專利名稱：一種非病毒型轉(zhuǎn)染試劑、其與質(zhì)粒dna復(fù)合物制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種非病毒型轉(zhuǎn)染載體及其與質(zhì)粒DNA復(fù)合物制備方案及其應(yīng)用的技術(shù)。
背景技術(shù)：
1.常規(guī)的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染(transfection)是一種將外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的技術(shù)，在蛋白結(jié)構(gòu)和定位、基因功能和組分研究、基因表達調(diào)控和基因治療等方面應(yīng)用廣泛，已成為生物學(xué)領(lǐng)域的重要工具。轉(zhuǎn)染大致可通過物理、化學(xué)和生物三類方式介導(dǎo)。常見的物理介導(dǎo)方法有電穿孔法、顯微注射和基因槍；化學(xué)介導(dǎo)的方法很多，如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、磷酸鈣共沉淀法、和陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的方法；生物介導(dǎo)方法目前最為常見的是各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法。將病毒作為載體用于轉(zhuǎn)染，其轉(zhuǎn)染效率高，穩(wěn)定性好，細(xì)胞毒性低，通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中易于形成穩(wěn)定表達的細(xì)胞系，在很多實驗中成為優(yōu)先選擇的方案。但是，病毒轉(zhuǎn)染方法的程序復(fù)雜，在藥物性哺乳動物重組蛋白表達或基因治療等臨床應(yīng)用中，病毒載體還存在著潛在的安全隱患，而且隨著蛋白表達規(guī)模的擴大，大量病毒載體的的使用必然導(dǎo)致生產(chǎn)成本的提高。開發(fā)一種安全、有效而便宜的轉(zhuǎn)染載體對于大規(guī)模蛋白生產(chǎn)及臨床治療性轉(zhuǎn)染的優(yōu)化勢在必行。聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI)是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機大分子聚合物，每相隔二個碳原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子，使得聚合物在任何PH下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿”(proton sponge)。這種聚陽離子能將目的基因轉(zhuǎn)入多種宿主細(xì)胞， 而且其細(xì)胞毒性低，無潛在的生物危害性，彌補了病毒載體的不足。目前在轉(zhuǎn)染用載體的設(shè)計中，經(jīng)常將其做為核心部分。作為轉(zhuǎn)染載體與病毒載體相比，PEI還存在轉(zhuǎn)染效率不高和對細(xì)胞毒性大的問題，不利于后續(xù)研究或者生產(chǎn)過程的開展。磷酸鈣共沉淀法是另一種常用的轉(zhuǎn)染方法。磷酸鈣在特定PH值下形成沉淀時， DNA可與之一起沉淀；DNA附在細(xì)胞表面，通過胞吞作用或細(xì)胞膜脂相收縮時裂開的空隙進入細(xì)胞。磷酸鈣方法操作簡單，價格便宜，是很多實驗室首選的轉(zhuǎn)染方法。但磷酸鈣共沉淀法與病毒載體或脂質(zhì)體等方案相比轉(zhuǎn)染效率不高，且有很強的細(xì)胞依賴性。本發(fā)明將PEI和磷酸鈣共沉淀的方法結(jié)合，降低PEI試劑的用量，并對磷酸鈣共沉淀的方案進行了改進，提供了一種非病毒型轉(zhuǎn)染載體及其轉(zhuǎn)染方案，為哺乳動物的大規(guī)模蛋白生產(chǎn)和基因治療提供一種簡便、有效而價格低廉的基因?qū)胪緩健?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一個目的是提供一種轉(zhuǎn)染試劑及其制備方法。將PEI按照特定的方法溶解并調(diào)節(jié)至所需PH值；再將HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸，4-(2-HydrOXyethyl)-l-piperazin eethanesulfonic acid)和氯化鈣分別溶解在特定的鹽溶液中，調(diào)整pH至所需范圍。轉(zhuǎn)染
3試劑在低溫(_20°C )冷凍或反復(fù)凍融條件下能夠長期穩(wěn)定保存而保持較高活性。本發(fā)明的另一目的是提供一種轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒DNA復(fù)合物的制備方法。將PEI與 DNA或磷酸鈣與DNA分別在不同的溶液中混合，按照不同的方式振蕩形成轉(zhuǎn)染用復(fù)合物，將二者分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。12小時后換液，根據(jù)不同的目的，在特定的時間就能檢測目的蛋白的表達情況。采用本方法，可以通過簡單的操作方案和低廉的價格制備轉(zhuǎn)染所需的轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染復(fù)合物。本項技術(shù)應(yīng)用于蛋白生產(chǎn)或基因治療及其它方面的研究，能夠明顯降低成本， 提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量。


圖1 細(xì)胞經(jīng)磷酸鈣沉淀法用PR-EGFP轉(zhuǎn)染后M小時在熒光顯微鏡下的照片；圖2 293T細(xì)胞經(jīng)PEI方法用pR-EGFP轉(zhuǎn)染后M小時在熒光顯微鏡下的照片；圖3 細(xì)胞經(jīng)PEI-磷酸鈣組合轉(zhuǎn)染方法用pR-EGFP轉(zhuǎn)染后M小時在熒光顯微鏡下的照片；圖4 293T細(xì)胞經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(Lipofectamine 2000)用pR-EGFP轉(zhuǎn)染后M小時在熒光顯微鏡下的照片
具體實施例方式1.轉(zhuǎn)染用PEI的制備1)在500ml的燒杯中倒入450ml Milli-Q制備的超純水；2)天平稱量500mg線性PEI (購自Poly Science公司)，加入燒杯中，磁力攪拌器不斷攪動；3)逐滴加入預(yù)先配好的12M濃HCl使其pH < 2. 0 (大約需要800 μ 1)。攪動PEI 溶液約2-3小時；4)加入預(yù)先配制的IOM NaOH溶液將pH調(diào)至7. 0 (大約需要500 μ 1)。用Milli-Q 超純水將PEI溶液定容至500ml。5)0. 22-μ m濾膜過濾PEI溶液，分裝成Iml/管，_20°C保存。2.氯化鈣和2 X HEPES制備1)配制2M氯化鈣溶液2)配制 2 X HEPES 溶液，調(diào)節(jié) pH 7. 0 7. 23) 0. 22- μ m濾膜過濾氯化鈣溶液，2 X HEPES溶液，_20°C保存。3.轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒制備用去除內(nèi)毒素的質(zhì)粒大提試劑盒(購自Qiagen公司)制備轉(zhuǎn)染所需連有目的基因的表達質(zhì)粒(本發(fā)明所用質(zhì)粒為含有綠色熒光蛋白報告基因的表達載體pR-EGFP)。方法見說明書。用200μ1 TE緩沖液溶解質(zhì)粒，紫外分光光度計測其濃度。4.制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物1)制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物I :準(zhǔn)備兩支2毫升(最好使用圓底管，有利于液體混勻且不易溢出)，分別標(biāo)記為A和B。離心管A :2-3 μ g DNA (總體積不超過28 μ 1)6 μ 1轉(zhuǎn)染試劑A加細(xì)胞培養(yǎng)級的無菌水至100 μ 1，輕輕混勻。注意DNA和轉(zhuǎn)染試劑的總體積不要超過20 μ 1。離心管B :2Χ轉(zhuǎn)染緩沖液100微升將A管中液體逐滴加入B管中，邊加邊用渦旋振蕩器輕輕振蕩。這個過程一定要非常緩慢，大約需要2-3分鐘，否則會影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成。室溫靜置30分鐘。這個過程中不能有明顯的沉淀產(chǎn)生，否則轉(zhuǎn)染效率會有明顯的下降。制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物II 將1. 3 μ g DNA用200 μ 1預(yù)先在室溫下預(yù)熱到25°C -37°C的Opti MEM或磷酸鹽緩沖液(PH6.8)稀釋，混勻。加入2. 5μ1升轉(zhuǎn)染試劑B，渦旋震蕩器振蕩三次，每次3秒。 室溫靜置15分鐘。2)同時制備磷酸鈣共沉淀、PEI單獨轉(zhuǎn)染的復(fù)合物。方法與上面兩種復(fù)合物形成方式相同，但量加倍。3) Lipofectamine2000_DNA 轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備將2. 5 μ g DNA 禾Π 5 μ 1 Lipofectamine2000 (購自 hvitrogen 公司)分別用 125 μ 1預(yù)先在室溫下預(yù)熱到25°C -37°C的Opti MEM或磷酸鹽緩沖液(pH6. 8)稀釋，混勻后室溫下靜置5分鐘；將稀釋的DNA加入稀釋好的Lipofectamine2000中，用手輕彈管底混勻。室溫孵育20分鐘。5.將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞將形成的幾種復(fù)合物(復(fù)合物I加II、磷酸鈣-DNA復(fù)合物、PEI-DNA復(fù)合物)分別逐滴加入預(yù)先鋪好的細(xì)胞的培養(yǎng)液中，邊加邊晃動培養(yǎng)板搖勻。繼續(xù)在含有5% C02、37°C 的培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染后1 更換成新鮮的培養(yǎng)基。6.轉(zhuǎn)染后M小時熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況。轉(zhuǎn)染后M小時，顯微鏡下可見各孔細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)正常(呈梭形，亮而飽滿)，PEI 與磷酸鈣組合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的存活率(> 90% )明顯高于其它各孔(< 85%，圖略)，說明其對細(xì)胞的毒性較小。熒光顯微鏡下可見PEI與磷酸鈣組合(圖1)轉(zhuǎn)染效率明顯高于二者單獨轉(zhuǎn)染的效率(圖2、圖3)；與Lipofectamine 2000 (圖4)相比，組合轉(zhuǎn)染的效率略高于后者。本發(fā)明用同樣的方法測試了該轉(zhuǎn)染試劑對CH0-K1、Hela, H印G2、BHK等細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，其結(jié)果大體相同(圖略)。綜上所述，采用本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)染試劑和方案獲得的轉(zhuǎn)染效率在細(xì)胞毒性，價格和轉(zhuǎn)染效率方面均有比較明顯的優(yōu)勢。
權(quán)利要求
1.一種用非病毒型轉(zhuǎn)染載體及其與質(zhì)粒DNA復(fù)合物制備方案及其應(yīng)用的技術(shù)，其特征在于該方法通過如下步驟為哺乳動物的大規(guī)模蛋白生產(chǎn)和基因治療提供一種簡便、有效而價格低廉的基因?qū)胪緩睫D(zhuǎn)染用PEI制備、氯化鈣和2XHEPES制備，轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒制備，制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的用非病毒型轉(zhuǎn)染載體及其與質(zhì)粒DNA復(fù)合物制備方案及其應(yīng)用的技術(shù)，特征在于簡單的操作方案和低廉的價格制備轉(zhuǎn)染所需的轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染復(fù)合物。
3.如權(quán)利要求1所述的用用非病毒型轉(zhuǎn)染載體及其與質(zhì)粒DNA復(fù)合物制備方案及其應(yīng)用的技術(shù)，特征在于為哺乳動物的大規(guī)模蛋白生產(chǎn)和基因治療提供一種簡便、有效而價格低廉的基因?qū)胪緩健?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及一種非病毒型轉(zhuǎn)染載體及其與質(zhì)粒DNA復(fù)合物制備方案及其應(yīng)用的技術(shù)。本發(fā)明一個目的是提供一種轉(zhuǎn)染試劑及其和質(zhì)粒DNA復(fù)合物的制備方法。采用本方法，可以通過簡單的操作方案和低廉的價格制備轉(zhuǎn)染所需的轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染復(fù)合物。本項技術(shù)應(yīng)用于蛋白生產(chǎn)或基因治療及其它方面的研究，能夠明顯降低成本，提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量。
文檔編號C12N15/85GK102399809SQ20111027444
公開日2012年4月4日 申請日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者盧守英, 周慧芳, 朱月珍, 楊宣武, 柴笑梅 申請人:江蘇普羅賽生物技術(shù)有限公司