專利名稱：牽引絲蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸、由核酸編碼的蛋白質(zhì)、導(dǎo)入有核酸的重組生物及由重組生物制作的蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
蜘蛛的絲作為因兼具強(qiáng)度和彈性而具有優(yōu)異強(qiáng)韌性的天然高性能聚合物而為人所知。蜘蛛中存在最多7個(gè)經(jīng)特化的腺體，這些腺體產(chǎn)生性質(zhì)不同的多種蜘蛛絲，其中由大壺狀腺體產(chǎn)生的牽引絲作為最強(qiáng)韌的蜘蛛絲在醫(yī)療、航空、衣料等各種產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域中的新原材料的開發(fā)中備受關(guān)注。作為構(gòu)成牽引絲的主要蛋白質(zhì)，已知被稱作大壺狀腺絲蛋白(Major Ampullate Spidroin =MaSp)的蛋白質(zhì)，目前編碼黑寡婦蜘蛛(Latrodectus hesperus)、幾何寇蟲朱(Latrodectus geometricus) > ^ ^H^ (Nephila clavipes) 禾中■蟲朱白勺 MaSp 胃白質(zhì)的基因序列已經(jīng)清楚(非專利文獻(xiàn)1 :Nadia A. Ayoub et al. , Blueprint for a High-Performance Biomaterial :Full_Length Spider Dragline Silk Genes,2007, Issue 6, e514 ；非專禾丨J 文獻(xiàn) 2 :ffilliam A. Gaines IV et al. , Identification and Characterization of Multiple Spidroin 1 Genes Encoding Major Ampullate Silk Proteins in Nephila clavipes, Insect Mol Biol，2008，17(5)，465-474 等)。

發(fā)明內(nèi)容
但是，在各產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域中，對(duì)具有優(yōu)異物性的天然纖維的需求有所增加的同時(shí)，期待更新的原材料的開發(fā)。因而，本發(fā)明的目的在于提供在天然纖維中具有優(yōu)異物性的新原材料。本發(fā)明人等為了達(dá)成上述目的反復(fù)進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，編碼構(gòu)成人面蜘蛛(N印hi la pillipes)的牽引絲的MaSp蛋白質(zhì)的基因具有與目前已知的MaSp基因不同的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，進(jìn)而完成了本發(fā)明。SP，本發(fā)明涉及(1)下述(a) (d)中任一種的核酸。(a)具有序列號(hào)1或19的堿基序列的核酸(b)編碼具有序列號(hào)2或20的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸(c)與上述(a)的核酸具有90%以上的序列同一性且編碼牽引絲蛋白的核酸(d)在嚴(yán)格的條件下與上述(a)的核酸的互補(bǔ)鏈雜交且編碼牽引絲蛋白的核酸另外，本發(fā)明涉及(2)核酸，其含有下述(e) (h)中任一種的核酸，并且其與具有序列號(hào)1的堿基序列的核酸具有70%以上、優(yōu)選80%以上的序列同一性，并編碼牽引絲蛋白。(e)具有序列號(hào)3、5、7、9、11、13、15或17的堿基序列的核酸(f)編碼具有序列號(hào)4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸(g)與上述(e)的核酸具有90%以上的序列同一性的核酸
(h)在嚴(yán)格的條件下與上述(e)的核酸的互補(bǔ)鏈雜交的核酸另外，本發(fā)明涉及(3)上述(2)所述的核酸，其與具有序列號(hào)1的堿基序列的核酸具有80%以上的序列同一性。另外，本發(fā)明涉及(4)核酸，其含有下述(i) (1)中任一種的核酸，并且其與具有序列號(hào)19的堿基序列的核酸具有70%以上、優(yōu)選80%以上的序列同一性，并編碼牽引絲蛋白。⑴具有序列號(hào)21、23、25、27、29、31、33或35的堿基序列的核酸(j)編碼具有序列號(hào)22、24J6、28、30、32、34或36的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸(k)與上述(i)的核酸具有90%以上的序列同一性的核酸(1)在嚴(yán)格的條件下與上述(i)的核酸的互補(bǔ)鏈雜交的核酸另外，本發(fā)明涉及(5)上述(4)所述的核酸，其與具有序列號(hào)19的堿基序列的核酸具有80%以上的序列同一性。另外，本發(fā)明涉及(6)由上述(1) (5)中任一種的核酸編碼的蛋白質(zhì)。根據(jù)上述本發(fā)明的特定核酸，可以編碼與現(xiàn)有MaSp蛋白質(zhì)不同的具有優(yōu)異物性的MaSp蛋白質(zhì)(牽引絲蛋白)、從而提供天然纖維的新原材料。特別是，由本發(fā)明的核酸編碼的牽引絲蛋白(本發(fā)明的蛋白質(zhì))具有比現(xiàn)有品更為優(yōu)異的彈性(或彈力、伸縮性、伸長率、柔軟性)，適合用于以醫(yī)療用品、衣料品等為代表的各種產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域中需要彈性的用途中。而且，本發(fā)明涉及(7)導(dǎo)入有上述(1) (5)中任一種核酸的重組生物及(9)由上述(7)的重組生物制作的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的重組生物，可以生產(chǎn)大量的由上述核酸編碼的物性優(yōu)異的牽引絲蛋白。由上述重組生物制作的蛋白質(zhì)通過含有物性優(yōu)異的牽引絲蛋白，適合用于各種產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域中。特別是，本發(fā)明涉及⑶導(dǎo)入有上述(1) (5)中任一種核酸的重組桑蠶及(10) 由該重組桑蠶制作的蠶絲。根據(jù)本發(fā)明的重組桑蠶，可以生產(chǎn)大量的含有由上述核酸編碼的物性優(yōu)異的牽引絲蛋白的蠶絲。由上述重組桑蠶制作的蠶絲通過含有物性優(yōu)異的牽引絲蛋白，具有比現(xiàn)有蠶絲更為優(yōu)異的物性、特別是更為優(yōu)異的彈性。另外，本發(fā)明涉及(11)具有下述(m)或(η)的氨基酸序列的牽引絲蛋白。(m)序列號(hào)2或20的氨基酸序列(η)與上述(m)的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列另外，本發(fā)明涉及(12)具有下述(ο)或(ρ)的氨基酸序列的牽引絲蛋白。(ο)具有下述(ol)或(o2)的氨基酸序列且與序列號(hào)2的氨基酸序列具有70%以上、優(yōu)選80%以上的序列同一性的氨基酸序列(ol)序列號(hào)4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列(02)與上述(ol)的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列(ρ)具有下述(pi)或(p2)的氨基酸序列且與序列號(hào)20的氨基酸序列具有70% 以上、優(yōu)選80%以上的序列同一性的氨基酸序列(pi)序列號(hào)22、24、沈、28、30、32、；34或36的氨基酸序列(p2)與上述(pi)的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列另外，本發(fā)明涉及(13)上述(12)所述的牽引絲蛋白，其中，上述(ο)的氨基酸序列與序列號(hào)2的氨基酸序列具有80%以上的序列同一性、上述(ρ)的氨基酸序列與序列號(hào)20的氨基酸序列具有80%以上的序列同一性。而且，本發(fā)明涉及(14)具有下式(1)所示的氨基酸序列或與式(1)所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。[X1-X2-X3- (X4) m- (X5) m- (X6) m-X7-X8] n (1)上述式(1)中，m各自獨(dú)立地表示0或1的整數(shù)、η表示1 10的整數(shù)、Xl表示序列號(hào)37 45中的任一種氨基酸序列、Χ2表示序列號(hào)46 52中的任一種氨基酸序列、Χ3 表示序列號(hào)53 59中的任一種氨基酸序列、Χ4表示序列號(hào)49的氨基酸序列、)(5表示序列號(hào)60或61的氨基酸序列、)(6表示序列號(hào)62 64中的任一種氨基酸序列、Χ7表示序列號(hào) 65 70中的任一種氨基酸序列、Χ8表示序列號(hào)71 81中的任一種氨基酸序列。上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)而具有比現(xiàn)有牽引絲蛋白更為優(yōu)異的物性，因而適合用于各種產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域中。根據(jù)本發(fā)明的核酸，可以提供具有優(yōu)異物性的蛋白質(zhì)。另外，根據(jù)本發(fā)明的重組生物，可以生產(chǎn)大量的具有優(yōu)異物性的蛋白質(zhì)。特別是，根據(jù)本發(fā)明的重組桑蠶，可以生產(chǎn)大量的具有優(yōu)異物性的蠶絲。由本發(fā)明提供的牽引絲蛋白或蠶絲具有特別優(yōu)異的彈性。如此， 根據(jù)本發(fā)明，可以提供彈性等物性優(yōu)異的天然纖維的新原材料。


圖1為表示NP-牽引絲蛋白A的cDNA序列的圖。圖2為表示NP-牽引絲蛋白A的氨基酸序列的圖。圖3為表示Northen雜交結(jié)果的照片圖。圖4為表示NP-牽引絲蛋白B的cDNA序列的圖。圖5為表示NP-牽引絲蛋白B的氨基酸序列的圖。
具體實(shí)施例方式以下根據(jù)需要參照著附圖詳細(xì)地說明用于實(shí)施本發(fā)明的方式。但本發(fā)明并不限定于以下的實(shí)施方式。本發(fā)明涉及下述(a) (d)中任一種的核酸。(a)具有序列號(hào)1或19的堿基序列的核酸(b)編碼具有序列號(hào)2或20的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸(c)與上述(a)的核酸具有90%以上的序列同一性且編碼牽引絲蛋白的核酸(d)在嚴(yán)格的條件下與上述(a)的核酸的互補(bǔ)鏈雜交且編碼牽引絲蛋白的核酸首先，本發(fā)明涉及具有序列號(hào)1或19的堿基序列的核酸(a)。序列號(hào)1或19的堿基序列均是對(duì)作為構(gòu)成絡(luò)新婦屬人面蜘蛛(Nephila pilipes)的牽引絲的蛋白質(zhì)主要成分的被稱作大壺狀腺絲蛋白(Major Ampullate Spidroin =MaSp)的蛋白質(zhì)(多肽)進(jìn)行編碼的基因。本說明書中，將由具有序列號(hào)1的堿基序列的核酸編碼的蛋白質(zhì)稱作“NP-牽引絲蛋白A”、將由具有序列號(hào)19的堿基序列的核酸編碼的蛋白質(zhì)稱作“NP-牽引絲蛋白B”。這些核酸(a)不需要由人面蜘蛛獲取，只要是具有序列號(hào)1或19的堿基序列，則可以通過人工合成或由基因組文庫或cDNA文庫獲取，還可以是用PCR對(duì)它們進(jìn)行擴(kuò)增而得到的核酸或者用限制酶將它們進(jìn)行切斷而得到的核酸。
本發(fā)明的核酸還可以是編碼具有序列號(hào)2或20的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸 (b)。序列號(hào)2或20的氨基酸序列均為人面蜘蛛的MaSp蛋白質(zhì)所具有的氨基酸序列。具體地說，序列號(hào)2的氨基酸序列為上述NP-牽引絲蛋白A所具有的氨基酸序列、序列號(hào)20 的氨基酸序列為上述NP-牽引絲蛋白B所具有的氨基酸序列。另外，本發(fā)明的核酸只要是編碼牽引絲蛋白(MaSp)，則還可以是與具有序列號(hào)1 或19的堿基序列的核酸具有90%以上的序列同一性的核酸(C)。上述序列同一性只要為 90%以上即可，優(yōu)選為93%以上、更優(yōu)選為95%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為98%以上。而且，本發(fā)明的核酸只要是編碼牽引絲蛋白，則也可以是在嚴(yán)格的條件下與具有序列號(hào)1或19的堿基序列的核酸的互補(bǔ)鏈進(jìn)行雜交的核酸(d)。本說明書中，核酸的“互補(bǔ)鏈”是指基于核酸的堿基間的氫鍵而相對(duì)應(yīng)的核酸序列(例如T與A相對(duì)應(yīng)、C與G相對(duì)應(yīng))。另外，“雜交”是指在上述互補(bǔ)鏈之間發(fā)生的互補(bǔ)鍵合或者單鏈核酸分子間的堿基對(duì)相互作用的形成。本說明書中，“嚴(yán)格的條件“是指相對(duì)于目標(biāo)序列具有同源性的核苷酸鏈的互補(bǔ)鏈優(yōu)先地與目標(biāo)序列雜交、而不具有同源性的核苷酸鏈的互補(bǔ)鏈實(shí)質(zhì)上不發(fā)生雜交的條件。 嚴(yán)格的條件是序列依賴性的，在各種狀況下有所不同。越長的序列在越高的溫度下特異性地發(fā)生雜交。一般來說，嚴(yán)格的條件選擇比規(guī)定的離子強(qiáng)度和PH下的特定序列的熱熔融溫度(Tm)約低5°C。Tm是在規(guī)定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下與目標(biāo)序列互補(bǔ)的核苷酸的50%以平衡狀態(tài)與目標(biāo)序列發(fā)生雜交的溫度?！皣?yán)格的條件”是序列依賴性的，隨各種環(huán)境參數(shù)的不同而不同。核酸雜交的一般性方針可在Tijssen (Tijssen (199 、Laboratory Technniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I、第 2 章"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay，，、Elsevier, New York)中找到。代表性地來說，嚴(yán)格的條件為鹽濃度約小于1. OM Na+、代表性地是pH7. 0 8. 3下約0. 01 1. OM的Na+濃度(或其他的鹽)，溫度對(duì)于短核苷酸(例如10 50個(gè)核苷酸) 而言至少約30°C、對(duì)于長核苷酸(例如長于50個(gè)核苷酸)而言至少約60°C。嚴(yán)格的條件還可以通過添加甲酰胺等不穩(wěn)定化劑來達(dá)成。作為本說明書中的嚴(yán)格的條件，可舉出在50% 的甲酰胺、IM的NaCl、l %的SDS(37°C )的緩沖溶液中的雜交、和用0. IXSSC在60°C下的洗滌。另外，本發(fā)明的核酸只要是含有下述(e) (h)中的任一種核酸且編碼牽引絲蛋白，則也可以是與具有序列號(hào)1的堿基序列的核酸具有70%以上的序列同一性的核酸。上述序列同一性只要為70%以上即可，優(yōu)選為75%以上、更優(yōu)選為80%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為 85%以上、特別優(yōu)選為88%以上。(e)具有序列號(hào)3、5、7、9、11、13、15或17的堿基序列的核酸(f)編碼具有序列號(hào)4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸(g)與上述(e)的核酸具有90%以上的序列同一性的核酸(h)在嚴(yán)格的條件下與上述(e)的核酸的互補(bǔ)鏈雜交的核酸上述序列號(hào)3、5、7、9、11、13、15及17的堿基序列為在序列號(hào)1的堿基序列中在編碼本發(fā)明的具有優(yōu)異物性的牽引絲蛋白的方面上具有重要特征的序列。通過含有具有這種特征序列的核酸，即便是與具有序列號(hào)1的堿基序列的核酸僅有70%以上的序列同一性的核酸，也可與具有序列號(hào)1的堿基序列的核酸同樣地編碼本發(fā)明的具有優(yōu)異物性的牽引絲蛋白。具有序列號(hào)4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列的蛋白質(zhì)分別為由上述序列號(hào)3、5、7、9、11、13、15或17的堿基序列編碼的蛋白質(zhì)。上述核酸(g)中，與核酸(e)的序列同一性只要為90%以上即可，優(yōu)選為93%以上、更優(yōu)選為95%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為98%以上。另外，本發(fā)明的核酸只要是含有下述(i) (1)中任一種的核酸且編碼牽引絲蛋白，則也可以是與具有序列號(hào)19的堿基序列的核酸具有70%以上的序列同一性的核酸。上述序列同一性只要為70%以上即可，優(yōu)選為75%以上、更優(yōu)選為80%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為 85%以上、特別優(yōu)選為88%以上。(i)具有序列號(hào)21、23、25、27、四、31、33或35的堿基序列的核酸(j)編碼具有序列號(hào)22、24J6、28、30、32、34或36的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸(k)與上述(i)的核酸具有90%以上的序列同一性的核酸(1)在嚴(yán)格的條件下與上述(i)的核酸的互補(bǔ)鏈雜交的核酸上述序列號(hào)21、23、25、27、四、31、33及35的堿基序列是在序列號(hào)19的堿基序列中在編碼本發(fā)明的具有優(yōu)異物性的牽引絲蛋白的方面上具有重要特征的序列。通過含有具有這種特征序列的核酸，即便是與具有序列號(hào)19的堿基序列的核酸僅具有70%以上的序列同一性的核酸，也可與具有序列號(hào)19的堿基序列的核酸同樣地編碼本發(fā)明的具有優(yōu)異物性的牽引絲蛋白。具有序列號(hào)22、24J6、28、30、32、34或36的氨基酸序列的蛋白質(zhì)分別為由上述序列號(hào)21、23、25、27、29、31、33或35的堿基序列編碼的蛋白質(zhì)。上述核酸(k)中，與核酸(i)的序列同一性只要為90%以上即可，優(yōu)選為93%以上、更優(yōu)選為95%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為98%以上。另外，本發(fā)明涉及導(dǎo)入有上述本發(fā)明的核酸的重組生物及由該重組生物制作的蛋白質(zhì)。特別是本發(fā)明涉及導(dǎo)入有上述本發(fā)明的核酸的重組桑蠶及由該重組桑蠶制作的蠶絲。本說明書中，“重組生物”是指利用基因重組將外來基因?qū)胫寥旧w中進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的生物。作為被轉(zhuǎn)化的生物，并無特別限定，可以使用昆蟲、動(dòng)物、植物、微生物等，優(yōu)選使用昆蟲。作為優(yōu)選的昆蟲，可以舉出桑蠶(Bombyx mori)、野桑蠶(Bombyx mandarina)、天蠶(Antheraea yamamai)、柞蠶(Antheraea pernyi)等。其中優(yōu)選使用屬于蠶蛾科的桑蠶、 野桑蠶等，特別優(yōu)選使用桑蠶。本說明書中，“桑蠶”是指蠶蛾屬桑蠶(Bombyx mori) 0桑蠶可以是實(shí)驗(yàn)用的品種也可以是經(jīng)實(shí)用商品化的實(shí)用品種。另外，“重組桑蠶”是指利用基因重組將外來基因?qū)胫辽ＰQ染色體中進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的桑蠶。基因重組例如通過使用轉(zhuǎn)座子的方法來進(jìn)行，但只要是能夠?qū)⑼鈦砘驅(qū)胫辽ＰQ中的方法則沒有限定，還可以通過電穿孔法等其他的方法來進(jìn)行基因重組。本說明書中，“蠶絲”是指由桑蠶(Bombyx mori)吐出的纖維，其構(gòu)成繭，以絲蛋白為主成分。絲蛋白由大小2個(gè)亞單元(H鏈及L鏈)構(gòu)成。本說明書中，“人面蜘蛛”是指絡(luò)新婦屬人面蜘蛛(N印hila pilipes)，對(duì)人面蜘蛛的產(chǎn)地并無特別限定。另外，本發(fā)明涉及具有下述(m)或(η)的氨基酸序列的牽引絲蛋白。(m)序列號(hào)2或20的氨基酸序列(η)與上述(m)的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列上述氨基酸序列(η)中，與上述(m)的氨基酸序列的序列同一性只要為90%以上即可，優(yōu)選為93%以上、更優(yōu)選為95%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為98%以上。另外，本發(fā)明涉及具有下述(O)或(ρ)的氨基酸序列的牽引絲蛋白。(ο)具有下述(ol)或(o2)的氨基酸序列且與序列號(hào)2的氨基酸序列具有70%以上的序列同一性的氨基酸序列(ol)序列號(hào)4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列(02)與上述(ol)的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列(ρ)具有下述(pi)或(p2)的氨基酸序列且與序列號(hào)20的氨基酸序列具有70% 以上的序列同一性的氨基酸序列(pi)序列號(hào) 22,24,26,28,30,32,34 或 36 的氨基酸序列(p2)與上述(pi)的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列上述氨基酸序列(ο)中，與序列號(hào)2的氨基酸序列的序列同一性只要為70%以上即可，優(yōu)選為75 %以上、更優(yōu)選為80%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為85 %以上、特別優(yōu)選為88%以上。同樣地，上述氨基酸序列(ρ)中，與序列號(hào)20的氨基酸序列的序列同一性只要為 70%以上即可，優(yōu)選為75%以上、更優(yōu)選為80%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為85%以上、特別優(yōu)選為 88%以上。另外，上述氨基酸序列(02)中，與上述(ol)的氨基酸序列的序列同一性只要為 90%以上即可，優(yōu)選為93%以上、更優(yōu)選為95%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為98%以上。同樣地，上述氨基酸序列(p2)中，與上述(pi)的氨基酸序列的序列同一性只要為 90%以上即可，優(yōu)選為93%以上、更優(yōu)選為95%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為98%以上。進(jìn)而，本發(fā)明涉及具有以下式(1)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。[X1-X2-X3- (X4) m- (X5) m- (X6) m-X7-X8] n (1)上述式(1)所示的氨基酸序列具有η個(gè)由[Xl-X2-X3-(X4)m-(X5)m-(X6)m-X7_X8] 所示的重復(fù)單元。對(duì)重復(fù)單元的數(shù)量(η)并無特別限定，優(yōu)選為1 10、更優(yōu)選為2 9、 進(jìn)一步優(yōu)選為3 8、特別優(yōu)選η = 8。式(1)中，m各自獨(dú)立地表示0或1的整數(shù)。即，每個(gè)重復(fù)單元中，既有具有X4、X5 或X6所示的氨基酸序列的情況，也有不具有X4、X5或)(6所示的氨基酸序列的情況。式(1)中，Xl表示序列號(hào)37 45中的任一種氨基酸序列、X2表示序列號(hào)46 52中的任一種氨基酸序列、X3表示序列號(hào)53 59中的任一種氨基酸序列、X4表示序列號(hào) 49的氨基酸序列、)(5表示序列號(hào)60或61的氨基酸序列、)(6表示序列號(hào)62 64中的任一種氨基酸序列、X7表示序列號(hào)65 70中的任一種氨基酸序列、X8表示序列號(hào)71 81中的任一種氨基酸序列。另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可以是具有與上述式(1)所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。上述序列同一性只要為90%以上即可，優(yōu)選為93%以上、更優(yōu)選為95%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為98%以上。圖1是表示作為人面蜘蛛的MaSp蛋白質(zhì)中的1種的NP-牽引絲蛋白A的cDNA序列的圖。圖1所示的基因序列與序列號(hào)1的堿基序列相同。圖2是表示由具有圖1所示基因序列(序列號(hào)1的堿基序列)的核酸編碼的NP-牽引絲蛋白A的氨基酸序列的圖。圖2所示的氨基酸序列與序列號(hào)的堿基序列相同。另外，圖4是表示作為人面蜘蛛的MaSp蛋白質(zhì)中的另1種的NP-牽引絲蛋白B的 cDNA序列的圖。圖4所示的基因序列與序列號(hào)19的堿基序列相同。圖5是表示由具有圖4所示基因序列(序列號(hào)19的堿基序列)的核酸編碼的 NP-牽引絲蛋白B的氨基酸序列的圖。圖5所示的氨基酸序列與序列號(hào)20的堿基序列相同。如圖2或圖5所示，由具有序列號(hào)1或19的堿基序列的核酸編碼的牽引絲蛋白是由下述式( 所示的氨基酸序列構(gòu)成的。[(a) (V) (β)], (2)上述式⑵所示的氨基酸序列具有q個(gè)[(a) (V) (β)]所示的重復(fù)單元。對(duì)重復(fù)單元的數(shù)量(q)并無特別限定，只要為1 100即可，優(yōu)選為1 10、更優(yōu)選為2 9、進(jìn)一步優(yōu)選為3 8、特別優(yōu)選q = 8。上述式O)中，(α)是由連續(xù)具有2 4個(gè)GGX的富含甘氨酸的序列構(gòu)成，表示形成非結(jié)晶性α-螺旋結(jié)構(gòu)的無定形區(qū)域。(V)表示GX含有率高的偽結(jié)晶區(qū)域、(β)表示富含丙氨酸或蘇氨酸的形成β折疊的結(jié)晶區(qū)域。上述(α)及(V)所含的X多為谷氨酰胺、丙氨酸、絲氨酸、亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸等，但并不限定于這些，還可以是其他的氨基酸。另外，X并不必須是相同的氨基酸。以下，對(duì)圖2或圖5所示的牽引絲蛋白所具有的獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)以及由此獲得的牽引絲蛋白的物性進(jìn)行說明。首先，在圖2或圖5所示的牽引絲蛋白的(α)區(qū)域(非結(jié)晶性無定形區(qū)域)中， 4個(gè)GGX連續(xù)地排列。通過這種排列，牽引絲形成α-螺旋結(jié)構(gòu)。α-螺旋結(jié)構(gòu)通常在纖維中以彎曲的狀態(tài)存在，通過拉伸而沿著纖維軸變成直鏈狀結(jié)構(gòu)。這樣，相對(duì)于來自外部的應(yīng)力，α-螺旋結(jié)構(gòu)大幅度伸展，從而賦予纖維以彈性。另一方面，以往公知的蜘蛛牽引絲蛋白(MaSp)中未見4個(gè)GGX連續(xù)排列的結(jié)構(gòu)(參照非專利文獻(xiàn)1、2等)。由以上可知，通過在(α)區(qū)域中形成4個(gè)GGX連續(xù)排列的獨(dú)立結(jié)構(gòu)，由本發(fā)明獲得的牽引絲蛋白的彈性(或彈力、伸縮性、伸長率、柔軟性)變得優(yōu)異。此外，以下文獻(xiàn)也記載了 GGX重復(fù)基序賦予絲以彈性?！?Cheryl Y. Hayashi et al. , Evidence from Flagelliform Silk cDNA for the Structural Basis of Elasticity and Modular Nature of Spider Silks, 1998, p.779· Thomas Scheibel, Spider si Iks !recombinant synthesis, assembly, spinning, and engineering of synthetic proteins, 2004, p.2另外，圖2或圖5所示的牽引絲蛋白的(V)區(qū)域(偽結(jié)晶區(qū)域)中富含親水性氨基酸。如表1所示，圖2或圖5所示的牽引絲蛋白與目前公知的金絲蜘蛛(N印hi la clavipes) 或日本產(chǎn)橫帶人面蜘蛛(Nephila clavata)的牽引絲蛋白相比，含有更多的親水性氨基酸。 由此認(rèn)為，由本發(fā)明獲得的牽引絲蛋白的吸濕性變高。另外認(rèn)為，牽引絲蛋白的結(jié)晶化度低也成為使吸濕性增加的要因。而且，在圖2或圖5所示的牽引絲蛋白的(β)區(qū)域(結(jié)晶區(qū)域)中，在聚丙氨酸的間隔間含有蘇氨酸、天冬酰胺等極性氨基酸。認(rèn)為由本發(fā)明獲得的牽引絲蛋白通過如此具有極性氨基酸豐富的聚丙氨酸(Poly(A))基序，變得具有優(yōu)異的強(qiáng)韌性。此外，以下的文獻(xiàn)也記載了極性氨基酸豐富的聚丙氨酸(Poly(A))基序賦予絲以強(qiáng)韌性?！?Glareh Askarieh et al. , Self-assembly of spider silk proteins is controlled by a pH—sensitive relay, 2010, vol.465, p. 1*J. M. G0SLINE,et al.，THE MECHANICAL DESIGN OF SPIDER SILKS :FR0M FIBROIN SEQUENCE TO MECHANICAL FUNCTION,1999, p.3299另外，如表1所示，圖2或圖5所示的牽引絲蛋白相對(duì)于以往公知的金絲蜘蛛 (Nephila clavipes)或日本產(chǎn)橫帶人面蜘蛛(N^hila clavata)含有約2倍的極性氨基酸。這樣大量存在于分子內(nèi)的極性氨基酸殘基通過相對(duì)于來自外部的應(yīng)力沿著應(yīng)力的方向規(guī)則地排列分子、增大分子間的作用力，從而使?fàn)恳z具有優(yōu)異的強(qiáng)度。特別是認(rèn)為分子間的氫鍵有助于絲纖維的強(qiáng)度增加。表1示出人面蜘蛛(Nephila pilipes)、金絲蜘蛛(Nephila clavipes)、日本產(chǎn)橫帶人面蜘蛛(Nephila clavata)的MaSp蛋白質(zhì)中的極性氨基酸及親水性氨基酸的含有率 (% )0 此外，極性氨基酸的含有率表示 N (Asn)、C (Cys)、Q (Gln)、S (Ser)、T (Thr)及 Y (Tyr) 的含有率，親水性氨基酸的含有率表示R(Arg)、N(Asn)、D(Asp)、Q(Gln)、E(Glu)、H(His)、 K (Lys)、S (Ser)及 T (Thr)的含有率。表1
極性氨基酸(％)親水性氨基酸(％ )人面蜘蛛31. 0529. 41金絲蜘蛛15. 7114. 85曰本產(chǎn)橫帶人面蜘蛛15. 1511. 01實(shí)施例以下舉出實(shí)施例更加具體地說明本發(fā)明。但本發(fā)明并不限定于以下的實(shí)施例。作為受試動(dòng)物，使用7月采集的人面蜘蛛(N印hila pilipes)的雌成蟲。(RNA 抽提)總RNA由人面蜘蛛(N^hila pilipes)的大壺狀腺體準(zhǔn)備。在生理鹽水(NaCl 0. 75% )中解剖蜘蛛的大壺狀腺體，添加Iml的TRIZOL并充分粉碎。懸浮液用200 μ 1的氯仿進(jìn)行分離除去。將水層移至其他的管中，添加等量的異丙醇，使RNA沉淀。用75%乙醇淋洗沉淀物，在-80°C下進(jìn)行保存。之后，在7500rpm、4°C下離心分離5分鐘，真空干燥8分鐘后，溶解于無RNase水中。在55°C下將RNA溶解10分鐘后，作為樣品使用。確認(rèn)了通過對(duì)樣品進(jìn)行瓊脂糖電泳，可以抽提出RNA。(cDNA文庫的構(gòu)建)
利用G-封端(G-Capping)法來合成和構(gòu)建大壺狀腺體的cDNA文庫委托給了 Takara-bio株式會(huì)社。文庫載體(pDNR-LIB)溶解于約50μ 1的TE中。(克隆和測序)為了以高概率進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使用了電穿孔法。作為DNA溶液，使用準(zhǔn)備好的cDNA文庫溶液；作為感受態(tài)細(xì)胞，使用hvitrogen公司制“Electro MAX DHl2S Cells”(Cat. No. 18312-017)，使用0. Icm尺寸的樣品池。首先，預(yù)先在冰上冷卻樣品池，在冰上溶解放入在管中的感受態(tài)細(xì)胞(> IOltlCfu/ μ g) 50 μ 1后，將1 μ 1的cDNA文庫溶液添加于管中。將該混合液均一地移至樣品池中。電穿孔的條件是電壓為2. 5kV、脈沖控制器(R2_7)為200 Ω、電容為25 μ F。施加一次脈沖，盡快在樣品池內(nèi)添加Iml的SOC培養(yǎng)基胰蛋白胨、0. 5%酵母提取物、IOmM NaCl,2. 5mM KClUOmM MgCl2UOmM MgSO4、20mM葡萄糖)，將溶液懸浮。將懸浮液移至培養(yǎng)管中培養(yǎng)1小時(shí) 1個(gè)半小時(shí)后，接種于含抗生素(氨芐青霉素)、IPTG及X-Gal的LB板(1 %胰蛋白胨、 0.5%酵母提取物、0.5% NaCl)中。將在板上形成的白色菌落植菌至LB(+氨芐青霉素)培養(yǎng)基中，隨機(jī)選擇588個(gè)重組質(zhì)粒，使用Flexift·印111Kit (Amersham公司制)進(jìn)行純化。(測序與序列的比較解析) 入白勺；！5 歹[J iiffi “ABI Prism genetic analyzer 3100" (Life technologies Japan株式會(huì)社制)和T7引物進(jìn)行分析。DNA和氨基酸序列的計(jì)算機(jī)分析使用“Genetyx package”(株式會(huì)社 Genetec 制)和 “^quencher 4. 14" (Demo Version) (Gene Codes 公司制)進(jìn)行。序列的比較通過對(duì)蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫利用ExPASy Proteomics server (http// www.expasy.org)的 SIB BLAST Network 進(jìn)行同源性分析。(證明絲腺特異性表達(dá)的實(shí)驗(yàn))MaSp (major ampul late spidroin)如名稱所示，是在大壺狀腺體進(jìn)行表達(dá)。為了證明本發(fā)明的基因在大壺狀腺體內(nèi)起作用，進(jìn)行使用cDNA序列的3’末端(氨基酸序列的 C末端)序列制作的探針與由蜘蛛的四種絲腺(鞭狀腺、管狀腺、大壺狀腺體、小壺狀腺體) 抽提出的RNA的Northern雜交實(shí)驗(yàn)。圖3為表示Northern雜交的結(jié)果的圖。圖3的條帶 1 4依次流過由鞭狀腺、管狀腺、大壺狀腺體、小壺狀腺體抽提出的RNA。由此結(jié)果可知， 本發(fā)明的基因(核酸)在人面蜘蛛的大壺狀腺體內(nèi)特異性地表達(dá)。另外，推測轉(zhuǎn)印物質(zhì)的分子量約為3 41Λ。(牽引絲的物性評(píng)價(jià))為了比較人面蜘蛛的牽引絲和目前公知的蜘蛛的牽引絲的物性，測定各自的伸長率(彈性模量)。伸長率的測定如下進(jìn)行將在從測定前一天開始在20°C、RH65%下放置 24小時(shí)而調(diào)整了吸濕量的20mm的各牽弓丨絲為樣品，在20°C、RH65%下、在拉伸速度為20mm/ min的條件下進(jìn)行使用了拉伸試驗(yàn)機(jī)“Tensilon UTM-II1-100” (Toyo Baldwin公司制)的伸長率試驗(yàn)。作為目前公知的蜘蛛，使用日本產(chǎn)橫帶人面蜘蛛(Nephila clavata)及橫紋金蛛(Argiope bruennichi)。將結(jié)果示于表2。表權(quán)利要求
1.下述(a) (d)中任一種的核酸(a)具有序列號(hào)1或19的堿基序列的核酸、(b)編碼具有序列號(hào)2或20的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸、(c)與所述(a)的核酸具有90%以上的序列同一性且編碼牽引絲蛋白的核酸、(d)在嚴(yán)格的條件下與所述(a)的核酸的互補(bǔ)鏈雜交且編碼牽引絲蛋白的核酸。
2.—種核酸，其含有下述(e) (h)中任一種的核酸，并且其與具有序列號(hào)1的堿基序列的核酸具有70%以上的序列同一性，并編碼牽引絲蛋白，(e)具有序列號(hào)3、5、7、9、11、13、15或17的堿基序列的核酸、(f)編碼具有序列號(hào)4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸、(g)與所述(e)的核酸具有90%以上的序列同一性的核酸、(h)在嚴(yán)格的條件下與所述(e)的核酸的互補(bǔ)鏈雜交的核酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸，其與具有序列號(hào)1的堿基序列的核酸具有80%以上的序列同一性。
4.一種核酸，其含有下述(i) (1)中任一種的核酸，并且其與具有序列號(hào)19的堿基序列的核酸具有70%以上的序列同一性，并編碼牽引絲蛋白，⑴具有序列號(hào)2U3、25、27、29、31、33或35的堿基序列的核酸、(j)編碼具有序列號(hào)22、24J6、28、30、32、34或36的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸、(k)與所述(i)的核酸具有90%以上的序列同一性的核酸、(1)在嚴(yán)格的條件下與所述(i)的核酸的互補(bǔ)鏈雜交的核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸，其與具有序列號(hào)19的堿基序列的核酸具有80%以上的序列同一性。
6.由權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的核酸編碼的蛋白質(zhì)。
7.導(dǎo)入有權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的核酸的重組生物。
8.導(dǎo)入有權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的核酸的重組桑蠶。
9.由權(quán)利要求7所述的重組生物制作的蛋白質(zhì)。
10.由權(quán)利要求8所述的重組桑蠶制作的蠶絲。
11.具有下述(m)或(η)的氨基酸序列的牽引絲蛋白， (m)序列號(hào)2或20的氨基酸序列、 (η)與所述(m)的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列。
12.具有下述(ο)或(ρ)的氨基酸序列的牽引絲蛋白，(ο)具有下述(ol)或(o2)的氨基酸序列且與序列號(hào)2的氨基酸序列具有70%以上的序列同一性的氨基酸序列；(01)序列號(hào)4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列、(02)與所述(ol)的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列、(P)具有下述(Pl)或(P》的氨基酸序列且與序列號(hào)20的氨基酸序列具有70%以上的序列同一性的氨基酸序列；(Pl)序列號(hào)22、24J6、28、30、32、34或36的氨基酸序列、(p2)與所述(pi)的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的牽引絲蛋白，其中，所述(ο)的氨基酸序列與序列號(hào)2的氨基酸序列具有80%以上的序列同一性，所述(ρ)的氨基酸序列與序列號(hào)20的氨基酸序列具有80%以上的序列同一性。
14.具有下式(1)所示的氨基酸序列或與式(1)所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，[X1-X2-X3- (X4) m- (X5) m- (X6) m-X7_X8] n (1)式中，m各自獨(dú)立地表示0或1的整數(shù)、η表示1 10的整數(shù)、Xl表示序列號(hào)37 45 中的任一種氨基酸序列、Χ2表示序列號(hào)46 52中的任一種氨基酸序列、Χ3表示序列號(hào) 53 59中的任一種氨基酸序列、Χ4表示序列號(hào)49的氨基酸序列、)(5表示序列號(hào)60或61 的氨基酸序列、Χ6表示序列號(hào)62 64中的任一種氨基酸序列、Χ7表示序列號(hào)65 70中的任一種氨基酸序列、Χ8表示序列號(hào)71 81中的任一種氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供下述(a)～(d)中任一種的核酸(a)具有序列號(hào)1或19的堿基序列的核酸、(b)編碼具有序列號(hào)2或20的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸、(c)與上述(a)的核酸具有90％以上的序列同一性且編碼牽引絲蛋白的核酸、(d)在嚴(yán)格的條件下與上述(a)的核酸的互補(bǔ)鏈雜交且編碼牽引絲蛋白的核酸。
文檔編號(hào)C12N15/12GK102399786SQ20111026819
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者中垣雅雄, 王玉軍, 趙天福 申請(qǐng)人:岡本株式會(huì)社