專利名稱：哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)重組可溶性人干細(xì)胞因子與免疫球蛋白Fc片段融合蛋白(sSCF ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種將人干細(xì)胞因子與人免疫球蛋白IgGl的Fc段融合基因 (sSCF-Fc)轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞以大規(guī)模生產(chǎn)其蛋白產(chǎn)物的技術(shù)。
背景技術(shù)：
1.SCF的生物學(xué)作用與應(yīng)用前景干細(xì)胞因子(stemcell factor, SCF)，又稱 KIT 配體(KIT Ligand, KITLG)或肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Mast cell growth factor，MGF)，是一種與原癌基因c_Kit產(chǎn)物結(jié)合的糖蛋白(CD117)。SCF通過可變剪切可以形成跨膜型和可溶性兩種形式的的蛋白產(chǎn)物，二者都具有生物活性，在機(jī)體發(fā)育、腫瘤發(fā)生、發(fā)展和侵潤(rùn)及其它疾病的形成等過程中發(fā)揮重要的作用。SCF對(duì)于胚胎發(fā)育過程中的造血作用至關(guān)重要。SCF指導(dǎo)造血干細(xì)胞進(jìn)入造血微環(huán)境，并維持造血干細(xì)胞的存活能力和再生能力?？扇苄曰蚣?xì)胞表面的SCF通過與其細(xì)胞表面受體c-Kit結(jié)合影響效應(yīng)的肥大細(xì)胞、造血前體細(xì)胞、生殖細(xì)胞和黑素細(xì)胞的分化和功能。所有血管發(fā)生的組織如骨髓、胎肝等都有SCF表達(dá)。有研究顯示，SCF或其受體表達(dá)缺陷能夠引起巨紅細(xì)胞貧血癥甚至死亡。SCF在精子發(fā)生過程中也扮演重要角色。SCF是精巢形成和發(fā)育的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)分子，其與受體結(jié)合激活的信號(hào)通路對(duì)于生殖細(xì)胞的增殖、遷移、減數(shù)分裂及其凋亡都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。SCF表達(dá)的時(shí)間和區(qū)域與生殖細(xì)胞的形成及遷移的路徑一致，其受體的表達(dá)時(shí)相也與生殖細(xì)胞的形成過程具有同一性。SCF系統(tǒng)對(duì)人生精細(xì)胞的調(diào)控不僅限于胚胎期，在青春期及隨后精子發(fā)生的全過程均以不同的方式發(fā)揮調(diào)控作用。SCF及其受體缺失能夠引起不育癥。SCF對(duì)于在發(fā)育過程中黑素細(xì)胞的定位非常重要。機(jī)體的色素沉著由一類能夠產(chǎn)生黑色素的黑素細(xì)胞控制。SCF通過結(jié)合成黑素細(xì)胞表面的Kit受體指導(dǎo)其從中樞神經(jīng)系統(tǒng)到達(dá)皮膚或毛發(fā)特定區(qū)域分化成黑素細(xì)胞。另外，SCF對(duì)于成體中終末分化的黑素細(xì)胞存活和增殖的調(diào)節(jié)同樣重要。SCF表缺陷能夠引起斑駁病。SCF表達(dá)異常還與某些腫瘤的關(guān)系密切。與正常的肝組織相比，肝癌組織中SCF及 c-Kit蛋白的表達(dá)明顯降低；食管癌患者胃食管吻合術(shù)后，其胃粘膜和殘存食管中SCF表達(dá)水平較正常人明顯降低；膽管癌病人體內(nèi)SCF表達(dá)水平和陽性率顯著提高，且其表達(dá)與腫瘤分級(jí)呈正相關(guān)，SCF表達(dá)可能與膽管癌的發(fā)生密切相關(guān)，并且參與了腫瘤的侵潤(rùn)過程。目前，SCF已經(jīng)用于某些疾病的治療。SCF作為相關(guān)腫瘤的重要檢測(cè)指標(biāo)用于早期的診斷或預(yù)后的評(píng)價(jià)；另外，SCF還可作為腫瘤治療上的新靶點(diǎn)，對(duì)于阻斷腫瘤細(xì)胞向周圍組織的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移或腫瘤的復(fù)發(fā)可能有重要意義。另外，體外造血干細(xì)胞或其他多能干細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)的成功為器官移植提供了可能性。SCF是在干細(xì)胞培養(yǎng)過程中不可或缺的細(xì)胞因子，用SCF與其它細(xì)胞因子(如IL-3，IL-6，IL-1，TPO, GM-CSF等)協(xié)同作用可體外擴(kuò)增骨髓或外周血來源的干細(xì)胞，如造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞等，這些干細(xì)胞直接回輸至病人體內(nèi)，或體外誘導(dǎo)其進(jìn)行組織分化，將誘導(dǎo)形成的器官移植到病人體內(nèi)，用于白血病、腫瘤或大面積創(chuàng)面的治療。目前，SCF還在其它疾病的治療過程中發(fā)揮作用。SCF與其它化療藥物協(xié)同作用白血病患者可提高造血前體細(xì)胞的動(dòng)員；SCF可用于降低非小細(xì)胞肺癌和乳癌化療過程中產(chǎn)生的血小板減少癥。制備高活性、高純度、低毒性的重組SCF蛋白是生產(chǎn)臨床診斷試劑、治療用SCF藥物和器官移植的前提，為其在科研、臨床診斷和治療等方面研究和應(yīng)用提供了更多的可能性和廣闊的市場(chǎng)前景。2. Fc融合蛋白的表達(dá)免疫球蛋白IgG的Fc融合蛋白是指在基因水平將目的基因同IgG的Fc片段基因相連而表達(dá)的重組蛋白，同時(shí)具有目的蛋白及免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)域，從而賦予了重組蛋白許多新的特性，拓展了蛋白在科研、制藥及臨床等方面的應(yīng)用。在重組蛋白表達(dá)的過程中，F(xiàn)c重組蛋白易于結(jié)合Protein A，從而簡(jiǎn)化了蛋白的純化過程；Fc片段可以方便地進(jìn)行流式、免疫組化和免疫共沉淀等方法檢測(cè)，可用于感興趣的基因研究；體外實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)c融合蛋白可用于拮抗或激活細(xì)胞表面受體用來研究受體-配體反應(yīng)和信號(hào)通路；此外，F(xiàn)c重組蛋白還能應(yīng)用于噬菌體展示技術(shù)，如作為抗原制備人類全抗體庫。另外，F(xiàn)c片段還賦予了重組蛋白一些其它特性，增加了其在在制藥和臨床方面的應(yīng)用價(jià)值。融合蛋白中加入重鏈的恒定區(qū)，其半衰期明顯延長(zhǎng)，延長(zhǎng)了其在體內(nèi)的半衰期； Fc段能穿過胎盤、結(jié)合補(bǔ)體并介導(dǎo)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用等；重組蛋白含有的鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域使其形成二聚體或多聚體，增強(qiáng)了其抗原結(jié)合力。以上這些特點(diǎn)拓展了融合蛋白在感染性疾病、自身免疫性疾病及移植排斥反應(yīng)的治療方面的臨床應(yīng)用前景。3.研究現(xiàn)狀目前國(guó)際上生產(chǎn)的sSCF-Fc重組蛋白基本都是采用大腸桿菌或酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得的，蛋白產(chǎn)物未經(jīng)糖基化或糖基化程度不高，活性和毒素含量難以滿足臨床診斷和治療的目的。用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生sSCF-Fc重組蛋白是生產(chǎn)科研和臨床用SCF的重要途徑，對(duì)于推動(dòng)臨床診斷環(huán)節(jié)的新型生物技術(shù)發(fā)展和臨床藥物開發(fā)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在建立用哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)具有生物學(xué)活性的sSCF-Fc蛋白的方法。在工業(yè)生產(chǎn)中滿足生產(chǎn)成本降低、簡(jiǎn)化工藝流程、提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的總體要求。本發(fā)明包括制備轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒和PEI、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞和表達(dá)、蛋白純化及等四個(gè)步驟。用PEI作為轉(zhuǎn)染試劑，其作為“質(zhì)子海綿”可以高效地結(jié)合雙鏈DNA，把其帶入目的細(xì)胞中，蛋白產(chǎn)物可在短暫的時(shí)間(一般可以表達(dá)一周的時(shí)間)內(nèi)獲得一過性表達(dá)從而獲得大量的蛋白。本發(fā)明所用的293T細(xì)胞是工業(yè)生產(chǎn)人臨床用蛋白最為常見的一種細(xì)胞。不僅表達(dá)水平高，蛋白翻譯后加工方式如糖基化等與體內(nèi)天然蛋白相似，而且無潛在的生物危害性，自身分泌的蛋白很少?gòu)亩?jiǎn)化了后續(xù)的純化過程，特別適于分泌型細(xì)胞因子或趨化因子等產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)。而且這種細(xì)胞可以通過馴化在無血清培養(yǎng)基中生產(chǎn)，對(duì)于降低工業(yè)生產(chǎn)的成本是必需的。細(xì)胞密度能夠提高數(shù)十倍甚至數(shù)千倍，大大提高了蛋白產(chǎn)量。采用本方法，可以通過普通的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)獲得大量高純度高生物活性的 sSCF-Fc蛋白。本項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于sSCF-Fc蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)，能夠明顯降低成本、簡(jiǎn)化工藝流程，提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量。


圖是SDS-PAGE鑒定Protein A親和層析柱純化后的sSCF-Fc重組蛋白電泳結(jié)果圖
具體實(shí)施例方式1.轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒的制備用去除內(nèi)毒素的質(zhì)粒大提試劑盒(購(gòu)自Qiagen公司)制備轉(zhuǎn)染所需連有sSCF_Fc 基因的表達(dá)質(zhì)粒pR-sSCF-Fc。方法見說明書。用200μ1 TE緩沖液溶解質(zhì)粒，紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度。2.轉(zhuǎn)染用PEI的制備1)在500ml的燒杯中倒入450ml Milli-Q制備的超純水；2)天平稱量500mg線性PEI (購(gòu)自Poly Science公司)，加入燒杯中，磁力攪拌器不斷攪動(dòng)；3)逐滴加入預(yù)先配好的12M濃HCl使其pH < 2. 0 (大約需要800 μ 1)。攪動(dòng)PEI 溶液約2-3小時(shí)；4)加入預(yù)先配制的IOM NaOH溶液將pH調(diào)至7.0 (大約需要500 μ 1)。用Milli-Q 超純水將PEI溶液定容至500ml。5) 0. 22- μ m濾膜過濾PEI溶液，分裝成Iml/管，-20C保存。3.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞
1)轉(zhuǎn)染前1天(約24小時(shí))，將293T細(xì)胞用無抗、含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基重懸，按照5 XlO5Ail鋪入150mm培養(yǎng)皿中，每瓶加入25mL，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；2)轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將所需的Opti MEM培養(yǎng)基(或磷酸鹽緩沖液)預(yù)熱到25° _37°C。 冰上溶解連接SCF-Fc基因的表達(dá)質(zhì)粒和PEl ；3)在 5ml 的 Ep 管中加入 2. 5ml Opti MEM/PBS,加入 43. 75 μ g 連有 sSCF-Fc 基因的質(zhì)粒DNA(紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度后，加入洗脫緩沖液調(diào)整濃度至lug/ul)，在振蕩器上輕輕渦旋；4)加入262. 5 μ L lmg/ml的PEI，立即在振蕩器上振蕩3次，每次3秒鐘。室溫下將混合液孵育15分鐘；5)取出預(yù)先鋪入培養(yǎng)皿的細(xì)胞，將DNA/PEI混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶混勻；將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4.表達(dá)產(chǎn)物收集及純化1)轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，將細(xì)胞培養(yǎng)皿完全中培養(yǎng)基吸出，加入25ml無血清培養(yǎng)基(serum free media, SFM)。同時(shí)加入4mM L-谷氨酰胺的和ImM的丙酮酸鈉后繼續(xù)培養(yǎng)；2)轉(zhuǎn)染后2天和4天分別換液并且加入新鮮的SFM及L-谷氨酰胺和ImM的丙酮酸鈉。收集細(xì)胞上清(注意不要把細(xì)胞去掉)，12，000rpm/min離心IOmin去死細(xì)胞和細(xì)胞碎片；3)將上清與等體積的結(jié)合/漂洗緩沖液(0. 15M NaCl, 20mM Na2HPO4, pH8. 0)。與此同時(shí)，用超純水洗滌蛋白純化柱，再用Iml結(jié)合/漂洗緩沖液洗柱子；4)吸取Iml ProteinA的Resin加入純化柱，使其中的液體流盡；加入5mL結(jié)合/ 漂洗緩沖液平衡柱子，使其流速為lml/min ；5)將稀釋后的上清液上柱，調(diào)節(jié)流速為0. 5ml/min ；6) 20mL結(jié)合/漂洗緩沖液洗柱，調(diào)節(jié)流速為2ml/min ；7)最后用4X Iml 0. IM洗脫緩沖液(glycine，pH 2. 5)洗脫蛋白產(chǎn)物，用1. 5ml離心管收集液體，管中預(yù)先加入IlOul IM pH 8. 5的Tris-Cl調(diào)節(jié)pH值。紫外分光光度計(jì)及 SDS-PAGE測(cè)蛋白濃度及純度見附圖。
權(quán)利要求
1.一種用哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)具有生物學(xué)活性SCF-Fc的蛋白的方法，其特征在于該方法通過如下步驟用哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)具有生物學(xué)活性的SCF-Fc蛋白制備轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒和PEI、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞和表達(dá)、蛋白純化及等四個(gè)步驟。
2.如權(quán)利要求1所述的用哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)具有生物學(xué)活性的SCF-Fc蛋白，特征在于所述的SCF-Fc是通過能穩(wěn)定生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中制備純化的。
3.如權(quán)利要求1所述的用哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)具有生物學(xué)活性的SCF-Fc蛋白，特征在于所述的SCF-Fc的表達(dá)為分泌性的可溶性蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的用哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)具有生物學(xué)活性的SCF-Fc蛋白，特征在于所述的SCF-Fc作為生物制劑應(yīng)用于研究和臨床診斷。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種將人干細(xì)胞因子與人免疫球蛋白IgG1的Fc段融合基因(sSCF-Fc)轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞以大規(guī)模生產(chǎn)其蛋白產(chǎn)物的技術(shù)。本發(fā)明旨在建立用哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)具有生物學(xué)活性的sSCF-Fc蛋白的方法。在工業(yè)生產(chǎn)中滿足生產(chǎn)成本降低、簡(jiǎn)化工藝流程、提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的總體要求。采用本方法，可以通過普通的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)獲得大量高純度高生物活性的sSCF-Fc蛋白。本項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于sSCF-Fc蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)，能夠明顯降低成本、簡(jiǎn)化工藝流程，提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量。
文檔編號(hào)C12N15/62GK102344938SQ20111027437
公開日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者周慧芳, 朱月珍, 楊宣武, 柴笑梅, 江永海, 王小娟 申請(qǐng)人:江蘇普羅賽生物技術(shù)有限公司