專利名稱：用于預(yù)測(cè)尿道下裂易感性的基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)測(cè)疾病易感性的基因芯片，具體講是一種用于預(yù)測(cè)尿道下裂易感性的基因芯片。
背景技術(shù)：
尿道下裂是睪丸發(fā)育不全綜合癥的一種，它是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的畸形之一，因?yàn)槟虻礼薏煌耆诤匣蚰虻廊诤系陌l(fā)育停止，導(dǎo)致尿道沿陰莖腹側(cè)異常開裂，尿道開裂部位可能位于陰莖頭部、陰莖甚至陰囊或會(huì)陰的更后端，它屬于常見的陰莖先天性發(fā)育不全。尿道下裂的發(fā)病率在不同國(guó)家和人種之間各有不同，但總體來說在全世界范圍內(nèi)均呈上升趨勢(shì)，目前亞洲、歐洲和北美的男嬰患病率介于0.3%和0.8%之間。近年來，隨著外科技術(shù)和器械的進(jìn)步，對(duì)于尿道下裂的治療也有明顯進(jìn)展。雖然大多數(shù)患有此癥的兒童在出生后可進(jìn)行尿道修復(fù)手術(shù)，但是在以后的生活中患者仍有可能遇上一系列社會(huì)和生殖問題，因此人們對(duì)尿道下裂的發(fā)病原因也更加關(guān)注。目前的研究仍然無法對(duì)尿道下裂的病因?qū)W作清晰的闡述，從大量的調(diào)查數(shù)據(jù)來看，中早期的尿道下裂均表現(xiàn)為家族性疾病，這揭示了尿道下裂的病因?qū)W研究中遺傳性因素的重要性。研究人員試圖從分子水平解釋此類先天性發(fā)育畸形疾病的發(fā)生，以便從其發(fā)生之始便進(jìn)行干預(yù)。尿道下裂可能與隱睪在病因上存在共同的致病因素，臨床上一般認(rèn)為尿道下裂是性別分化和發(fā)育異常綜合癥的一種表現(xiàn)，是一種不同程度的性別發(fā)育畸形?？傮w上來說，尿道下裂是一種經(jīng)遺傳和環(huán)境因素等多因子影響的先天性身體機(jī)能紊亂。男性泌尿生殖系統(tǒng)的發(fā)育是一個(gè)綜合過程，包括遺傳編碼、細(xì)胞分化、旁分泌和自分泌調(diào)節(jié)的激素信號(hào)傳導(dǎo)、酶活性和按預(yù)定順序進(jìn)行的組織重塑等，這些過程都以時(shí)間和濃度依賴的方式發(fā)生。其中，雄激素和雌激素之間的平衡對(duì)于男性生殖系統(tǒng)的正常發(fā)育尤為重要。男嬰尿道和外部生殖系統(tǒng)的發(fā)育是一個(gè)雄激素依賴的過程，雄激素的合成和代謝異?？赡軙?huì)導(dǎo)致異常的生殖系統(tǒng)發(fā)育。陰莖的完整器官形成大約在胚胎第46周完成，它不僅受到胎兒睪丸發(fā)育的影響， 也受胎盤促性腺激素的調(diào)控，胎兒睪丸發(fā)育不全、雄激素作用失調(diào)所導(dǎo)致的尿道溝不能閉合是尿道下裂產(chǎn)生的原因。男嬰外部生殖器官正常表型的發(fā)育需要這些器官組織的原始細(xì)胞內(nèi)睪酮(T)和二氫睪酮(DHT)之間的轉(zhuǎn)化。其中17 β-羥類固醇脫氫酶3(17 β HSD3，由 HSD17B3編碼)和類固醇5 α -還原酶II (由SRD5A2編碼)與此類雄激素的合成和代謝相關(guān)。HSD17B3基因位于染色體9q22上，它包括11個(gè)外顯子。在睪丸內(nèi)，17 β HSD3同工酶催化C19-類固醇雄留烯二酮轉(zhuǎn)化為生物學(xué)活性更大的雄激素睪酮(T)。17 β HSD3的異常會(huì)導(dǎo)致睪酮分泌水平或者生物活性的改變，從而影響睪丸的功能。HSD17B3基因的多個(gè)SNP (單核苷酸多態(tài)性)位點(diǎn)與尿道下裂有關(guān)，尿道下裂可能由HSD17B3基因的突變引起，導(dǎo)致男嬰體內(nèi)17i3HSD3同工酶存在缺陷，進(jìn)而影響睪酮的分泌量和生物活性。SRD5A2基因位于染色體2p23上，長(zhǎng)約1401Λ，包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。它編碼的類固醇5 α -還原酶II為含有259個(gè)氨基酸的疏水蛋白，與男性性別分化相關(guān)。類固醇5 α -還原酶II將外周靶組織分泌的雄激素睪酮(T)轉(zhuǎn)變?yōu)槎洳G酮(DHT)，二氫睪酮(DHT)進(jìn)一步刺激陰莖完整器官的形成。而SRD5A2的多態(tài)性變異體影響了 5 α -還原酶 II的活性，至今發(fā)現(xiàn)該基因近30種突變，包括堿基缺失、點(diǎn)突變、移碼突變等，最多見的突變位點(diǎn)是第4外顯子，其次是第1、5外顯子。突變基因編碼的酶活性下降，導(dǎo)致對(duì)底物雄激素親和力下降和二氫睪酮的水平不足，可能導(dǎo)致尿道下裂等缺陷。此外，在胎兒期、圍產(chǎn)期母體及胎兒環(huán)境外源性雌激素物質(zhì)暴露增加可能干擾了正常的內(nèi)分泌功能，影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cells)及支持細(xì)胞(Sertoli cells)的發(fā)育，從而也會(huì)導(dǎo)致了尿道下裂發(fā)生率的增高。導(dǎo)致尿道下裂發(fā)病的外源性雌激素效應(yīng)與外源性雌激素的量、性質(zhì)、作用時(shí)期及基因易感性有關(guān)。外源性雌激素通過雌激素受體其作用，因此基因易感性主要由雌激素受體的易感性決定，從根本上來說雌激素受體基因的多態(tài)性決定了其對(duì)雌激素相關(guān)疾病的易感性。雌激素受體α基因(即ESRl基因)、雌激素受體β基因(即ESR2基因)和活性轉(zhuǎn)錄因子3基因(即ATF3基因)都是調(diào)節(jié)外源性雌激素作用的重要基因，在人尿道下裂組織中表達(dá)水平明顯上調(diào)。ESRl基因位于第6號(hào)染色體上，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成，長(zhǎng)約四5吐，它編碼含有595個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)雌激素受體α (ERa )，ERa的分子量約為66kD。ESR2基因位于14號(hào)染色體上，長(zhǎng)約1111Λ，它編碼含有485個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)雌激素受體β (ER^), ER^的分子量約為M.3kD。雌激素與ERa或偶聯(lián)，提高雌激素受體的信號(hào)傳導(dǎo)，激活雌激素應(yīng)答基因。而過量的雌激素效應(yīng)可以抑制腦垂體促性腺激素的產(chǎn)生和雄激素的分泌，而雄激素對(duì)睪丸發(fā)育和尿道形成有重要促進(jìn)作用，因此雌激素受體的大量表達(dá)，使得在外源性激素作用下，尿道下裂更易發(fā)生。雌激素受體基因存在多態(tài)性和變異，且多態(tài)性多為功能性，不同的雌激素受體等位基因型有可能決定不同個(gè)體間雌激素受體的表達(dá)水平和功能，進(jìn)而影響雌激素受體調(diào)節(jié)基因表達(dá)和雌激素受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑中各種因子的生物學(xué)作用。ATF3基因編碼活性轉(zhuǎn)錄因子3 (ATF!3)，是一種雌激素應(yīng)答基因，它編碼的ATF3是含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子ATF/CREB家族成員，分子量為21kD。該基因在大部分正常細(xì)胞中呈低濃度穩(wěn)態(tài)表達(dá)，廣泛參與機(jī)體穩(wěn)態(tài)維持、創(chuàng)傷愈合、細(xì)胞黏附、腫瘤形成、凋亡以及信號(hào)傳導(dǎo)等生理和病理過程。該基因的啟動(dòng)子含有雌激素結(jié)合點(diǎn)，可被雌激素激活，存在多態(tài)性和變異，在尿道下裂組織中表達(dá)水平明顯上調(diào)。此外，尿道下裂的發(fā)病機(jī)理可能還包括其他許多致病因素，例如DGKK基因的多個(gè) SNP位點(diǎn)突變也是將近三分之一的尿道下裂病例的致病因素之一。DGKK基因位于X染色體上，該基因含有20個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，大部分SNP位點(diǎn)相互之間為穩(wěn)定的連鎖不平衡狀態(tài)。DGKK 基因編碼人類II型甘油二酯激酶κ，甘油二酯激酶調(diào)節(jié)兩種信號(hào)類脂——甘油二酯和磷脂酸之間的平衡，因而在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。DGKK mRNA在睪丸和胎盤中最為富集，而帶有風(fēng)險(xiǎn)等位基因的患者的包皮皮膚組織中，DGKK的表達(dá)水平有所下調(diào)。尿道下裂的發(fā)生是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，受到多個(gè)蛋白和基因的共同影響，不同的易感基因之間可能存在相互作用。其中任何一個(gè)酶的改變都可能影響疾病的易感性，某一易感基因?qū)δ虻老铝训挠绊懣赡軙?huì)由于其他基因的作用而改變。如果同時(shí)對(duì)多種易感基因的多個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，則有助于闡明各種易感基因之間的相互作用機(jī)制及其對(duì)尿道下裂的影響。傳統(tǒng)的基因檢測(cè)疾病的方法受到方法和思路的限制，往往只能對(duì)一到兩個(gè)基因的多態(tài)性進(jìn)行分析，只能覆蓋一部分患病風(fēng)險(xiǎn)人群，對(duì)由于其他基因上的SNP位點(diǎn)造成的疾病患病風(fēng)險(xiǎn)不能及時(shí)預(yù)警，檢測(cè)準(zhǔn)確性因此會(huì)大幅降低，無法較為全面的檢測(cè)疾病的易感情況。目前國(guó)內(nèi)外尚未有對(duì)尿道下裂的多個(gè)易感基因的多個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)的基因芯片，一般檢測(cè)疾病的易感性均采用直接測(cè)序法，雖然準(zhǔn)確率較高，但是其成本高、無法批量檢測(cè)，不能滿足大規(guī)?；蚝Y選的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種用于預(yù)測(cè)尿道下裂易感性的基因芯片，此基因芯片可確立SNP模式和尿道下裂易感性的對(duì)應(yīng)關(guān)系，迅速便捷地對(duì)普通人群進(jìn)行篩查，準(zhǔn)確率高，成本較低，可用于批量檢測(cè)，能充分滿足大規(guī)?；蚝Y選的要求。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明用于預(yù)測(cè)尿道下裂易感性的基因芯片，它包括以 DGKK、ESRl、ESR2、ATF3、SRD5A2、HSD17B3基因?yàn)闄z測(cè)位點(diǎn)的寡核苷酸探針和對(duì)應(yīng)的特異性引物，所述特異性引物的5’端預(yù)先均用信號(hào)物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。作為優(yōu)選，所述寡核苷酸探針是針對(duì)DGKK基因的rsl934177位點(diǎn)，ESRl基因的 rs693^02 位點(diǎn)、rs9340799 位點(diǎn)和 rs2234693 位點(diǎn)，ESR2 基因的 rs2987983 位點(diǎn)、rsl0483774位點(diǎn)和rs944050位點(diǎn)，ATF3基因的rsl 1119982位點(diǎn)，SRD5A2基因的 rsl21434251 位點(diǎn)、rs523349 位點(diǎn)、rs9282858 位點(diǎn)和 rs28383048 位點(diǎn)，HSD17B3 基因的 rs2066479位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，所述特異性引物能特異性擴(kuò)增出包括上述SNP位點(diǎn)的DNA片段。作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述寡核苷酸探針具有SEQ ID NO. 1-N0. 104所示的核苷酸序列。作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述特異性引物具有SEQ ID NO. 105-N0. 1 所示的核苷酸序列。作為優(yōu)選，所述特異性引物的5’端預(yù)先均用熒光素、同位素、生物素或地高辛進(jìn)行標(biāo)記。作為優(yōu)選，所述基因芯片還包括固相載體，所述固相載體為經(jīng)過表面化學(xué)基團(tuán)修飾的玻璃基質(zhì)，所述寡核苷酸探針的末端帶有修飾氨基，所述玻璃基質(zhì)的化學(xué)基團(tuán)可與寡核苷酸探針的修飾氨基共價(jià)結(jié)合。作為改進(jìn)，所述基因芯片還包括一個(gè)陰性對(duì)照樣本和一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照樣本。作為改進(jìn)，所述基因芯片還包括雜交盒和雜交液。作為進(jìn)一步改進(jìn)，所述基因芯片還包括DNA取樣試劑、PCR擴(kuò)增試劑和PCR產(chǎn)物純化試劑。本發(fā)明的用于預(yù)測(cè)尿道下裂易感性的基因芯片的使用方法為(1)使用所述DNA取樣試劑提取患者DNA ;(幻使用所述特異性引物和所述PCR擴(kuò)增試劑擴(kuò)增包括目標(biāo)SNP位點(diǎn)的DNA片段；C3)將同一樣本的各個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合，加入雜交液后與所述芯片雜交； (4)使用掃描儀掃描雜交信號(hào)。上述技術(shù)方案中的DNA提取、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化和基因芯片等均為常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)?；蛐酒夹g(shù)是近年迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)前沿分子生物學(xué)技術(shù)，它又被稱為DNA 芯片或DNA微陣列，是生物芯片的一種。它通過與計(jì)算機(jī)圖像分析的有機(jī)結(jié)合，在一次實(shí)驗(yàn)中可對(duì)樣品中靶分子的質(zhì)量或數(shù)量進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)。具體來說，基因芯片是指將大量人工合成的或應(yīng)用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)獲得的核酸片段作為探針，所述探針包含特定的核苷酸序列，采用微量點(diǎn)樣等方法，使所述探針按照特定的排列方式和特定的手段固化于支持物(如玻片、硅片、塑料片、聚丙烯酰胺凝膠篇或尼龍膜等載體)的表面，形成密集二維分子排列。然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中靶分子進(jìn)行雜交，通過特定的掃描儀如光學(xué)掃描儀、激光共聚焦掃描儀或電荷偶聯(lián)攝影相機(jī)(CCD)對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行快速、并行、高效地分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量和質(zhì)量。本發(fā)明的芯片中包含與尿道下裂易感性檢測(cè)相關(guān)的目的基因和用于質(zhì)控的基因，基因芯片的結(jié)構(gòu)以及制造方法可以參閱CN 2457166A、CN1341752A、CN1616178A、 US5445934、US5532U8等公開的方法，可方便地根據(jù)使用者的要求制出所需芯片，所述基因芯片的制作步驟簡(jiǎn)潔方便、成本較低。PCR (即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，Polymerase Chain Reaction)是最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一，是由體外酶催化擴(kuò)增特異DNA的一種方法。典型的PCR —般包括高溫使模板DNA 變性、引物和模板退火、引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成的循環(huán)，經(jīng)過上述多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速大量擴(kuò)增。本發(fā)明的寡核苷酸探針根據(jù)尿道下裂相關(guān)基因的各SNP位點(diǎn)和側(cè)翼序列設(shè)計(jì)，針對(duì)每個(gè)SNP位點(diǎn)，正反2條DNA鏈共設(shè)計(jì)8條探針；然后再根據(jù)SNP位點(diǎn)兩端的更遠(yuǎn)側(cè)翼序列設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增的上下游引物，對(duì)每對(duì)引物之一的5’端預(yù)先進(jìn)行信號(hào)標(biāo)記，所述標(biāo)記優(yōu)選為熒光標(biāo)記、同位素標(biāo)記、生物素標(biāo)記或地高辛標(biāo)記。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行探針合成，并進(jìn)行氨基修飾或信號(hào)標(biāo)記，然后提取待檢測(cè)樣品的DNA，用針對(duì)每個(gè)待檢測(cè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)的上下游引物對(duì)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，使得微量待檢測(cè)樣品的DNA大量擴(kuò)增，并在擴(kuò)增過程中引入熒光標(biāo)記等信號(hào)標(biāo)記。擴(kuò)增后含有信號(hào)標(biāo)記物的待測(cè)樣品核酸靶分子通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與芯片上的寡核苷酸探針雜交，此后進(jìn)行芯片掃描，獲得每個(gè)位點(diǎn)的信號(hào)，對(duì)雜交信號(hào)強(qiáng)弱和有無進(jìn)行分析，即可判斷樣品中靶基因的數(shù)量和性質(zhì)。本發(fā)明采用PCR擴(kuò)增和基因芯片相結(jié)合的技術(shù)， 使得檢測(cè)的靈敏度高、通量大。上述DNA提取試劑、PCR擴(kuò)增試劑、PCR產(chǎn)物純化試劑、雜交試劑均可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的在這些操作過程中需使用的各種試劑，這些試劑必要時(shí)可以包括在基因芯片試劑中，也可以將其配方列在基因芯片試劑的說明書中，由使用者按照說明書中的指示自行配制。因此，本發(fā)明的用于預(yù)測(cè)尿道下裂易感性的基因芯片，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)
(1)設(shè)計(jì)了檢測(cè)尿道下裂易感性的基因芯片系統(tǒng)，確立SNP模式和尿道下裂易感性的對(duì)應(yīng)關(guān)系；(2)針對(duì)尿道下裂不同的患病途徑檢測(cè)多個(gè)相關(guān)的基因及其多態(tài)性位點(diǎn)，能更準(zhǔn)確全面地預(yù)測(cè)受檢者不同患病途徑的患病風(fēng)險(xiǎn)，可迅速便捷地對(duì)普通人群進(jìn)行篩查，在疾病發(fā)生早期就預(yù)測(cè)出尿道下裂易感性，從而通過各種治療方法盡早干預(yù)，減輕甚至消除尿道下裂對(duì)兒童的不良影響；(3)準(zhǔn)確率高，成本較低，可用于批量檢測(cè)，能充分滿足大規(guī)?；蚝Y選的要求；(4)芯片制作的步驟簡(jiǎn)潔方便，檢測(cè)靈敏度高，通量大。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于以下實(shí)施例，相同領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在本發(fā)明的技術(shù)方案框架內(nèi)提出其他的實(shí)施例，但這些實(shí)施例均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)施放大，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。本發(fā)明用于預(yù)測(cè)尿道下裂易感性的基因芯片，它包括以DGKK、ESRU ESR2、ATF3、 SRD5A2、HSD17B3基因?yàn)闄z測(cè)位點(diǎn)的寡核苷酸探針和對(duì)應(yīng)的特異性引物，所述特異性引物的 5’端預(yù)先均用信號(hào)物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。作為優(yōu)選，所述寡核苷酸探針是針對(duì)DGKK基因的rsl934177位點(diǎn)，ESRl基因的 rs693^02 位點(diǎn)、rs9340799 位點(diǎn)和 rs2234693 位點(diǎn)，ESR2 基因的 rs2987983 位點(diǎn)、rsl0483774位點(diǎn)和rs944050位點(diǎn)，ATF3基因的rsl 1119982位點(diǎn)，SRD5A2基因的 rsl21434251 位點(diǎn)、rs523349 位點(diǎn)、rs9282858 位點(diǎn)和 rs28383048 位點(diǎn)，HSD17B3 基因的 rs2066479位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，所述特異性引物能特異性擴(kuò)增出包括上述SNP位點(diǎn)的DNA片段。作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述寡核苷酸探針具有SEQ ID NO. 14-N0. 117所示的核苷酸序列。作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述特異性引物具有SEQ ID NO. 118-N0. 139所示的核苷酸序列。作為優(yōu)選，所述特異性引物的5’端預(yù)先均用熒光素、同位素、生物素或地高辛進(jìn)行標(biāo)記。作為優(yōu)選，所述基因芯片還包括固相載體，所述固相載體為經(jīng)過表面化學(xué)基團(tuán)修飾的玻璃基質(zhì)，所述寡核苷酸探針的末端帶有修飾氨基，所述玻璃基質(zhì)的化學(xué)基團(tuán)可與寡核苷酸探針的修飾氨基共價(jià)結(jié)合。作為改進(jìn)，所述基因芯片還包括一個(gè)陰性對(duì)照樣本和一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照樣本。作為改進(jìn)，所述基因芯片還包括雜交盒和雜交液。作為進(jìn)一步改進(jìn)，所述基因芯片還包括DNA取樣試劑、PCR擴(kuò)增試劑和PCR產(chǎn)物純化試劑。本發(fā)明的用于預(yù)測(cè)尿道下裂易感性的基因芯片的使用方法為(1)使用所述DNA 取樣試劑提取患者DNA ;(幻使用所述特異性引物和所述PCR擴(kuò)增試劑擴(kuò)增包括目標(biāo)SNP位點(diǎn)的DNA片段；C3)將同一樣本的各個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合，加入雜交液后與所述芯片雜交；(4)使用掃描儀掃描雜交信號(hào)。本實(shí)施例選取與尿道下裂易感性相關(guān)的DGKK、ESR1、ESR2、ATF3、SRD5A2、HSD17B3 基因上的13個(gè)SNP位點(diǎn)，根據(jù)這13個(gè)SNP位點(diǎn)及其側(cè)翼序列設(shè)計(jì)寡核苷酸探針和對(duì)應(yīng)的特異性引物，針對(duì)每個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)4對(duì)寡核苷酸探針，即正反兩條DNA鏈共設(shè)計(jì)8條寡核苷酸探針。有兩對(duì)特異性引物可擴(kuò)增出同時(shí)包括上述兩個(gè)SNP位點(diǎn)在內(nèi)的DNA片段，因此共設(shè)計(jì)了 11對(duì)特異性引物，可擴(kuò)增出包括上述13個(gè)SNP位點(diǎn)在內(nèi)的DNA片段。具體來說，基因芯片的制備方法可按照如下步驟進(jìn)行原料準(zhǔn)備——醛基芯片(高分子三維基片D，廠商Capitalbio，規(guī)格為75. 5*25. 2*1. 0)基因芯片點(diǎn)樣液(Capitalbio，5ml)或2*Spoting Solution 等1、寡核苷酸探針序列設(shè)計(jì)如序列表所述，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法合成5’ 端氨基標(biāo)記探針，所述寡核苷酸探針與各SNP位點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系如下所示
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)測(cè)尿道下裂易感性的基因芯片，其特征在于它包括以DGKK、ESRU ESR2、ATF3、SRD5A2、HSD17B3基因?yàn)闄z測(cè)位點(diǎn)的寡核苷酸探針和對(duì)應(yīng)的特異性引物，，所述特異性引物的5’端預(yù)先均用信號(hào)物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于預(yù)測(cè)尿道下裂易感性的基因芯片，其特征在于所述寡核苷酸探針是針對(duì)DGKK基因的rsl934177位點(diǎn)，ESRl基因的rs693^02位點(diǎn)、rs9340799 位點(diǎn)和rs2234693位點(diǎn)，ESR2基因的rs2987983位點(diǎn)、rsl0483774位點(diǎn)和rs944050位點(diǎn)， ATF3 基因的 rsl 1119982 位點(diǎn)，SRD5A2 基因的 rsl21434251 位點(diǎn)、rs523349 位點(diǎn)、位點(diǎn)和rd8383048位點(diǎn)，HSD17B3基因的rs2066479位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，所述特異性引物能特異性擴(kuò)增出包括上述SNP位點(diǎn)的DNA片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于預(yù)測(cè)尿道下裂易感性的基因芯片，其特征在于所述寡核苷酸探針具有SEQ ID NO. 1-N0. 104所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于預(yù)測(cè)尿道下裂易感性的基因芯片，其特征在于所述特異性引物具有SEQ ID NO. 105-N0. 1 所示的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的用于預(yù)測(cè)尿道下裂易感性的基因芯片，其特征在于所述特異性引物的5’端預(yù)先均用熒光素、同位素、生物素或地高辛進(jìn)行標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的用于預(yù)測(cè)尿道下裂易感性的基因芯片，其特征在于所述基因芯片還包括固相載體，所述固相載體為經(jīng)過表面化學(xué)基團(tuán)修飾的玻璃基質(zhì)，所述寡核苷酸探針的末端帶有修飾氨基，所述玻璃基質(zhì)的化學(xué)基團(tuán)可與寡核苷酸探針的修飾氨基共價(jià)結(jié)合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的用于預(yù)測(cè)尿道下裂易感性的基因芯片，其特征在于所述基因芯片還包括一個(gè)陰性對(duì)照樣本和一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照樣本。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的用于預(yù)測(cè)尿道下裂易感性的基因芯片，其特征在于所述基因芯片還包括雜交盒和雜交液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于預(yù)測(cè)尿道下裂易感性的基因芯片，其特征在于所述基因芯片還包括DNA取樣試劑、PCR擴(kuò)增試劑和PCR產(chǎn)物純化試劑。
10.一種權(quán)利要求9所述的基因芯片的使用方法，其特征在于所述方法為(1)使用所述DNA取樣試劑提取患者DNA ;(幻使用所述特異性引物和所述PCR擴(kuò)增試劑擴(kuò)增包括目標(biāo) SNP位點(diǎn)的DNA片段；(3)將同一樣本的各個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合，加入雜交液后與所述芯片雜交；(4)使用掃描儀掃描雜交信號(hào)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于預(yù)測(cè)尿道下裂易感性的基因芯片，它包括以DGKK、ESR1、ESR2、ATF3、SRD5A2、HSD17B3基因?yàn)闄z測(cè)位點(diǎn)的寡核苷酸探針和對(duì)應(yīng)的特異性引物，所述特異性引物的5’端預(yù)先均用信號(hào)物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。本發(fā)明的基因芯片可確立SNP模式和尿道下裂易感性的對(duì)應(yīng)關(guān)系，迅速便捷地對(duì)普通人群進(jìn)行篩查，準(zhǔn)確率高，成本較低，可用于批量檢測(cè)，能充分滿足大規(guī)?；蚝Y選的要求。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102417926SQ20111027534
公開日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者孫早, 徐珊, 王海勇, 符偉紅, 金濤, 陳艷麗 申請(qǐng)人:杭州博泰基因技術(shù)有限公司