專利名稱：一種降解蓖麻基潤滑油及礦物油的耐鹽菌株l-3的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物育種及生態(tài)領域，尤其是一種降解蓖麻基潤滑油及礦物油的耐鹽菌株L-3。
背景技術：
隨著全球經(jīng)濟的快速發(fā)展，每年都要消耗大量的石油產(chǎn)品，除汽、柴油等成品油外，很大一部分就是用于各種不同領域的潤滑油，隨著潤滑油的廣泛使用，人們越來越關注它對環(huán)境產(chǎn)生的影響。在使用過程中，潤滑油不可避免地會通過泄漏、溢出或不恰當?shù)呐欧诺韧緩竭M入環(huán)境，而在這些油品中，大部分不能被生物降解，并具有一定的生態(tài)毒性，嚴重污染大氣、土壤和水資源，破壞生態(tài)環(huán)境和生態(tài)平衡。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年約有500 1000 萬噸石油基化學品進入生物圈，僅歐共體每年就有60萬噸潤滑油進入環(huán)境。在我國，廢油的回收率不足10%，以此估算，每年至少有觀 32萬噸流入環(huán)境，造成極大的資源浪費和環(huán)境污染。據(jù)報道，礦物潤滑油污染地下水的影響可達100年，微量的礦物油會阻礙植物的生長和毒害水生生物，約0. 1 μ g/g的礦物油即可使水生殼類生物減壽20%。目前，潤滑油污染土壤的治理方法主要有物理方法、化學方法和生物方法3種。物理方法包括挖掘填埋法、氣提吹脫法、電解法、洗滌法和隔離控制法等，主要采用熱處理法，即通過焚燒或鍛燒， 凈化土壤中大部分有機污染物，但同時亦破壞土壤結(jié)構和組分，且所用的燃料和設備價格昂貴因此很難實施；化學方法包括氧化劑氧化法、光化學氧化法、熱分解法、萃取法和化學棚法等，采用化學浸出和水洗也可以獲得較好的除油效果，但所用的化學試劑的二次污染問題限制了其應用。為徹底解決廢潤滑油對環(huán)境造成的污染，許多國家都以極大熱情相繼進行環(huán)境兼容潤滑油即可生物降解潤滑油的研究。所謂可生物降解潤滑油，又稱綠色潤滑油或環(huán)境友好潤滑油，是指潤滑油必須滿足機器工況的要求，即使用性能；潤滑油及其損耗產(chǎn)物對生態(tài)不造成危害，或在一定程度上為環(huán)境所容許，即生態(tài)效應，主要包括可生物降解性、生物積聚性、毒性和生態(tài)毒性、損耗和可再生資源，其中，生物降解性是反映其生態(tài)效應最主要的指標，建立廢潤滑油生物降解性評定方法對研究可降解性廢潤滑油具有重要意義。生物修復是指利用微生物及其它生物，將存在于土壤中的有毒有害的油品污染物現(xiàn)場降解成二氧化碳和水或轉(zhuǎn)化成為無害物質(zhì)的工程技術系統(tǒng)，它是傳統(tǒng)的生物處理方法的延伸。生物修復由于能夠治理大面積污染而成為一種新型可靠的環(huán)保技術，已得到世界環(huán)保部門的認可，并引起了工業(yè)界的關注，生物修復在治理土壤污染方面的作用己越來越突出。生物修復的類型主要包括微生物對污染土壤的修復、植物對污染土壤的修復及微生物一植物的聯(lián)合修復，其中微生物對潤滑油污染土壤的生物修復是近年來科學家研究的重點ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足之處，提供一種耐鹽性好的降解蓖麻基潤滑油的菌株L-3，是一種生長速度快，能以蓖麻基潤滑油為唯一碳源的菌種。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的一種降解蓖麻基潤滑油的菌株L-3，菌株L-3的分類名稱克雷伯氏菌klebsiella SP.，保藏編號為CGMCC No. 4925，保藏日期2011年06年10日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。而且，菌株L-3對蓖麻基潤滑油的降解率為80 % -90 %。而且，菌株L-3 使用的培養(yǎng)基配方ΚΗ2Ρ043· 4g/L，Na2HPO4L 5g/L，(NH4) 2S044. Og/ L，MgSO4O. 7g/L，NaCl 1. 6g/L，酵母粉 0. Olg/L, Tween-800. 6mL,蓖麻基潤滑油 5. OmL,蒸餾水 1L，pH 7· 0 7· 2。而且，所述菌株L-3以蓖麻基潤滑油為唯一碳源進行生長。而且，所述菌株L-3降解的礦物油包括齒輪油、液壓油。而且，所述菌株L-3耐NaCl濃度為7%。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果如下1.本發(fā)明利用平板梯度涂布法，從蓖麻榨油車間排污井口采取土樣和水樣中篩選出能以廢棄蓖麻基潤滑油為唯一碳源的菌種，該方法操作簡便快捷，能顯著縮短菌株篩選時間。2.本發(fā)明篩選出的降解廢棄蓖麻基潤滑油的菌株L-3，生長速度快，在最適培養(yǎng)溫度和PH條件下，有利于擴大培養(yǎng)，制成菌種發(fā)酵劑，投放到污染地進行生態(tài)修復。3.本發(fā)明對篩選的菌株進行了初步鑒定，通過生理生化及相關菌株鑒定試驗，得出菌株具有耐鹽性，革蘭氏陽性，鏈球狀，無鞭毛，不運動，葡萄糖氧化發(fā)酵實驗不產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣，產(chǎn)過氧化氫酶，明膠酶等，初步鑒定為克雷伯菌屬。4.以本發(fā)明篩選出的降解蓖麻基潤滑油的L-3菌株為出發(fā)菌株，采用改良的 CEC-L-33-A-93實驗方法進行生物降解，在30°C，180r/min，黑暗遮光條件下培養(yǎng)7d后，用四氯化碳進行萃取，采用頂在處檢測CH3-CH2-中C-H-鍵的振動吸收峰，計算出殘余油量，得出蓖麻基潤滑油的降解率。本方法可縮短降解培養(yǎng)周期，從21d縮短到7d，與其他降解方法相比，實驗效率大大提高。


圖1為本發(fā)明L-3菌株CEC法測試紅外光譜圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的， 不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的技術路線為將采集的土樣和水樣用無菌水制成懸浮液，采用平板梯度涂布法進行菌株分離，從中分離出降解效果較好的菌株L-3，再對L-3菌株進行改良的 CEC-L-33-A-93實驗，獲得較好的降解效果。一種降解蓖麻基潤滑油及礦物油的耐鹽菌株L-3，其篩選步驟如下1.從蓖麻榨油車間排污井口采取土樣和水樣，采樣所需工具均已滅菌；2.菌株初篩將采集的樣品經(jīng)24h曝氣處理后，在無菌操作條件下取少量樣品，加入50mL無菌水，攪拌，制成懸浮液，用移液槍取0. ImL懸浮液，放入以廢棄蓖麻基潤滑油為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基平板上(培養(yǎng)基KH2P043. 4g ；Na2HPO4L 5g ； (NH4)2S044. Og ； MgSO4O. 7g ；NaCl 1. 6g ；酵母粉 0. Olg ；Tween-800. 6mL,蓖麻基潤滑油 5. OmL,蒸餾水 IOOOmL, pH7. 0 7. 2)，用無菌涂布器連續(xù)涂布四個平板，分別放置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中， 培養(yǎng)2-3d，挑取生長較快和不同菌落形態(tài)的菌株，進一步分離純化復篩，從中篩選出能以廢棄蓖麻基潤滑油為唯一碳源生長的菌種。3.菌株復篩；將第一次挑選出的菌株分別接種在以蓖麻基潤滑油為唯一碳源的平板篩選培養(yǎng)基上進行分離純化，將平板分別置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2-3d，觀察結(jié)果，再挑選生長較快的不同單菌落，接種到斜面中，培養(yǎng)后，將菌株L-3置于4°C冰箱保藏， 待用。4. L-3菌株的鑒定(1)菌株耐鹽性實驗在250mL三角瓶中裝入IOOmL富集培養(yǎng)基(葡萄糖，3g ；NaCl,5g ；酵母膏，3g ；蛋白胨，3g ；K2HPO4 ·3Η20，2. 7g ；蒸餾水，IOOOmL ；pH為7. 2)，將L-3菌株以相同接種量接入NaCl 質(zhì)量分數(shù)為1%、3%、5%、7%、9%的培養(yǎng)基中，300C，180r/min,培養(yǎng)3d，測定0D600值，其結(jié)果見表3。表3L-3菌株的耐鹽性
權利要求
1.一種降解蓖麻基潤滑油及礦物油的耐鹽菌株L-3，其特征在于菌株L-3的分類名稱克雷伯氏菌klebsiella sp.，保藏編號為=CGMCC No. 4925，保藏日期2011年06年10 日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
2.根據(jù)權利要求1所述的降解蓖麻基潤滑油及礦物油的耐鹽菌株L-3，其特征在于菌株L-3對蓖麻基潤滑油的降解率為80% -90%。
3.根據(jù)權利要求1所述的降解蓖麻基潤滑油及礦物油的耐鹽菌株L-3，其特征在于菌株 L-3 使用的培養(yǎng)基配方=KH2PO4 3. 4g/L, Na2HPO4 1. 5g/L，(NH4)2SO4 4. Og/L, MgSO4O. 7g/L， NaCl 1. 6g/L，酵母粉 0. 01g/L，Tween-80 0. 6mL，蓖麻基潤滑油 5. OmL，蒸餾水 1L，pH 7.0 7. 2。
4.根據(jù)權利要求1所述的降解蓖麻基潤滑油及礦物油的耐鹽菌株L-3，其特征在于所述菌株L-3以蓖麻基潤滑油為唯一碳源進行生長。
5.根據(jù)權利要求1所述的降解蓖麻基潤滑油及礦物油的耐鹽菌株L-3，其特征在于所述菌株L-3降解礦物油包括齒輪油和液壓油。
6.根據(jù)權利要求1所述的降解蓖麻基潤滑油及礦物油的耐鹽菌株L-3，其特征在于所述菌株L-3耐NaCl濃度為7%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種降解蓖麻基潤滑油及礦物油的菌株L-3，其特征在于菌株L-3的分類名稱克雷伯氏菌，保藏編號為CGMCC No.4925，保藏日期2011年06年10日，保藏地址為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。本發(fā)明利用平板梯度涂布法，從蓖麻榨油車間排污口附近采取土樣和水樣，篩選出能以蓖麻基潤滑油為唯一碳源生長的微生物，該方法操作簡便快捷，篩選出的降解蓖麻基潤滑油的菌株L-3生長速度快，在最適培養(yǎng)溫度和pH條件下，有利于擴大培養(yǎng)，制成菌種發(fā)酵劑，投放到污染環(huán)境中進行生態(tài)修復。
文檔編號C12R1/22GK102352328SQ201110277358
公開日2012年2月15日 申請日期2011年9月19日 優(yōu)先權日2011年9月19日
發(fā)明者何良年, 劉亞瓊, 葉鋒, 李風娟, 王昌祿, 王玉榮, 陳勉華 申請人:天津南開大學蓖麻工程科技有限公司