專利名稱：一種與二氧化碳濃縮機(jī)制相關(guān)的集胞藻蛋白的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中一種與二氧化碳濃縮機(jī)制相關(guān)的集胞藻蛋白的新用途。
背景技術(shù)：
水稻是我國主要糧食作物之一。我國人多地少，農(nóng)業(yè)資源人均占有量很低并且環(huán)境污染、土地沙化、城市擴(kuò)張等原因致使全國可耕地面積日益減少。因此，提高主要農(nóng)作物單位面積產(chǎn)量，是解決我國糧食問題最現(xiàn)實(shí)、最有效、最根本的途徑。而作物產(chǎn)量的高低又很大程度上取決于其光合效率。藍(lán)藻是一種古老的光合生物，其細(xì)胞具有二氧化碳濃縮機(jī)制(CCM)。通過該機(jī)制藍(lán)藻能夠提高CO2同化的關(guān)鍵酶Rubisco活性部位周圍的CO2濃度，克服自身Rubisco對(duì)CO2的低親和力，有效的同化CO2,從而提高光合作用效率。集胞藻(Synechocystis)是研究藍(lán) 藻的模式藻種。有研究發(fā)現(xiàn)，將與CCM途徑相關(guān)的基因轉(zhuǎn)入高等植物擬南芥中，能夠通過降低CO2的飽和點(diǎn)來提高其光合效率。但這一作用機(jī)制在以水稻為代表的單子葉植物中是否有效仍不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供序列表中序列2所示的蛋白在提高植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了序列表中序列2所示的蛋白在提高植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因在提高植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因在提高植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用；所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-3)中任一所述的基因I)序列表中序列I所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與I)所不的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與I)或2)所述的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供含有序列表中序列2所示蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體在提高植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了含有序列表中序列2所不蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體在提聞植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻；
所述重組表達(dá)載體為在pH7WG2D，l載體的att R位點(diǎn)插入了序列表中序列2所示蛋白的編碼基因得到的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏校玫睫D(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物與目的植物相比葉綠素含量提高和/或旗葉長度增長。所述序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因是通過含有序列表中序列2所示蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中的。所述含有序列表中序列2所不蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體為在pH7WG2D, I載體的att R位點(diǎn)插入了序列表中序列2所示蛋白的編碼基因得到的重組表達(dá)載體。所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻。 序列表中序列2所示的蛋白在提高植物光合作用能力中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明從藍(lán)藻(Synechocystis PCC 6803)中克隆了一個(gè)與藍(lán)藻二氧化碳濃縮機(jī)制(CCM)相關(guān)的基因slrl515。將該基因?qū)胨镜霓D(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證明，轉(zhuǎn)入slrl515基因的水稻葉綠素含量，旗葉長度明顯增加，說明slrl515基因及其編碼產(chǎn)物對(duì)于培育光合作用增強(qiáng)的作物新品種具有重要的理論及實(shí)際意義，可用于農(nóng)業(yè)高產(chǎn)植物品種的培育。


圖1為重組表達(dá)載體pH7WG2D，l_slrl515的示意圖。圖2為Ttl代轉(zhuǎn)sir 1515基因水稻植株的PCR檢測結(jié)果。圖3為轉(zhuǎn)基因T1代萌發(fā)種子的GFP熒光檢測。圖4為轉(zhuǎn)slrl515基因水稻T1代葉綠素含量和旗葉長度分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、過表達(dá)slrl515基因提高轉(zhuǎn)基因水稻的葉綠素含量和增加轉(zhuǎn)基因水稻的旗葉長度—、sir 1515過表達(dá)水稻植株的獲得和鑒定1、過表達(dá)slrl515基因載體的構(gòu)建提取對(duì)數(shù)生長期的藍(lán)藻(Synechocystis PCC 6803)(公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是Zhang LF et al. Proteomic analysis ofplasma membranes of cyanobacterium Synechocystis sp. Strain PCC 6803 in responseto high pH stress. J Proteome Res. 2009)細(xì)胞的DNA，以其為模板，通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增基因Slrl515，該基因在轉(zhuǎn)基因受體植物水稻中未發(fā)現(xiàn)高同源性基因。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離回收后，連接到基因克隆載體PMD18并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對(duì)獲得的單克隆菌落的質(zhì)粒測序分析。擴(kuò)增引物上游引物F :5’ -ATGGTGTCTCCCATCTCTATC-3’，下游引物 R :5，-TTATGAAGCAAGAAGAGGITTGTCC-3’。反應(yīng)體系DNA(1 u g/u L)1. Ou L,上游引物 F 和下游引物 R(IOiiM)各 l.OiiL，dNTP(2. 5mM)4. Ou L, ddH20 37. 5 u L, rTaqO. 5 y L (Takara 公司)，10XPCR buffer (Mg2+Plus) 5 ii L。反應(yīng)程序94 °C 4min, (94 °C 30s, 50 °C 30s, 72 °Clmin) 30cycles, 72°C lOmin。PCR產(chǎn)物純化回收(TIANgen Midi Purification Kit 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒)。將上述回收產(chǎn)物與克隆載體pMD18 (Takara pMD18_T VECTOR試劑盒)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明該P(yáng)CR產(chǎn)物與NCBI數(shù)據(jù)庫中slrl515基因(Gene ID 954692)序列相同。slrl515基因的核苷酸序列為序列表中序列I所示，該基因的編碼區(qū)為序列表中序列I自5’末端第1-1425位核苷酸，該序列所編碼的Slrl515蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。將回收得到的PCR 產(chǎn)物連接到 PCR8/GW/T0P0 載體(PCR8/GW/T0P0 TACL0NINGKIT購買于Invitrogen公司，目錄號(hào)K252002)att L位點(diǎn)上，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行 測序，測序結(jié)果表明，在PCR8/GW/T0P0載體的att L位點(diǎn)上插入了序列表中序列I所示的核苷酸序列。利用LR Clonase II (購買于Invitrogen公司，目錄號(hào)11791-020),通過位點(diǎn)特異重組將目的基因整合到表達(dá)載體PH7WG2D，I (公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是Zhubo Dai et al, Cloning and characterizationof a novel 3-hydroxy-3-methylglutaryI coenzyme A reductase gene from Salviamiltiorrhiza involved in diterpenoid tanshinone accumulation. Journal ofPlant Physiology[J]. 2011)的att R位點(diǎn)，得到目的質(zhì)粒。將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(上游引物F : 5 ’ -TACCTGGTGCCCATGACG-3 ’，下游引物R :5’ -CCAACTACACCCGTTTCCA-3’)，獲得了 521bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。同時(shí)，將陽性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn)證，測序結(jié)果表明在載體PH7WG2D，I的att R位點(diǎn)插入了序列表中序列I所示的s Ir 1515基因片段，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將重組載體命名為PH7WG2D，l-slrl515(圖1，p35S :啟動(dòng)子，T35S :終止子，HygB :潮霉素抗性基因，Sm/SpR :壯觀霉素抗性基因，EgfpER:綠色熒光蛋白基因，prolD :來自農(nóng)桿菌的根表達(dá)啟動(dòng)子)。重組載體pH7WG2D，l-slrl515是以組成性表達(dá)的35S為啟動(dòng)子，增強(qiáng)型的綠色熒光蛋白(GFP)為報(bào)告基因，具有潮霉素和壯觀霉素抗性基因，可通過潮霉素和壯觀霉素進(jìn)行篩選。2、含目的基因的農(nóng)桿菌的獲得提取驗(yàn)證正確的克隆中的重組質(zhì)粒pH7WG2D，l_slrl515，通過電擊轉(zhuǎn)化法，把重組質(zhì)粒pH7WG2D，l-slrl515轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(A. tumefaciens)菌株EHA105 (公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是Y.-M. Bi et al. Resistance to Botrytiscinerea in scented geranium transformed with a gene encoding the antimicrobialprotein Ace-AMPl. Plant Cell Reports [J]. 1999)。具體方法如下取2mL農(nóng)桿菌(A. tumefaciens) (EHA105)菌液轉(zhuǎn)接于IOOmL LB液體培養(yǎng)基(含50ug/mL鏈霉素)中，281、2501^111振蕩培養(yǎng)至0D600在0.5到I之間。將農(nóng)桿菌菌液轉(zhuǎn)入無菌50mL離心管中，AUOOOrpm離心5min，去上清液。用20mL預(yù)冷的HEPES (lmM，pH7. 0)重懸，4°C、4000rpm離心5min，去上清液，重復(fù)2 3次。用2mL預(yù)冷的10%甘油重懸。每管100 u L分裝于1. 5mL無菌Eppendorf管中。加入2 u L重組載體pH7WG2D，l_slrl515質(zhì)粒于上述Eppendorf管中，用槍頭輕輕攪拌混勻。取出細(xì)胞與質(zhì)粒的混合物轉(zhuǎn)入電擊杯中(_20°C預(yù)冷)，在2500V 5ms下電擊。取出電擊杯，加入500 u L預(yù)冷的LB培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，吸出菌液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，28°C，200rpm培養(yǎng)2h。將菌液涂布與平板上(鏈霉素50 u g/mL、潮霉素50 u g/mL、壯觀霉素50 u g/mL) 28 V 2天，挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(上游引物 F :5’ -TACCTGGTGCCCATGACG-3’，下游引物 R :5’ -CCAACTACACCCGITTCCA-3’)。將正確的菌株(即獲得了 521bp的擴(kuò)增產(chǎn)物)用于水稻的轉(zhuǎn)化。3、轉(zhuǎn)基因水稻的獲得水稻(中花11)(公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是朱旭東.水稻中花11輻射突變體的分離與鑒定.中國水稻科學(xué)[J].2003)種子去殼用30% NaClO浸15min，用ImL槍將殘留的溶液吸干凈。重復(fù)該步驟，無菌水沖洗3_5次。用ImL槍將殘留的水吸干凈。將滅菌后的種子接種于N6D培養(yǎng)基上，32°C持續(xù)光照培養(yǎng)一周左右。去除芽和殘留胚乳繼代培養(yǎng)的很小的顆粒愈傷(10-20天)用于轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn) A pH7WG2D, l-slrl515 載體的農(nóng)桿菌 EHA105 菌株，在 YEB+Rif (25_50mg/L) +Kan (50mg/L)培養(yǎng)基上28°C暗培養(yǎng)2 3天。挑單菌落于3 5mLYEB+Kan+Rif培養(yǎng)基中，28°C暗培養(yǎng)約24h。取500 ii L接于50mL AAM培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)至0D600約0.1。將上述去除芽和殘留胚乳進(jìn)行繼代培養(yǎng)的愈傷組織浸于農(nóng)桿菌菌液中，立即用鑷子取出置于無菌濾紙上吸去多余菌液，吹干。愈傷接于N6D-As培養(yǎng)基(N6D培養(yǎng)基中含有10mg/mL乙酰丁香酮)，培養(yǎng)基上預(yù)先墊一層浸有AAM(0.5mL即可)的無菌濾紙。用保鮮膜將培養(yǎng)皿包好置于25°C暗培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)后的愈傷先用無菌水沖洗2-3次，再用含500mg/L羧芐的無菌水沖洗2_3次，并用之浸泡30min左右(若浸染愈傷的菌液濃度0D600 > 0. 1，可將浸泡時(shí)間增加到Ih左右，30min左右更換一次)。無菌濾紙上吸去水分，并吹干。接種于含50mg/L潮霉素B和400mg/L羧芐的N6D-S培養(yǎng)基(用于選擇陽性克隆，N6D培養(yǎng)基中加入50mg/L潮霉素B和400mg/L羧芐)上32°C持續(xù)光照培養(yǎng)兩周。將生長旺盛的愈傷轉(zhuǎn)移到含50mg/L潮霉素B和250mg/L羧芐的再生培養(yǎng)基上32°C持續(xù)光照培養(yǎng)誘導(dǎo)分化。轉(zhuǎn)移分化出的幼苗至含50mg/L潮霉素B和200mg/L羧芐的MS-HF培養(yǎng)基(在MS培養(yǎng)基中加入30g/L蔗糖)上誘導(dǎo)生根，從而得到Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻株系。共侵染270個(gè)愈傷組織，得到了 164個(gè)帶有報(bào)告基因的愈傷組織。按照獲得轉(zhuǎn)slrl515基因水稻的方法，用空載體pH7WG2D，I轉(zhuǎn)化水稻植株，得到轉(zhuǎn)空載體對(duì)照水稻Ttl代植株。同時(shí)，設(shè)水稻(中花11)為野生型對(duì)照。提取Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻株系的基因組DNA并通過PCR對(duì)外源基因進(jìn)行分子檢測(上游引物 F :5’ -TACCTGGTGCCCATGACG-3’，下游引物 R :5’ -CCAACTACACCCGITTCCA-3’ )，檢測結(jié)果見圖2(圖2中泳道M :D2000，泳道CK :轉(zhuǎn)空載體水稻，泳道wt :中花11，泳道1-泳道22 :轉(zhuǎn)基因水稻株系)，從圖2中可見，與轉(zhuǎn)空載體對(duì)照水稻Ttl代植株和野生型對(duì)照水稻相t匕，Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻植株中均獲得了 521bp的目的基因片段，說明泳道1、2、5、8、14、22為陽性轉(zhuǎn)基因植株，共獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株6株。同時(shí)將上述用于檢測的13株Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行自交獲得其種子(即T1代轉(zhuǎn)基因水稻)。對(duì)13個(gè)株系T1代幼苗的報(bào)告基因GFP進(jìn)行檢測，檢測方法如下將Ttl代種子(即T1代)置于30°C，黑暗條件下萌發(fā)后，用400nm激發(fā)波激發(fā)并在470nm發(fā)射波下，觀察是否有綠色熒光。結(jié)果如圖3所示(圖3中，A :轉(zhuǎn)入基因水稻，B :中花11)，在轉(zhuǎn)基因水稻中觀察到綠色熒光蛋白所發(fā)出的綠色，而野生型對(duì)照水稻中花11中未觀察到綠色。選取遺傳性狀分離比為3 I的株系(表I)，并將該株系中有報(bào)告基因GFP表型的T1代轉(zhuǎn)基因水稻苗的成活幼苗移至溫室培養(yǎng)。結(jié)果共獲得了 6株T1代轉(zhuǎn)slrl515基因陽性株系。表I轉(zhuǎn)基因T1代分離比及拷貝數(shù)分析
權(quán)利要求
1.序列表中序列2所示的蛋白在提高植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻。
3.序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因在提高植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用；所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-3)中任一所述的基因1)序列表中序列I所不的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與I)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與I)或2)所述的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻。
5.含有序列表中序列2所不蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體在提聞植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻。
7.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物與目的植物相比葉綠素含量提高和/或旗葉長度增長。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因是通過含有序列表中序列2所示蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中的。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻。
10.序列表中序列2所示的蛋白在提高植物光合作用能力中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與二氧化碳濃縮機(jī)制相關(guān)的集胞藻蛋白的新用途。本發(fā)明提供了序列表中序列2所示的蛋白在提高植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因在提高植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用。本發(fā)明將slr1515基因?qū)胨镜霓D(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證明，轉(zhuǎn)入slr1515基因的水稻葉綠素含量和旗葉長度明顯提高，說明slr1515基因及其編碼產(chǎn)物對(duì)于培育光合作用增強(qiáng)的作物新品種具有重要的理論及實(shí)際意義，可用于農(nóng)業(yè)高產(chǎn)植物品種的培育。
文檔編號(hào)C12N15/31GK102993285SQ20111027095
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者黃芳, 楊浩萌, 趙樂, 薛哲勇, 周荷益, 漆小泉 申請人:中國科學(xué)院植物研究所