專利名稱：多重pcr快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法。
背景技術：
目前國際上公認的李斯特菌共有6種單核細胞增生李斯特菌(lis teria mwocj^ow/ ^，簡稱單增李斯特菌)、綿羊李斯特菌(listeria ivanovii)、英諾克李斯特菌(Listeria innocua)lif {Listeria welshimeri)lif {Listeria grayi)和西爾李斯特菌(listeria seeligcri).其中單增李斯特菌是一種人畜共患的病原菌，可引起嚴重的傳染病，如敗血癥、腦炎、腦膜炎。該菌廣泛存在于自然界中，肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等都已被證實是單增李斯特菌的感染源，食品中存在的單增李斯特菌對人類的安全具有威脅，該菌在4 ！的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原之一，2000年被WHO食品安全工作計劃列為檢測的食源性致病菌之一； 綿羊李斯特菌主要危害動物，特別是反芻獸，常表現(xiàn)為敗血癥和流產(chǎn)，對人危害較少；英諾克李斯特菌在近期國內(nèi)外報道存在食品中，對人類具有一定的潛在致病性。尤其在發(fā)生由非溶血性變?yōu)槿苎缘淖儺悤r，有致病的潛力；其余3種李斯特菌對人和動物的危害相對較小。英諾克李斯特菌、威爾李斯特菌、格氏李斯特菌等李斯特菌雖不是常規(guī)致病菌，但由于其常與致病的李斯特菌共同存在于食品中，因此也被作為致病李斯特菌的指示菌。在食品中，雖然不同李斯特菌的危害嚴重性不同，但任何一種李斯特菌的存在，均被認為是衛(wèi)生狀況不良的指示。從上世紀80年代起，美國、日本、新西蘭、德國、英國、法國、歐洲等國家多次因食品污染爆發(fā)人類李斯特菌病。至2003年，我國有報道的散發(fā)性李斯特菌病例150例，死亡率269L 2008年，加拿大共發(fā)生57起李斯特菌感染，造成23人死亡。目前，鑒定李斯特菌的方法主要分為兩類一類是傳統(tǒng)的生化鑒定方法，包括微量生化反應方法和血清學方法等。另一類是分子生物學方法，包括普通PCR方法和實時熒光 PCR方法等。傳統(tǒng)方法費時、費力，且實驗重復性相對較低，但其準確性使很多國家在制定標準時依然采用傳統(tǒng)方法。分子生物學方法鑒定細菌具備快速、簡便的特點，但在準確性和特異性方面尚有需要改進之處。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法；本發(fā)明是一種快速、準確、靈敏的多重PCR檢測和鑒定5種李斯特菌的方法，為分子生物學方法鑒定李斯特菌種提供選擇。不僅提高效率，節(jié)約時間，而且節(jié)省檢測成本。為了達成上述目的，本發(fā)明的解決方案是
一種多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法，包括如下步驟1)首先選擇5條上游引物和1條下游引物；2)取陽性對照標準菌液和待檢菌液分別制備基因組DNA模板；3) 分別在陽性對照標準菌液制備的基因組DNA模板和待檢菌液制備的基因組DNA模板中添加所述上游引物和下游引物進行PCR擴增反應；4)取擴增后的產(chǎn)物5 μ L點樣于1%瓊脂糖凝膠，其中含0. 5 μ g/mL溴化乙錠，以2000 bp Marker為標準分子參照，進行電泳；電泳結(jié)果用紫外凝膠成像系統(tǒng)分析；5)結(jié)果判定，待檢樣品與陽性對照同時擴增出230 250 bp 條帶的，判定為格氏李斯特菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時擴增出650 660 bp條帶的， 判定為單增李斯特菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時擴增出460 470 bp條帶的，判定為威爾李斯特菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時擴增出360 370 bp條帶的，判定為綿羊李斯特菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時擴增出860 870 bp條帶的，判定為英諾克李斯特菌陽性。所述的5條上游引物和1條下游引物的引物序列分別為 上游引物 MonoA 5-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3 ；
上游引物 Ino2 5' -ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC-3，； 上游引物 WelD 5' -ACAGTAATACAACTGCACCAA-3'； 上游引物 Gral :5，-AATCAAGTAGGTCTTAGCCTTTCTG-3，； 上游引物 IvaA 5' -TAGCAGCACGGCAAGCGCAA-3'； 下游引物 IislB :5，-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3，。所述的PCR 反應條件如下95 °C變性 3 min ；95 "C 15 s、58 "C 30 s、72 "C 45 s, 進行30個循環(huán)擴增；72 °C延伸5 min。所述PCR反應體系如下
IOX擴增緩沖液5 μ 1 ；(購于FERMENTAS)
4種dNTP混合物各200 μ mol/L ；
引物各 0.5 μ mol/L ；
DNA 模板2 μ g ；
Taq DNA聚合酶2 u ；(購于生工生物工程(上海)有限公司)
MgCl21. 5 mmol/L ；力口 ddH20 至50 μ 1 ；
其中所述的4種dNTP混合物指三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸dATP，脫氧胸苷三磷酸 dTTP，脫氧鳥苷三磷酸三鈉dGTP，脫氧胞苷三磷酸dCTP。(購于Bio Basic Inc)
所述的擴增緩沖液配方為:pH 8.8，25°C，100 mM Tris-HCl ；500 mM, KCl ；0.8%(ν/ν), 乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P40)。 所述的陽性對照標準菌液和待檢菌液分別制備基因組DNA模板的方法為取5種李斯特菌(ATCC33090英諾克李斯特菌，CMCC54002單核增生李斯特菌，ATCC19119綿羊李斯特菌，ATCC35897威爾李斯特菌，ATCC25401格氏李斯特菌) 的標準菌株細菌培養(yǎng)液1 ml (購于上海復祥生物公司)或者是待檢菌液1 ml，置于無菌的 1.5 ml Eppendorf離心管中，12000 rpm離心1 min，去上清，用滅菌蒸餾水洗滌兩次，收集菌體；加入400 μ 1裂解液混勻，置于37 °C水浴1 h;然后加入200 μ 1 5 mol/L的氯化鈉溶液，混勻后于13000 rpm離心15 min ；取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；加兩倍體積無水乙醇，1/10體積，3 mol/L，pH8. 0的醋酸鉀，-20 °C保存1 h后，13000 rpm離心 15 min，棄上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室溫干燥后，溶于50 μ 1 TE溶液(購于上海索萊寶生物科技有限公司)中，置4 °C保存?zhèn)溆谩Ｋ龅牧呀庖号浞綖?0 mmol/L Tris-醋酸，20 mmol/L醋酸鈉，1 mmol/L EDTA, 1%十二烷基硫酸鈉(SDS)，pH7.8。 本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明建立了利用多條引物
5競爭性退火的多重PCR方法檢測和鑒別5種李斯特菌的方法，并經(jīng)實際樣本檢測測試，未發(fā)現(xiàn)假陽性結(jié)果，表明該方法切實可行。本方法采用PCR擴增技術，使得檢測5種李斯特菌的靈敏度大大提高。由于本方法經(jīng)一次PCR即可鑒別5種李斯特菌，不需要對每種李斯特菌分別進行確證鑒定，節(jié)省了實驗時間，加快了檢出速度。綜上所述本發(fā)明的李斯特菌檢測和鑒定方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等優(yōu)點，較傳統(tǒng)的生理生化鑒定方法具有更高的可重復性，較普通PCR更為快速、簡便，可實現(xiàn)對5種李斯特菌的快速、準確、特異的檢測和分析。


圖1為本發(fā)明標準菌株的多重PCR擴增產(chǎn)物電泳圖；其中1、格氏李斯特菌，2、單增李斯特菌，3、威爾李斯特菌，4、綿羊李斯特菌，5、英諾克李斯特菌，M、2000 bp DNA Ladder Marker ；
圖2為本發(fā)明實施例1的樣品檢測的多重PCR電泳圖；其中1、單增李斯特菌，2、威爾李斯特菌，3、綿羊李斯特菌，4、英諾克李斯特菌，5、格氏李斯特菌，6、樣品，N、陰性對照， M、2000 bp DNA Ladder Marker。
具體實施例方式實施例1
特異性引物和標準菌株鑒定實驗 1)、引物
根據(jù)Genebank中公布的5種李斯特菌(單增李斯特菌，綿羊李斯特菌，英諾克李斯特菌，威爾李斯特菌，格氏李斯特菌)iap基因序列的保守區(qū)和可變區(qū)，以及相關文獻，使用 Primer5. 0軟件設計引物；經(jīng)預實驗選擇5條上游引物(MonoA、Ino2, WelD, GraU IvaA)和 1條下游引物(IislB)為最佳組合，引物序列如下 上游引物 MonoA 5-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3 ； 上游引物 Ino2 5' -ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC-3，； 上游引物 WelD 5' -ACAGTAATACAACTGCACCAA-3'； 上游引物 Gral :5，-AATCAAGTAGGTCTTAGCCTTTCTG-3，； 上游引物 IvaA 5' -TAGCAGCACGGCAAGCGCAA-3'； 下游引物 IislB :5，-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3，
引物由大連寶生物工程有限公司合成；預期擴增的片段大小分別為格氏李斯特菌 230 250 bp，單增李斯特菌650 660 bp，威爾李斯特菌460 470 bp，綿羊李斯特菌 360 370 bp，英諾克李斯特菌860 870 bp。2)、陽性對照標準菌液的DNA模板的制備
取5種李斯特菌(ATCC33090英諾克李斯特菌，CMCC54002單核增生李斯特菌， ATCC19119綿羊李斯特菌，ATCC35897威爾李斯特菌，ATCC25401格氏李斯特菌)的標準菌株細菌培養(yǎng)液1 ml，置于無菌的Eppendorf離心管中，12000 rpm離心1 min，去上清，用滅菌蒸餾水洗滌兩次，收集菌體；加入400 μ 1裂解液(40 mmol/L Tris-醋酸，20 mmol/L醋酸鈉，1 mmol/L EDTA，1%SDS，pH7. 8)混勻，置于 37 °C水浴 1 h ；然后加入 200 μ 1 5 mol/L的氯化鈉溶液，混勻后于13000 rpm離心15 min。取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提 1次；加兩倍體積無水乙醇，1/10體積醋酸鉀(3 mol/L, pH8. 0)，-20 °C保存1 h后，13000 rpm離心15 min,棄上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室溫干燥后，溶于50 μ 1 TE溶液中，置4 °C保存?zhèn)溆谩?3)、在陽性對照標準菌液制備的基因組DNA模板中添加所述上游引物和下游引物進行PCR擴增反應；
所述PCR反應體系如下
IOX 擴增緩沖液 5 μ 1 ；(購于 FERMENTAS ；100 mM Tris-HCl (pH 8. 8，25°C )，500 mM KCl, 0. 8%(v/v) Nonidet Ρ40) 4 種 dNTP 混合物各 200 μ mol/L ；
引物各 0.5 μ mol/L ；
DNA 模板2 μ g ；
Taq DNA聚合酶2 u ；
MgCl21. 5 mmol/L ；力口 ddH20 至50 μ 1 ；
其中所述的4種dNTP混合物指三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸dATP，脫氧胸苷三磷酸 dTTP，脫氧鳥苷三磷酸三鈉dGTP，脫氧胞苷三磷酸dCTP。PCR反應條件如下
95 °C 變性 3 min ；95 °C 15 s、58 °C 30 s、72 °C 45 s，進行 30 個循環(huán)擴增；72 °C 延伸 5 min。4)取擴增后的產(chǎn)物5 μ L點樣于1%瓊脂糖凝膠，其中含0. 5 μ g/mL溴化乙錠，以 2000 bp Marker為標準分子參照，以5 V/cm的電場強度于0. 5 X TBE電泳緩沖液中電泳30 min ；電泳結(jié)果用紫外凝膠成像系統(tǒng)分析、拍照；結(jié)果如圖1。實驗表明5種李斯特菌分別產(chǎn)生長度差異顯著的特異性擴增條帶。5) PCR產(chǎn)物的序列鑒定
切下含有所需DNA片段的凝膠，用DNA回收試劑盒(TAKARA)從瓊脂糖凝膠中回收純化目的片段；DNA測序由大連寶生物工程有限公司完成；測序證明，PCR擴增片段與預期一致 格氏李斯特菌230 250 bp，單增李斯特菌650 660 bp，威爾李斯特菌460 470 bp，綿羊李斯特菌360 370 bp，英諾克李斯特菌860 870 bp。實施例2
凍豬肉樣品培養(yǎng)物(經(jīng)生化鑒定為單增李斯特陽性)檢測實驗 1)樣品DNA模板的制備
取疑似菌落的細菌培養(yǎng)液1 ml，置于無菌的1.5 ml Eppendorf離心管中，12000 rpm 離心1 min，去上清，用滅菌蒸餾水洗滌兩次，收集菌體；加入400 μ 1裂解液(40 mmol/ L Tris-醋酸，20 mmol/L 醋酸鈉，1 mmol/L EDTA, 1%SDS, ρΗ7· 8)混勻，置于 37 °C水浴 1 h ；.然后加入200 μ 1 5 mol/L的氯化鈉溶液，混勻后于13000 rpm離心15 min。取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；加兩倍體積無水乙醇，1/10體積醋酸鉀(3 mol/L， pH8. 0)，-20 °C保存1 h后，13000 rpm離心15 min,棄上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室溫干燥后，溶于50 μ TE溶液中，置4 °C保存?zhèn)溆谩?)、在待檢樣品菌液制備的基因組DNA模板中添加所述上游引物和下游引物進行 PCR擴增反應；
所述PCR反應體系如下
7IOX 擴增緩沖液 5 μ 1 ；(購于 FERMENTAS ； 100 mM Tris-HCl (pH 8. 8，25°C )，500 mM KCl, 0. 8%(v/v) Nonidet Ρ40) 4 種 dNTP 混合物各 200 μ mol/L ；
其中所述的4種dNTP混合物指三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸dATP，脫氧胸苷三磷酸 dTTP，脫氧鳥苷三磷酸三鈉dGTP，脫氧胞苷三磷酸dCTP。
PCR反應條件如下
95 °C 變性 3 min ；95 °C 15 s、58 °C 30 s、72 °C 45 s，進行 30 個循環(huán)擴增；72 °C 延伸3)取擴增后的產(chǎn)物5 μ L點樣于1%瓊脂糖凝膠，其中含0. 5 μ g/mL溴化乙錠，以 2000 bp Marker為標準分子參照，以5 V/cm的電場強度于0. 5 X TBE電泳緩沖液中電泳30 min ；電泳結(jié)果用紫外凝膠成像系統(tǒng)分析、拍照；結(jié)果如圖2。4)結(jié)果判定，實驗表明凍豬肉樣品中含有單增李斯特菌。待檢樣品與陽性對照同時擴增出230 250 bp條帶的，判定為格氏李斯特菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時擴增出650 660 bp條帶的，判定為單增李斯特菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時擴增出 460 470 bp條帶的，判定為威爾李斯特菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時擴增出360 370 bp條帶的，判定為綿羊李斯特菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時擴增出860 870 bp 條帶的，判定為英諾克李斯特菌陽性。同時對PCR產(chǎn)物的序列鑒定切下帶有所需DNA片段的凝膠，用DNA回收試劑盒(TAKARA)從瓊脂糖凝膠中回收純化目的片段；DNA測序由大連寶生物工程有限公司完成；測序證明，PCR擴增片段與預期一致。
引物 DNA模板 Taq DNA聚合酶 MgCl2
各 0.5 μ mol/L ； 2 Ug； 2 u ；
1. 5 mmol/L ；力口 ddH20 至
50 μ 1 ；
權(quán)利要求
1.一種多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法，其特征在于包括如下步驟1) 首先選擇5條上游引物和1條下游引物；2)取陽性對照標準菌液和待檢菌液分別制備基因組DNA模板；3)分別在陽性對照標準菌液制備的基因組DNA模板和待檢菌液制備的基因組 DNA模板中添加所述上游引物和下游引物進行PCR擴增反應；4)取擴增后的產(chǎn)物5 μ L點樣于1%瓊脂糖凝膠，其中含0. 5 μ g/mL溴化乙錠，以2000 bp Marker為標準分子參照，進行電泳；電泳結(jié)果用紫外凝膠成像系統(tǒng)分析；5)結(jié)果判定，待檢樣品與陽性對照同時擴增出 230 250 bp條帶的，判定為格氏李斯特菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時擴增出650 660 bp條帶的，判定為單增李斯特菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時擴增出460 470 bp 條帶的，判定為威爾李斯特菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時擴增出360 370 bp條帶的， 判定為綿羊李斯特菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時擴增出860 870 bp條帶的，判定為英諾克李斯特菌陽性。
2.如權(quán)利要求1所述的一種多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法，其特征在于所述的5條上游引物和1條下游引物的引物序列分別為上游引物 MonoA 5-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3 ； 上游引物 Ino2 5' -ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC-3，； 上游引物 WelD 5' -ACAGTAATACAACTGCACCAA-3'； 上游引物 Gral :5，-AATCAAGTAGGTCTTAGCCTTTCTG-3，； 上游引物 IvaA 5' -TAGCAGCACGGCAAGCGCAA-3'； 下游引物 IislB :5，-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3，。
3.如權(quán)利要求1所述的一種多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法，其特征在于所述的PCR反應條件如下95 °C變性3 min ；95 °C 15 s、58 °C 30 s、72 °C 45 s，進行 30個循環(huán)擴增；72 °C延伸5 min。
4.如權(quán)利要求3所述的一種多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法，其特征在于所述PCR反應體系如下IOX擴增緩沖液5 μ ;4種dNTP混合物各200 μ mol/L ；引物各 0.5 μ mol/L ；DNA 模板2 μ g ；Taq DNA聚合酶2u ；MgCl21. 5 mmol/L ；加雙蒸水至50 μ 1 ；其中所述的4種dNTP混合物指三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸dATP，脫氧胸苷三磷酸 dTTP，脫氧鳥苷三磷酸三鈉dGTP，脫氧胞苷三磷酸dCTP。
5.如權(quán)利要求4所述的一種多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法，其特征在于所述的擴增緩沖液配方為:pH 8.8，25°C，100 mM Tris-HCl ；500 mM, KCl ；0. 8%(v/v)，乙基苯基聚乙二醇。
6.如權(quán)利要求1所述的一種多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法，其特征在于所述的陽性對照標準菌液和待檢菌液分別制備基因組DNA模板的方法為取5種李斯特菌的標準菌株細菌培養(yǎng)液1 ml或者是待檢菌液1 ml，置于無菌的1. 5 ml Eppendorf離心管中，12000 rpm離心1 min，去上清，用滅菌蒸餾水洗滌兩次，收集菌體；加入400 μ 裂解液混勻，置于37 °C水浴1 h;然后加入200 μ 1 5 mol/L的氯化鈉溶液，混勻后于13000 rpm離心15 min ；取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；加兩倍體積無水乙醇，1/10體積，3 mol/L，pH8. 0的醋酸鉀，-20 °C保存1 h后，13000 rpm離心15 min，棄上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室溫干燥后，溶于50 μ TE溶液(上海索萊寶生物科技有限公司)中，置4 °C保存?zhèn)溆谩?br> 7.如權(quán)利要求6所述的一種多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法，其特征在于所述的裂解液配方為40 mmol/L Tris-醋酸，20 mmol/L醋酸鈉，1 mmol/L EDTA，1%十二烷基硫酸鈉(SDS)，pH7. 8。
全文摘要
本發(fā)明公開了了一種多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法，包括如下步驟1)首先選擇5條上游引物和1條下游引物；2)取陽性對照標準菌液和待檢菌液分別制備基因組DNA模板；3)分別在陽性對照標準菌液制備的基因組DNA模板和待檢菌液制備的基因組DNA模板中添加所述上游引物和下游引物進行PCR擴增反應；4)取擴增后的產(chǎn)物進行電泳；5)結(jié)果判定。本發(fā)明是一種快速、準確、靈敏的多重PCR檢測和鑒定5種李斯特菌的方法，為分子生物學方法鑒定李斯特菌種提供選擇。不僅提高了效率，節(jié)約時間，而且節(jié)省檢測成本。
文檔編號C12R1/01GK102286631SQ20111027133
公開日2011年12月21日 申請日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者葉妍妍, 孔繁德, 徐淑菲, 楊俊萍, 郭書林, 陳信忠, 陳垚, 龔艷清 申請人:廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心