專利名稱：一種篩查α和β地中海貧血點突變的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種篩查方法，具體的說，是一種篩查α和β地中海貧血常見點突變的方法。
背景技術：
目前，地中海貧血的常用篩查技術包括血紅蛋白電泳、毛細管電泳、高效液相色譜分析(high performance liquid chromatography,HPLC)等。這些篩查技術主要是對血紅蛋白組分作生化分析，均屬非分子水平，它們與基因診斷的符合率均未能達到100%，在臨床實踐中可能造成漏診。除毛細管電泳技術可用于篩查HbCS突變外(1)，目前國內外尚無針對非缺失型α地貧突變(特別是HbQS、HbWS)的有效篩查方法，在臨床上往往導致非缺失型HbH病的漏診。
地中海貧血的基因診斷方法主要包括裂隙PCR(Gap-PCR)用于缺失型α地貧(耗時約 5 小時)，限制性片段長度多態(tài)(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、反向點雜交(reverse dot blot, RDB)、等位基因特異性 PCR(amplificationrefractory mutation system,ARMS-PCR)用于β地貧或非缺失型α地貧(2-6)。國內商業(yè)化試劑盒是采用Gap-PCR同時檢測」ΕΑ/α α,-α^/α a和-a42/a a三種缺失型突變(7，8)。RFLP是通過識別特異性序列位點進行酶切反應，方法簡便成本低廉，但其局限性是只能對有限的可產生酶切位點的突變進行檢測，由于不完全或部分酶切反應還會導致假陽性或假陰性結果(2)。ARMS-PCR需針對每個突變設計相應引物，每一對引物擴增條件都需優(yōu)化，若需同時檢測多種突變時則操作繁瑣，而且也會出現假陽性或假陰性結果(3) IDB法可同時檢測多種點突變，國內的商業(yè)化試劑盒可檢測β地貧17種突變和非缺失型α地貧3種突變，但此法操作時間相對較長(約8小時)，步驟繁瑣。這兩種針對特定人群的常見突變類型的檢測技術雖可實現診斷的準確性和時效性，但卻無法發(fā)現新突變。高分辨熔解曲線分析(high resolution melting,HRM)法是近年來發(fā)展的一種用于突變掃描和基因分型的最新遺傳學分析方法(9-11)。它是一種高效穩(wěn)健的post-PCR技術，不受突變堿基位點與類型的局限，無需序列特異性探針，在PCR結束后直接運行高分辨熔解，即可完成對樣品基因型的分析(12)。其基本原理為在PCR反應前將LC Green熒光染料與反應Buffer、引物、模板DNA混合，LC Green染料飽和加入(LC Green熒光染料對PCR不會有任何抑制作用)，然后將PCR產物(96孔板)直接放入HRM分析儀中，在一定的溫度范圍內將PCR擴增產物進行變性，在此期間，儀器的光學檢測系統(tǒng)采集密集的熒光信號變化并繪制溫度熔解曲線，根據曲線準確區(qū)分野生型、雜合突變、純合突變(根據熔解曲線形狀不同區(qū)分野生型和雜合型，根據熔解曲線Tm值不同區(qū)分野生型和純合突變)，軟件自動分型。目前HRM已廣泛用于基因的突變掃描、HLA基因組配型、法醫(yī)學鑒定、甲基化研究等(13-15)。HRM的技術特點包括1)檢測片段范圍50-1000bp ;2) 5分鐘內可完成96/384孔板樣品數據采集；3)直接未知雜合突變鑒定準確性100%，特異性100% ；4)直接未知純合突變鑒定準確性96%;5)單個樣品運行費用低于目前市場上任何商品化的基因突變檢測儀器；6)只檢測PCR樣品中熒光強度的變化，不消耗任何PCR樣品，屬于close-tube分析，無污染，PCR產物可以進行下游分析(10-12)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是，提供一種采用HRM技術篩查α和β地中海貧血常見點突變的方法。提供一種從基因分子水平進行α和β地中海貧血常見點突變篩查的方法。本發(fā)明的技術方案是這樣的一種篩查α和β地中海貧血點突變的方法，依次包括下述步驟⑴提取標本的基因組DNA ；⑵將PCR mix與模板DNA混合，然后加入LCGreen Plus飽和染料；(3) PCR擴增；(4) PCR結束后將產物直接放入HRM分析儀中，在60 96°C將PCR擴增產物進行變性，在此期間，儀器的光學檢測系統(tǒng)采集密集的熒光信號變化·并繪制溫度熔解曲線，根據曲線準確區(qū)分野生型、雜合突變、純合突變，軟件自動分型。上述的一種篩查α和β地中海貧血點突變的方法，所述的α地貧點突變?yōu)槲挥讦林榈鞍谆虻谌怙@子的HbCS點突變，HbQS點突變，HbW點突變的I個PCR擴增體系及其引物。上述的一種篩查α和β地中海貧血點突變的方法，所述的β地貧點突變?yōu)槲挥讦轮榈鞍谆蛉齻€外顯子及第二內含子的6個PCR擴增體系及其引物。上述的一種篩查α和β地中海貧血點突變的方法，所述的DNA濃度要求均一化至 10-50ng/y 1，0D260/280 要求介于1. 6 2. O 之間。本發(fā)明的原理是這樣的 HRM分析是在PCR反應前將PCR mix與模板DNA混合，然后加入LC Green飽和染料(LC Green熒光染料對PCR不會有任何抑制作用)，PCR結束后將產物(96孔板)直接放入HRM分析儀(LightScanner 96)中，在一定的溫度范圍內將PCR擴增產物進行變性，在此期間，儀器的光學檢測系統(tǒng)采集密集的熒光信號變化并繪制溫度熔解曲線，根據曲線準確區(qū)分野生型、雜合突變、純合突變(根據熔解曲線形狀不同區(qū)分野生型和雜合型，根據熔解曲線Tm值不同區(qū)分野生型和純合突變)，軟件自動分型。與現有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.本發(fā)明提供的方法篩查的準確率高，降低漏診情況發(fā)生，縮短檢測周期，簡便快速、成本低廉。2.在單孔內一次性檢測α地貧3種常見點突變(HbCS，HbQS，HbW)，同時實現突變篩查和基因分型，有利于提高對非缺失型α地貧特別是非缺失型HbH病的診斷率；3.對β地貧高危家系，當夫婦雙方基因型已知時，可對胎兒進行快速產前診斷，大大縮短診斷時間，對于減輕孕婦的心理壓力，幫助臨床醫(yī)生及時做出處理措施都具有重要的臨床應用價值。


圖1是HRM分析檢測α地中海貧血三種常見點突變曲線2是HRM分析檢測β珠蛋白基因(5' UTR+exon I)突變曲線3是HRM分析檢測β珠蛋白基因(exon 1+intron I)突變曲線4是HRM分析檢測β珠蛋白基因(exon 2)突變曲線圖
圖5是HRM分析檢測β珠蛋白基因(intron 2)突變曲線6是β地貧產前診斷家系的HRM分析結果
具體實施例方式下面結合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，但不夠對本發(fā)明的任何限制。實施例1儀器與試劑(I)儀器PCR儀(Biometra Tprofessional PCR) ;HRM分析儀(LightScanner 96, Idaho,美國)。
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(2)試劑DNA 提取試劑盒(Qiagen Mini Kit) ；PCR reagents (Buffer, Mg2+, dNTP, Taq 酶)LC Green Plus熒光染料(Idaho，美國)；α和β珠蛋白基因擴增引物(詳見表I)。方法流程(I) DNA 提取外周血樣采用EDTA抗凝。產前診斷標本包括羊水、絨毛、胎血等。羊水標本需3000rpm離心IOmin收集細胞，絨毛浸泡于生理鹽水中。各種標本于4°C保存，48小時內提取DNA。按照Qiagen Mini Kit說明書操作，DNA濃度要求均一化至10_50ng/y 1，0D260/280要求介于1. 6 2. O之間。(2) PCR 擴增β 珠蛋白基因 PCR Mixture 共分為 4 組PCR Mixture A_F。PCR Mixture A 和 B擴增β珠蛋白基因第I外顯子及第I內含子，PCR Mixture C和D擴增第2外顯子及第2內含子，PCR Mixture E和F擴增第3外顯子。α 珠蛋白基因 PCR Mixture 為一組PCR Mixture G。PCR反應體系DNA聚合酶使用Promega polymerase, PCR反應采用10 μ L體系，DNA模板量為10-100ng。每份DNA樣本進行A-G七組反應(見表I)。PCR循環(huán)參數一致為94°C 3min, (94°C 30s, 62°C 30s) X 40cycles, 94°C 30s, 25°C 30s, 4°C forever 反應在Biometra Tprofessional PCR 儀上進行。表IHRM分析引物序列表
權利要求
1.一種篩查α和β地中海貧血點突變的方法，其特征在于，依次包括下述步驟(1)提取標本的基因組DNA；(2)將PCRmix與模板DNA混合，然后加入LC Green Plus飽和染料；(3)PCR 擴增；(4)PCR結束后將產物直接放入HRM分析儀中，在60 96°C將PCR擴增產物進行變性， 在此期間，儀器的光學檢測系統(tǒng)采集密集的熒光信號變化并繪制溫度熔解曲線，根據曲線準確區(qū)分野生型、雜合突變、純合突變，軟件自動分型。
2.根據權利要求1所述的一種篩查α和β地中海貧血點突變的方法，其特征在于，所述的α地貧點突變?yōu)槲挥讦林榈鞍谆虻谌怙@子的HbCS點突變，HbQS點突變，HbW點突變的I個PCR擴增體系及其引物。
3.根據權利要求1所述的一種篩查α和β地中海貧血點突變的方法，其特征在于，所述的β地貧點突變?yōu)槲挥讦轮榈鞍谆蛉齻€外顯子及第二內含子的6個PCR擴增體系及其引物。
4.根據權利要求1所述的一種篩查α和β地中海貧血點突變的方法，其特征在于，所述的DNA濃度要求均一化至10-50ng/y 1，0D260/280要求介于1. 6 2. O之間。
全文摘要
本發(fā)明公開一種篩查α和β地中海貧血點突變的方法，旨在提供一種簡便快速、成本低廉、準確率高的篩查α和β地中海貧血點突變的方法；其技術要點是(1)提取標本的基因組DNA；(2)將PCR mix與模板DNA混合，然后加入LC Green Plus飽和染料；(3)PCR擴增；(4)PCR結束后將產物直接放入HRM分析儀中，在60～96℃將PCR擴增產物進行變性，在此期間，儀器的光學檢測系統(tǒng)采集密集的熒光信號變化并繪制溫度熔解曲線，根據曲線準確區(qū)分野生型、雜合突變、純合突變，軟件自動分型。
文檔編號C12Q1/68GK102994615SQ20111026876
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權日2011年9月9日
發(fā)明者廖燦, 李茹 申請人:廣州市婦女兒童醫(yī)療中心