專(zhuān)利名稱(chēng)：雙齒圍沙蠶細(xì)胞色素氧化酶基因的克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，尤其涉及-的克隆方法。
4中雙齒圍沙蠶細(xì)胞色素氧化酶基因(CYP4)
背景技術(shù)：
多毛類(lèi)隸屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)，是廣泛分布于海洋近岸和河口潮灘的優(yōu)勢(shì)底棲動(dòng)物， 也是海洋生態(tài)系統(tǒng)能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)的重要環(huán)節(jié)。由于其具有體型大、生命周期長(zhǎng)、行動(dòng)緩慢、分布廣泛，對(duì)許多持久性污染物具有較強(qiáng)的耐受性和生物利用性，因此一直作為海洋沉積環(huán)境污染評(píng)價(jià)的指示生物和毒理研究的模型動(dòng)物。如沙蠶種群分布的生活環(huán)境常有石油烴等污染，一些沙蠶種群對(duì)石油烴(PHs)表現(xiàn)出較高的耐受能力并有一定的降解能力， Christensen等研究了沙蠶在芘暴露試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，體內(nèi)50%的芘發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化成水溶性物質(zhì)，沙蠶暴露于殺蟲(chóng)劑類(lèi)溴氰菊酯(DM)中的表現(xiàn)也極其敏感。雙齒圍沙蠶iPerinereis aibuhitensis)在遼東灣潮間帶底棲生物中為優(yōu)勢(shì)種， 其細(xì)胞色素氧化酶基因序列在GenBank中已有記載，全長(zhǎng)1857個(gè)堿基，其中，開(kāi)放閱讀框?yàn)?1446個(gè)堿基，序列如下
權(quán)利要求
1. 一種雙齒圍沙蠶細(xì)胞色素氧化酶基因的克隆方法，其特征在于按下列步驟進(jìn)行a.提取及純化雙齒圍沙蠶總RNA，合成cDNA第一鏈；b.應(yīng)用一對(duì)引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)雙齒圍沙蠶cDNA第一鏈進(jìn)行擴(kuò)增 所述正向引物5 ‘ -ATGTTTGARG⑶CAWGAMAC-3 ‘，所述反向引物5 ‘ -AATNTTGNCCHATRCARTT-3 ‘；c.應(yīng)用5'RACE PCR引物對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行5' RACE擴(kuò)增，得到雙齒圍沙蠶cDNA5 ‘端序列；所述 5 ‘ RACE PCR 正向引物5 ‘ -GATTAGGGGCACTGGACACC-3 ‘； 所述 5 ‘ RACE PCR 反向引物5 ‘ -CCGCCAGCAACTCGTCAAGT-3 ‘；d.應(yīng)用3'RACE PCR引物對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行3' RACE擴(kuò)增，得到雙齒圍沙蠶cDNA3 ‘端序列；所述 3 ‘ RACE PCR 正向引物5 ‘ -GCCCCTAATCAGCCGACAAC-3 ‘； 所述 3 ‘ RACE PCR 反向引物5 ‘ -GGGGGAAGACCATGATGAAT-3 ‘；e.將雙齒圍沙蠶cDNA5'端序列與雙齒圍沙蠶cDNA3‘端序列拼接，即獲得雙齒圍沙蠶細(xì)胞色素氧化酶基因。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種雙齒圍沙蠶細(xì)胞色素氧化酶基因的克隆方法，是通過(guò)設(shè)計(jì)特異性片段擴(kuò)增和RACE擴(kuò)增的方法，從雙齒圍沙蠶體壁肌肉總RNA中克隆得到了雙齒圍沙蠶的細(xì)胞色素氧化酶基因，可利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)雙齒圍沙蠶在受到持久性有機(jī)污染物脅迫下細(xì)胞色素氧化酶基因表達(dá)的規(guī)律，為探討重金屬對(duì)沙蠶細(xì)胞色素氧化酶基因表達(dá)、調(diào)控的作用機(jī)理提供依據(jù)，亦為篩選海洋沉積環(huán)境污染早期生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的分子生物標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)，利于成本低、來(lái)源豐富的雙齒圍沙蠶在環(huán)境保護(hù)中廣泛應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/53GK102286498SQ201110261349
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月6日
發(fā)明者何潔, 周一兵, 楊大佐, 王斌, 趙歡, 陳雪 申請(qǐng)人:大連海洋大學(xué)