專(zhuān)利名稱(chēng)：一種耐高溫的脂肪酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、酶學(xué)、生理學(xué)領(lǐng)域。具體的說(shuō)，涉及一種經(jīng)過(guò)分子生物學(xué)手段改造、可以耐高溫的脂肪酶DNA序列及其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。
背景技術(shù)：
脂肪酶(lipase，EC3. 1. 1. 3)是一類(lèi)催化三酰甘油酯分解、合成和酯交換的酶類(lèi)， 具有極強(qiáng)的選擇性和專(zhuān)一性，并具有在水相和有機(jī)相界面催化反應(yīng)的獨(dú)特性能，已被廣泛應(yīng)用于食品、油脂化工等行業(yè)。隨著應(yīng)用領(lǐng)域的拓寬，已涉及到單細(xì)胞蛋白生產(chǎn)、化妝品生產(chǎn)、環(huán)境保護(hù)、新型生物材料、生物傳感器、生物醫(yī)學(xué)及生物能源等新興領(lǐng)域，有著廣闊的應(yīng)用前景。脂肪酶廣泛存在于自然界的動(dòng)、植物和微生物體內(nèi)。如細(xì)菌有觀個(gè)屬、放線菌4 個(gè)屬、酵母菌10個(gè)屬、其它真菌23個(gè)屬均能產(chǎn)生脂肪酶。鑒于微生物脂肪酶具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值和潛在的巨大需求，許多工業(yè)化實(shí)驗(yàn)室與科研單位長(zhǎng)期從事著繁瑣的高產(chǎn)脂肪酶微生物篩選工作，但因?yàn)槲⑸锷L(zhǎng)條件的復(fù)雜性，使得具有特殊性質(zhì)的脂肪酶資源開(kāi)發(fā)受到微生物生長(zhǎng)的限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種新型耐高溫的脂肪酶及其結(jié)構(gòu)基因。該基因表達(dá)產(chǎn)物脂肪酶在高溫條件下顯示活性，可以應(yīng)用于食品、化工等需要高溫條件應(yīng)用脂肪酶的環(huán)境， 如在食品加工經(jīng)過(guò)高溫處理，此脂肪酶應(yīng)可保持較好的活力。為了達(dá)到本發(fā)明的目的，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下由GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得變形斑沙雷菌S. proteamaculans脂肪酶基因序列附圖1，合成此基因序列并與質(zhì)粒 PUC18相連(不僅限于此克隆載體)，以含脂肪酶基因的質(zhì)粒DNA作為模板，a (5 ‘一 CTT GAA TTC GAT TAGAGT CGT ATA AGA TG 一 3，EcoR I)禾口 b (5 — CTT GGT ACC TTA ATT CGT ATT CTG TCC TC-3KpnI)為引物進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增。每IOOul反應(yīng)體系為IOul IOx易錯(cuò)PCR 緩沖液(500mmol/L KCl,70mmol/L MgCl2,100mmol/L Tris-HCI pH8. 3,0. 1% (w/v 明膠)； IOul 10 X dNTP 混合物(2mmol/L dGTP,2mmol/L dATP，lOmmol/LdCTP 禾Π lOmmol/LdTTP)； 弓丨物 a 禾口 b 各 30pmol ；IOul 的 5mmol/L MnCl2 ；質(zhì)粒 DNA 模板 20pmol ；Taq DNA 聚合酶為 5U，再加入滅菌的超純水至總體積為IOOul。PCR程序?yàn)?5°C，5min ;94°C 30S，52°C lmin， 72°C lmin，35個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0將PCR產(chǎn)物以(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳，用PCR純化回收試劑盒進(jìn)行純化回收。純化后的易錯(cuò)PCR產(chǎn)物與pMDlS-T載體連接(不限于此載體)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞(不限于此受體，但受體應(yīng)于質(zhì)粒載體對(duì)應(yīng))，涂布LB (含lOOug/mL的Amp)平板，挑選具有插入片段的克隆，組成突變體庫(kù)。將所有轉(zhuǎn)化子挑取至RB(1000mL LB培養(yǎng)基中加入20mL 0.2% (W/V)羅丹明B和40mL橄欖油乳化液，pH 自然)平板，于37°C培養(yǎng)24h后，選取有變色現(xiàn)象的轉(zhuǎn)化子。分別接種到3mL LB培養(yǎng)基(含 100ug/mL氨芐青霉素)，37°C劇烈振搖至OD6tltl約0. 6，各吸取3ul菌液滴至羅丹明B平板，37°C培養(yǎng)12 24h后可見(jiàn)明顯變色現(xiàn)象。選取變色快和變色圈大的克隆進(jìn)行液體發(fā)酵，制備足夠的菌液量，低溫下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后超聲波破碎細(xì)胞，離心收集上清液，用pNPP法測(cè)定脂肪酶活力。分組，調(diào)節(jié)溫度至85°C，各保持2小時(shí)，期間20分鐘測(cè)定一次脂肪酶活力見(jiàn)圖2，選擇一份酶活力降低不足10%的樣品，(此后采用相同方法對(duì)此轉(zhuǎn)化子的脂肪酶酶液在80°C、75°C進(jìn)行測(cè)定，酶活力穩(wěn)定)，將其對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)化子DNA測(cè)序(其核苷酸序列與氨基酸序列見(jiàn)SEQ NO. 1和SEQ NO. 2)。測(cè)序結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)基因中共有3個(gè)堿基發(fā)生了突變，分別是a32g、c76a、t4c。由此造成的6個(gè)氨基酸發(fā)生變化OlllR、L26I, S2P)，形成本發(fā)明涉及的一種新的高溫條件下具有降解脂肪能力的脂肪酶。本發(fā)明涉及的脂肪酶是一種新型脂肪酶，其一級(jí)結(jié)構(gòu)由于3個(gè)氨基酸的突變與已知的脂肪酶性質(zhì)大不相同，從而造成具有更高的耐高溫的能力，適合于高溫工藝中油脂類(lèi)物質(zhì)的處理，在食品、化工等多個(gè)領(lǐng)域具有廣闊的用途。


圖1變形斑沙雷菌S. proteamaculans原脂肪酶基因序列；圖2高溫下脂肪酶活力相對(duì)變化
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆》(1989)中所述條件進(jìn)行。在本發(fā)明的實(shí)施例中使用的E. coli BL21和載體PED8購(gòu)自Novagen公司。實(shí)施例1 耐高溫脂肪酶酶液的獲得依照SEQ NO. 1合成耐高溫脂肪酶基因，PCR擴(kuò)增合成產(chǎn)物與質(zhì)粒pEI^8_a經(jīng)酶切后連接并轉(zhuǎn)化E. coli BL2 1(不僅限于此質(zhì)粒與對(duì)應(yīng)受體)。37°C液體發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)后超聲波破碎細(xì)胞，離心收集上清液，即為含此耐高溫脂肪酶酶液。實(shí)施例2:耐高溫脂肪酶水解油脂向40%的植物油溶液中(調(diào)節(jié)溫度至80°C )中，加入適量酶液，以每分鐘100轉(zhuǎn)攪拌2小時(shí)，色譜法測(cè)得油相含有脂肪酸，水相含有甘油，說(shuō)明脂肪酶可水解油脂產(chǎn)生甘油和脂肪酸。
權(quán)利要求
1.一種耐高溫的脂肪酶，其氨基酸序列由SEQ NO. 2所示的氨基酸序列組成。
2.一種編碼權(quán)利1所述的耐高溫脂肪酶的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其核苷酸序列由SEQNO. 1所示的核苷酸序列組成。
4.含有權(quán)利3所述的基因的重組質(zhì)粒。
5.含有權(quán)利要求4所述的重組菌。
6.利用權(quán)利要求1、2或3制備的脂肪酶。
7.通過(guò)權(quán)利要求1、2、3或5得到的耐高溫脂肪酶在食品、化工、環(huán)保等工業(yè)方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種經(jīng)過(guò)改造可以在高溫條件下具有降解油脂能力脂肪酶的核苷酸序列和氨基酸序列，本發(fā)明的技術(shù)方案要點(diǎn)為首先合成變形斑沙雷菌脂肪酶基因，將其與質(zhì)粒相連，然后設(shè)計(jì)引物進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增，純化易錯(cuò)PCR產(chǎn)物與載體相連后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選出含有耐高溫脂肪酶的轉(zhuǎn)化子，測(cè)序確定新構(gòu)建脂肪酶的基因序列。該耐受高溫的脂肪酶可以克服現(xiàn)有應(yīng)用中，高溫條件下使用的脂肪酶，酶活力下降快、實(shí)用性差的缺陷，以實(shí)現(xiàn)脂肪酶在使用過(guò)程中耐溫性能高、穩(wěn)定性好、降低成本、減少工藝與實(shí)用性好的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102485887SQ20111025929
公開(kāi)日2012年6月6日 申請(qǐng)日期2011年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月5日
發(fā)明者劉剛, 張柏松, 方井霞, 蘇東風(fēng) 申請(qǐng)人:劉剛