Xl(r5，1.0Xl(r4and LOXl(T3M)的銅離子所誘導(dǎo)后， 收獲菌體重懸于PH 8. O的Tris緩沖液中，其中1為pET28a/ACusA-ACOpA-ACue0陰性對照；B =SDS-PAGE全細(xì)胞電泳圖；C :A中7號標(biāo)本的發(fā)射光譜掃描圖；D :A中7號標(biāo)本的熒光共聚焦成像圖。
圖14報告菌株E. coli WMC-006與野生型及其他6種突變菌敏感性曲線圖；圖15報告菌株E. coli WMC-006特異性實驗柱狀圖；圖16不同pH條件下熒光強度變化曲線圖；圖17不同培養(yǎng)基對生物傳感器測定的影響柱狀圖；圖18最佳初始菌液濃度的探索實驗結(jié)果；圖19最佳誘導(dǎo)時間的探索及最適檢測范圍的確定實驗結(jié)果；圖20報告菌株E. coli WMC-006線性范圍曲線擬合結(jié)果。
具體實施例方式本發(fā)明所述對銅離子高敏感的大腸桿菌的構(gòu)建具體方法如下I、突變菌的制備(一)引物信息及合成基因敲除引物根據(jù)http://eCOgene. org/提供基因敲除的引物序列，Primer5. 0 及DNAMAN軟件，設(shè)計同源重組引物(見表1)，5'端為50bp的cat基因兩側(cè)的同源臂(表 1有單下劃線的部分)，3'端為20bp的用于擴增氯霉素抗性基因(表1有雙下劃線的部分)。上游同源臂引物Hl-Pl ；下游同源臂引物H2-P2?；蚯贸b定弓I 物利用 Harvard Molecular Technology Group & Lipper Center for Computational Genetics N^httpi/Zarep. med. harvard, edu/labgc/adnan/ projects/EcoliKO-primers/EcoliKOprimers. htm提供的一對跨越待敲除基因的外側(cè)設(shè)計敲除鑒定引物(見表幻。鑒定copA基因敲除引物設(shè)計上游引物CopA-No位于copA基因上游499bp，下游引物CopA-Co位于copA基因下游501bP ；鑒定cueO基因敲除引物設(shè)計上游引物位于cueO基因上游500bp，下游引物位于cueO基因下游502bp ；鑒定cusA基因敲除引物設(shè)計上游引物位于cusA基因上游496bp，下游引物位于cusA基因下游498bp。引物由大連寶生物公司合成。用無菌去離子水將引物溶解，配成濃度為ΙΟμπιοΙ/ L0表1基因敲除引物
權(quán)利要求
1.一種對重金屬銅離子高敏感的大腸桿菌生物傳感器的制備方法，其特征在于包含以下步驟(1)利用條件復(fù)制質(zhì)粒PKD46和PCP20，利用Red重組系統(tǒng)，敲除野生型大腸桿菌 E. coli MC4100 基因組中 copA、cueO 和 cusA 三個基因，構(gòu)建 AcopA-AcueO-AcusAHS 因突變菌株；(2)利用交叉PCR技術(shù)構(gòu)建含有報告基因gfpmut2與大腸桿菌copA基因啟動子PcopA 及轉(zhuǎn)錄終止子SoxS相融合的融合報告基因PcopA: :gfpmut2 ；(3)將步驟2所得片段克隆到pMDIS-T載體上，構(gòu)建PcopA: gfpmut2-T重組載體；(4)測序分析正確的重組載體PcopA gfpmut2-T經(jīng)雙酶切切下目的條帶連接到 pET28a載體上，構(gòu)建融合報告載體PcopA: gfpmut2-pET28a ；(5)將步驟(4)所得融合報告載體轉(zhuǎn)入步驟1構(gòu)建的ΔcopA-AcueO-AcusA三基因突變菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述對重金屬銅離子高敏感的大腸桿菌生物傳感器的制備方法，其特征在于步驟(1)中Δ copA-AcueO-AcusA三基因突變菌株的制備依次包括有如下步驟1、引物信息及合成；2、單突變菌AcopA的制備；3、雙突變菌AcopA-AcueO的制備；4、 三突變菌Δ copA-AcueO-AcusA的制備；其中上述步驟2中的單突變菌AcopA的制備具體是一、PKD46/MC4100菌株制備；二、帶FRT位點的cat基因PCR擴增；三、pKD46/MC4100 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備；四、電轉(zhuǎn)化cat基因 ’五、cat基因的PCR鑒定；六、pCP20的轉(zhuǎn)化； 七、cat抗性基因的消除；八、AcopA單突變菌的純化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述對重金屬銅離子高敏感的大腸桿菌生物傳感器的制備方法，其特征在于所述的報告基因選用選用編碼增強型綠色熒光蛋白的gfpmut2基因，融合報告基因PcopA: :gfpmut2的制備依次包括有如下步驟1、引物信息及合成；2、E. coli MC4100細(xì)菌基因組DNA的提??；3、PCR擴增PcopA ；4、PCR擴增gfpmut2_soxSCo基因；5、交叉PCR獲得融合報告基因PcopA: :gfpmut2 ；6、PCR產(chǎn)物膠回收。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述對重金屬銅離子高敏感的大腸桿菌生物傳感器的制備方法，其特征在于融合報告載體PcopA: gfpmut2-pET28a制備依次包括有如下步驟(一) 試劑盒提取質(zhì)粒pET28a ； (二)pET28a質(zhì)粒的雙酶切及其回收；(三)目的片斷與載體的連接反應(yīng)；(四)將連接好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中；(五)陽性克隆的鑒定。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述對重金屬銅離子高敏感的大腸桿菌生物傳感器的制備方法，其特征在于融合報告載體PCOpA::gfpmUt2-pET28a制備依次包括有如下步驟(一)試劑盒提取質(zhì)粒pET28a ； (二)pET a質(zhì)粒的雙酶切及其回收；(三)目的片斷與載體的連接反應(yīng)； (四)將連接好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中；(五)陽性克隆的鑒定。
6.按照上述制備方法得到的對重金屬銅離子高敏感的大腸桿菌生物傳感器，其特征在于由野生型大腸桿菌Ε. coli MC4100缺失copA、cueO和cusA三個基因，并轉(zhuǎn)入融合報告載體 PcopA: gfpmut2-pET28a。
全文摘要
本發(fā)明涉及大腸桿菌生物傳感器制備方法及其產(chǎn)品，制備方法的技術(shù)方案是(1)利用Red重組系統(tǒng)，敲除野生型大腸桿菌E.coli MC4100基因組中copA、cueO和cusA三個基因；(2)利用交叉PCR技術(shù)構(gòu)建融合報告基因PcopA::gfpmut2；(3)將步驟2所得片段克隆到pMD18-T載體上；(4)將載體PcopA::gfpmut2-T經(jīng)雙酶切切下目的條帶連接到pET28a載體上；(5)將步驟4所得融合報告載體轉(zhuǎn)化至步驟1的ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA三基因突變菌株。上述方案得到產(chǎn)品是由野生型大腸桿菌E.coli MC4100缺失copA、cueO和cusA三個基因，并轉(zhuǎn)化入融合報告載體PcopA::gfpmut2-pET28a，本發(fā)明產(chǎn)品具有特異、敏感、快速、簡便、高效和高性價比等特點，適用于銅離子的野外實時實地監(jiān)測。
文檔編號C12N15/09GK102417901SQ201110259158
公開日2012年4月18日 申請日期2011年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月25日
發(fā)明者李 東, 洪旭芬, 王娟娟, 譚國強, 趙建國 申請人:溫州醫(yī)學(xué)院