專(zhuān)利名稱(chēng)：抗老年性癡呆的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明涉及用于早期檢測(cè)和治療老年性癡呆 (Alzheimer’sDisease，AD)的抗體。具體而言，本發(fā)明涉及抗老年癡呆癥主要靶蛋白A β 42 肽的單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
老年性癡呆(Alzheimer’ s Disease. AD)是一種漸進(jìn)性神經(jīng)退化性疾病，其主要表現(xiàn)為記憶功能衰減及識(shí)別能力障礙，同時(shí)伴有各種神經(jīng)癥狀和行為障礙，具有非常高的發(fā)病率。自1907年德國(guó)醫(yī)生Alois Alzheimer首次報(bào)道AD的癥狀和病理至今已近一個(gè)世紀(jì)，AD的確切致病機(jī)理仍無(wú)定論。研究發(fā)現(xiàn)，AD的主要病理表現(xiàn)有腦內(nèi)細(xì)胞外的老年斑(senile plaques)沉積、細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFT)以及膽堿功能缺損等，最終造成神經(jīng)元損傷和壞死并最終導(dǎo)致海綿腦病。1984年，Glenner和Wong(Biochem Biophys Res Commun, 1984,120 (3) =885-890)發(fā)現(xiàn)老年斑的主要成分是一種由39至43個(gè)氨基酸殘基組成的具有折疊構(gòu)型的多肽，相對(duì)分子質(zhì)量約4200，稱(chēng)為β-淀粉樣蛋白(i3-amyloid，A β)。1992 年，Hardy 和 Higgins Science，1992,256(5054) 184-185)提出了 “Α β 級(jí)聯(lián)假說(shuō)(amyloid cascade hypothesis) ”，認(rèn)為A β的聚集和沉積能加劇神經(jīng)原纖維的纏結(jié)， 并導(dǎo)致細(xì)胞死亡，是AD形成的最主要原因。A β沉積發(fā)生在AD早期，且與正常大腦相比， AD患者大腦中的Αβ沉積更為嚴(yán)重和廣泛，而A β本身能引起氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡以及軸突生長(zhǎng)異常等神經(jīng)病理學(xué)變化，提示A β在AD的產(chǎn)生與發(fā)展中具有重要作用。A β沉積主要集中在小膠質(zhì)細(xì)胞周?chē)?，并刺激小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥因子，發(fā)生炎癥反應(yīng)，這種慢性炎癥反應(yīng)能夠引起細(xì)胞的裂解并釋放具有反應(yīng)活性的氧化性物質(zhì)，從而削弱了吞噬細(xì)胞的吞噬作用，這樣更加劇了 A β的沉積。A β蛋白在大腦內(nèi)積聚形成纖維和斑塊(俗稱(chēng)老年斑)，造成神經(jīng)元損傷和壞死并最終導(dǎo)致海綿腦病。A β是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)正常代謝的產(chǎn)物之一。APP基因位于人類(lèi)第21號(hào)染色體長(zhǎng)臂，由至少18個(gè)外顯子編碼，A β的編碼序列位于第16、17個(gè)外顯子。APP主要有兩條代謝途徑一是α -分泌酶在687與688氨基酸之間切割，將APP氨基末端671個(gè)氨基酸的可溶性多肽sAPP α釋放到胞外，由于切割位點(diǎn)在A β序列內(nèi)，因此不產(chǎn)生完整的A β片段；另一條途徑是經(jīng)β-分泌酶在671與672 氨基酸之間切割，然后由g_分泌酶在APP的跨膜區(qū)切割，釋放出A β 40、Α β 42、Α β 43，正常情況下多數(shù)為Αβ 40(90% )，只有少量Αβ42和Αβ43產(chǎn)生。Wiltfang等(2007，Journal ofNeurochemistry,101(4) :1053-1059)發(fā)現(xiàn)，A β40 肽和 A β 42 肽的比例失調(diào)，是造成老年癡呆的重要原因之一。因此A β 42肽成為研究人員治療AD的重要靶點(diǎn)。APP的代謝和A β的產(chǎn)生受到多種因素的調(diào)節(jié)。對(duì)早期發(fā)病AD的遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大部分AD與第21號(hào)染色體上的APP基因突變相關(guān)，為揭示A β和APP在AD病理發(fā)展中的作用提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。AD突變位于APP的第670和671密碼子，能增強(qiáng)β -分泌酶的活性。突變位于APP的第612個(gè)密碼子，能抑制α-分泌酶的剪切活性。這兩種突變的結(jié)果使更多的APP由β -分泌酶途徑代謝，產(chǎn)生大量的A β。經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生并釋放至胞外的A β將在適當(dāng)?shù)臈l件下聚集。A β的聚集主要有兩個(gè)步驟，即核心形成和聚集體擴(kuò)大。核心形成是A β聚集過(guò)程中的限速步驟。A β 1-42 具有較強(qiáng)的自我聚集能力，是核心的主要成分。因此，A β 42肽是治療老年癡呆癥的主要靶點(diǎn)。A β的毒性主要表現(xiàn)在(1)Α β能與細(xì)胞表面的許多受體結(jié)合，如神經(jīng)NGF的低親和力受體Ρ75、高級(jí)糖基化終產(chǎn)物的受體，從而激活胞內(nèi)的caspase信號(hào)通路，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。A β還能改變線粒體膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞色素c由線粒體釋放到胞漿并與凋亡蛋白酶激活因子結(jié)合，參與激活caspase通路，引起細(xì)胞凋亡。(2)A β的毒性一部分是通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞之類(lèi)的非神經(jīng)元細(xì)胞來(lái)介導(dǎo)，在神經(jīng)斑周?chē)ǔＤ軌虬l(fā)現(xiàn)被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞。膠質(zhì)細(xì)胞的活化導(dǎo)致白介素-I(IL-I)的過(guò)度表達(dá)和釋放，繼而誘發(fā)IL-6、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、γ-干擾素(INF-γ )等細(xì)胞因子的表達(dá)，還能誘導(dǎo)補(bǔ)體、黏附分子、急性期蛋白、氧自由基、前列腺素、一氧化氮等生成增加，這些分子通過(guò)作用于膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元， 促使其他炎癥分子的產(chǎn)生，這種交互作用促成了慢性炎癥產(chǎn)物分別在AD病理?yè)p傷的不同階段起作用，并貫穿其病理發(fā)展的全過(guò)程。(3)3、Αβ能降低Na+和Κ+-ΑΤΡ酶的活性，從而改變膜的極性和流動(dòng)性，并通過(guò)干擾L-型電壓依賴(lài)性的Ca2+通道來(lái)破壞細(xì)胞內(nèi)鈣的動(dòng)態(tài)平衡。另外，A β能引起蛋白質(zhì)過(guò)氧化和脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)，從而降低細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激的能力。(4) AD患者腦中的能量代謝變化早于老年斑等主要病理表現(xiàn)的產(chǎn)生。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A β不僅能破壞線粒體膜，還能直接作用于線粒體內(nèi)的三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈，減少ATP的產(chǎn)生。能量代謝的損傷將進(jìn)一步誘導(dǎo)氧自由基和鈣超載，三者之間相互影響而形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致包括AD在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病。(5)A β可以作用于興奮性氨基酸受體-NMDA(N-methyl-D-aSpartiate)受體，增加該受體對(duì)興奮性氨基酸，如谷氨酸的敏感性，導(dǎo)致帶有該受體的神經(jīng)元被內(nèi)源性谷氨酸損害。由于機(jī)體自身存在有效的清除機(jī)制，A β的產(chǎn)生和清除在生理?xiàng)l件下能保持動(dòng)態(tài)平衡；而在AD病理過(guò)程中，A β的產(chǎn)生和清除之間失去平衡。近年來(lái)人們開(kāi)始認(rèn)識(shí)到遲發(fā)性AD與腦內(nèi)A β的清除減少密切相關(guān)。腦內(nèi)A β的清除主要包括細(xì)胞外降解、細(xì)胞內(nèi)吞和轉(zhuǎn)運(yùn)清除。(1)細(xì)胞外降解。A β的降解有多種酶的參與，它們?cè)贏 β的不同位點(diǎn)發(fā)揮作用，不同腦區(qū)(皮質(zhì)和海馬)和不同狀態(tài)(可溶性或不溶性、單體或寡聚體)的A β由不同的酶降解，任何一種降解酶的功能障礙都有可能成為引發(fā)AD的危險(xiǎn)因素。(2)細(xì)胞內(nèi)吞。A β的細(xì)胞內(nèi)吞由低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low-density lipoprotein receptor related protein, LRP)和清道夫受體(scavenger receptor, SR)介導(dǎo)。LRP 介導(dǎo)可溶性 Αβ復(fù)合物的內(nèi)吞，SR介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)纖維化Αβ的內(nèi)吞。隨年齡增長(zhǎng)，LRP的表達(dá)呈現(xiàn)進(jìn)行性下降，在AD患者尤其明顯。(3)轉(zhuǎn)運(yùn)清除。腦內(nèi)A β的轉(zhuǎn)運(yùn)清除包括血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)和經(jīng)非特異性腦間質(zhì)液泵流到腦脊液后進(jìn)入血流而清除。腦內(nèi)絕大多數(shù)的A β是經(jīng)血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)出腦，10%-15%的A β由腦間質(zhì)液泵流清除。這兩種方式都與LRP有關(guān)，LRP 基因缺失后動(dòng)物腦內(nèi)A β成倍增加。由于認(rèn)識(shí)到A β在AD發(fā)病過(guò)程中作用的基礎(chǔ)上，研究者不斷設(shè)計(jì)出各類(lèi)干擾A β病變的方法，延緩或阻止AD的進(jìn)程。A β的毒性受其數(shù)量、聚集程度和清除速度的影響， 因此可以通過(guò)減少Αβ生成、防止Αβ聚集和沉積、干預(yù)Αβ的毒性。單克隆抗體技術(shù)是抗體制備的經(jīng)典方法，該技術(shù)比較成熟，應(yīng)用廣泛。
本發(fā)明人旨在利用單克隆抗體與A β特異性結(jié)合，達(dá)到防止和排除Αβ聚集和沉積，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)A β的吞噬，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)老年性癡呆的早期診斷和治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供能用于早期檢測(cè)和治療老年性癡呆的抗體。本發(fā)明的發(fā)明原理和發(fā)明思路為利用生物合成的方法，制備全長(zhǎng)Αβ 42肽及其片段(包括N端、中間段、C端片段)免疫小鼠，用免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，得到大量雜交瘤細(xì)胞株，從中篩選出能分泌專(zhuān)一性地抗A β 42肽的單克隆抗體。本發(fā)明提供了能夠用于早期檢測(cè)和治療老年性癡呆的單克隆抗體及含有該單克隆抗體的組合物。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種具有下列可變區(qū)序列的單克隆抗體，其選自(a)重鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO 3所示氨基酸序列的單克隆抗體；(b)輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO 4所示氨基酸序列的單克隆抗體；(c)重鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO 3所示氨基酸序列，且輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO 4所示氨基酸序列的單克隆抗體；(d)重鏈可變區(qū)與SEQ ID NO :3所示氨基酸序列具有至少90%同一性的單克隆抗體；(e)輕鏈可變區(qū)與SEQ ID NO :4所示氨基酸序列具有至少90%同一性的單克隆抗體。優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的單克隆抗體重鏈可變區(qū)為SEQ ID NO 3所示氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)為SEQ ID NO :4所示氨基酸序列。優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的單克隆抗體重鏈可變區(qū)編碼基因?yàn)镾EQ ID NO=I所示核苷酸序列，輕鏈可變區(qū)編碼基因?yàn)镾EQ ID NO :2所示核苷酸序列。另一方面，本發(fā)明提供了重組表達(dá)載體，其中含有編碼上述單克隆抗體可變區(qū)的核酸序列。另一方面，本發(fā)明提供了宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞被所述的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化。另一方面，本發(fā)明提供了雜交瘤細(xì)胞系，其分泌產(chǎn)生本發(fā)明所述的單克隆抗體。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的單克隆抗體能夠高特異性和高靈敏度地診斷老年性癡呆。因此，一種用于檢測(cè)老年性癡呆的試劑，其中包括作為活性成分的單克隆抗體，所述單克隆抗體(a)重鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO 3所示氨基酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO 4所示氨基酸序列；(c)重鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO :3所示氨基酸序列，且輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO 4所示氨基酸序列；(d)重鏈可變區(qū)與SEQ ID NO 3所示氨基酸序列具有至少90%同一性；或(e)輕鏈可變區(qū)與SEQ ID NO 4所示氨基酸序列具有至少90%同一性。優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的單克隆抗體重鏈可變區(qū)為SEQ ID NO 3所示氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)為SEQ ID NO :4所示氨基酸序列。優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的單克隆抗體重鏈可變區(qū)編碼基因?yàn)镾EQ ID NO=I所示核苷酸序列，輕鏈可變區(qū)編碼基因?yàn)镾EQ ID NO :2所示核苷酸序列。本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑進(jìn)一步還包括能夠產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記物以及使用說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的單克隆抗體因?yàn)槟軌蛱禺愋越Y(jié)合Αβ 42肽，并且能顯著激活和增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)A β 42肽的吞噬作用。因此，本發(fā)明提供了一種用于早期檢測(cè)和治療老年性癡呆的藥物組合物，包括作為活性成分的本發(fā)明所述的單克隆抗體和藥用載體。另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述單克隆抗體在制備用于預(yù)防和/或治療老年性癡呆的藥物中的用途。另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述單克隆抗體在制備老年性癡呆診斷試劑中的用途。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的單克隆抗體具有高親和力，能與老年性癡呆腦組織特異性結(jié)合，而不結(jié)合正常腦組織。因此，本發(fā)明所述單克隆抗體可用于診斷老年性癡呆，特別是老年性癡呆的早期診斷。在老年性癡呆患者腦內(nèi)，小膠質(zhì)細(xì)胞除了清除凋亡壞死的細(xì)胞碎片外，還具有吞噬和清除Αβ沉積的功能。小膠質(zhì)細(xì)胞能夠有效地吞噬淀粉樣Αβ纖維和斑塊(DeWitt 等，1998，ExpNeurol，149 =329-340)。進(jìn)一步研究表明在患有AD的小鼠模型中，主動(dòng)產(chǎn)生 (Schenk 等，1999，Nature，400 :173-177)或被動(dòng)免疫(Bard 等，2000，Nat Med, 6 :916-919 ； Wilcock等，2003，JNeurosci，23 :3745-3751.)的抗Αβ抗體，都可以直接進(jìn)入大腦，并且通過(guò)增強(qiáng)吞噬作用消除A β沉積。本發(fā)明對(duì)制備的抗體進(jìn)行了 Ν9小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)，同時(shí)把與人抗體無(wú)同源性的小鼠抗幽門(mén)螺旋桿菌的抗體和小鼠抗結(jié)核桿菌的抗體設(shè)定為同型對(duì)照抗體。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明所述抗體能顯著增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)A β 42肽的吞噬作用。現(xiàn)在開(kāi)發(fā)的抗Αβ42肽線性化表位的抗體有三種類(lèi)型(WekSler，2004，Immun. Ageing，l :2.)，即針對(duì)Αβ42Ν端片段，C端片段以及中間片段的抗體。研究人員發(fā)現(xiàn)，結(jié)合 N端表位(l-7aa)的抗體既可以在體外聚合A β，也能結(jié)合患者體內(nèi)的大腦部位、血管沉積處以及未被剪切加工的前體蛋白ΑΡΡ。研究人員報(bào)導(dǎo)，這些抗體可以直接進(jìn)入大腦，結(jié)合大腦的淀粉樣沉積，溶解斑塊并且可以完成Fc依賴(lài)的細(xì)胞吞噬，進(jìn)而被小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬并降解。同樣證明，只有針對(duì)Αβ (或3_7aa)的抗體才能在體內(nèi)有效的結(jié)合A β沉積，針對(duì)其他表位的抗體雖然在體外可以有效地結(jié)合Αβ，但是在體內(nèi)無(wú)法有效的行使功能。(Bard 等，2000，Nat. Med, 6 :916-919 ；Bard 等，2003，Proc. Natl Acad. Sci. USA, 100 :2023-2028.)本發(fā)明通過(guò)抗原表位鑒定實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合N端Αβ 42(l-9aa) 線性表位，從而進(jìn)一步佐證了本發(fā)明所述抗體能增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用，溶解和清除A β沉積。因此，另一方面，本發(fā)明提供了一種用于治療老年性癡呆的藥物組合物，包括作為活性成分的本發(fā)明所述的單克隆抗體和藥用載體。
另一方面，本發(fā)明提供了一種針對(duì)老年性癡呆的早期診斷試劑，包括本發(fā)明所述的單克隆抗體、能夠產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記物以及使用說(shuō)明書(shū)。另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述單克隆抗體在制備用于治療老年性癡呆的藥物中的用途。另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述單克隆抗體在制備老年性癡呆診斷試劑中的用途。


圖1圖示的是N9小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)A β 42肽的吞噬作用。圖2圖示的是同型對(duì)照抗體(亞型IgGl)對(duì)Ν9小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用的影響圖3圖示的是抗體6C8(亞型IgGl)對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用的影響。圖4圖示的是不同濃度的42肽與0. 05ug/ml的抗體競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA結(jié)果。除另有說(shuō)明外，本申請(qǐng)中的所有科技術(shù)語(yǔ)的都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。盡管與本申請(qǐng)中描述類(lèi)似或等同的方法及材料都可用于實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明，但是下文仍還是對(duì)合適的方法和材料進(jìn)行了描述。本申請(qǐng)中引用的全部出版物、 專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利及其他參考文獻(xiàn)其全部?jī)?nèi)容在此引入作為參考。如有抵觸，包括定義，以本申請(qǐng)為準(zhǔn)。下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說(shuō)明實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體方式，而決不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不違背本發(fā)明的精神和原則的前提下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行改動(dòng)得到的技術(shù)方案都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。
實(shí)施例在本申請(qǐng)中，如無(wú)特別說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施都使用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組 DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的。這些技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員常用文獻(xiàn)中有詳細(xì)地描述，例如Sambrook等人編著的Molecular Cloning =A LaboratoryManual，^ΙΗ ^。實(shí)施例IA β 42肽及其片段的合成根據(jù)A β 42 肽的公開(kāi)序列(Genebank :ΑΒ066441. 2 ；PMID :8248178)人工合成全長(zhǎng)A β 42及其片段(包括N端片段、C端片段及中間片段)，全長(zhǎng)A β 42及其片段由吉爾生化(上海)有限公司合成。實(shí)施例2單克隆抗體的制備2.1小鼠免疫全長(zhǎng)A β 42可以直接免疫，其它片段與KLH偶聯(lián)后分別免疫小鼠，免疫方法如下初次免疫50ug抗原加等體積氟氏完全佐劑乳化后，腹腔注射小鼠，注射體積 500ul/只。兩周后，第二次免疫50ug抗原加等體積氟氏不完全佐劑乳化，腹腔注射小鼠， 注射體積500ul/只。兩周后，采小鼠尾靜脈血，離心取血清測(cè)效價(jià)(用ELISA方法檢測(cè))。 效價(jià)達(dá)一萬(wàn)以上的小鼠，在融合前三天取抗原25ug加強(qiáng)免疫，注射體積200ul/只。加強(qiáng)免疫兩周后，采小鼠尾靜脈血離心取血清測(cè)效價(jià)(用ELISA方法檢測(cè))。效價(jià)達(dá)一萬(wàn)以上的小鼠融合前三天取抗原25ug加強(qiáng)免疫，注射體積200ul/只。
2. 2細(xì)胞融合將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0細(xì)胞上清倒掉，加入RPMI1640不完全培養(yǎng)基吹打細(xì)胞。(在融合前2周培養(yǎng)SP2/0細(xì)胞，培養(yǎng)基內(nèi)含8-氮鳥(niǎo)嘌呤)計(jì)數(shù)，2X107。收集細(xì)胞， IOOOrpm, IOmin0用20毫升RPMI1640將細(xì)胞懸起放入培養(yǎng)箱。摘小鼠的眼球，用EP管收集小鼠的血。將小鼠斷頸處死，放入75%酒精浸泡五分鐘左右。先用一套剪刀，鑷子剪開(kāi)小鼠的皮毛。再用一套剪刀，鑷子取其脾臟。將小鼠脾臟先放入無(wú)篩網(wǎng)的培養(yǎng)皿中，用鑷子將其脾臟懸于培養(yǎng)皿上方，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行沖洗。再加入無(wú)血清RPMI1640于有篩網(wǎng)的培養(yǎng)皿中，用針芯碾磨。用離心管收集脾細(xì)胞，離心，1000rpm，10min。用SP2/0懸液和離心下來(lái)的脾細(xì)胞懸在一起，離心，IOOOrpm, IOmin0將管慢慢倒立，將上清輕輕的倒掉。 上清倒掉后(除去液體殘留)，在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻，置37°C水浴中預(yù)熱。用Iml吸管在1分鐘加預(yù)熱至37°C的50% PEG15001ml，邊加邊輕輕攪拌滴完后靜置aiiin。。用IOml吸管加30ml預(yù)熱至37°C的不完全培養(yǎng)基，(每隔1分鐘分別加入1ml、 3ml、5ml和10ml)。離心，900rpm，8min。將上清倒掉，用彎頭滴管取含HAT完全培養(yǎng)基加入裝有細(xì)胞的離心管中，輕輕用彎頭滴管將細(xì)胞懸起，用八道孔排槍加板，鋪10塊板，200ul/ 孔，加完板后放入5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中。第三天半定量換含HAT的完全培養(yǎng)，第七天換成含HT的完全培養(yǎng)基，第十天換成完全培養(yǎng)基，換液后第三天進(jìn)行ELISA檢測(cè)，篩選出針對(duì) A β 42肽N端的抗體。實(shí)施例3Dot blot 和 Western blot 實(shí)驗(yàn)3. IDot blot 實(shí)驗(yàn)將IOng合成的A β 42肽(吉爾生化公司合成)點(diǎn)到PVDF膜上，60°C烘干，5 %脫脂奶粉封閉lh，放入實(shí)施例2制備抗體的不同稀釋度的稀釋液中，室溫孵育lh，TBST洗3次后，與1 2000倍稀釋的HRP羊抗鼠抗體室溫孵育30min，洗滌3次加入ECL發(fā)光試劑，暗室中X光片曝光。掃描光片記錄DOT Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果.3. 2ffestern blot 實(shí)驗(yàn)3. 2. ITricine SDS PAGE 電泳由于A β 42肽只有42個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子量為4200，常規(guī)SDS-PAGE無(wú)法做出清晰的條帶。本實(shí)驗(yàn)中我們采用Tricine SDS PAGE電泳。制膠用所有試劑配制根據(jù)ShSgger &vonJagow(Anal Biochem. 1987,166 :368-79 ；Acta Farm. Bonaerense,2002, 21 (1) :57-60) 提供的方法。分離膠為16. 5% T，3% C的聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠為5% T，3% C的聚丙烯酰胺凝膠。樣品用上樣緩沖液稀釋到100 μ g/ml，每個(gè)樣品槽加樣10微升，20mA恒流約 30min，樣品到達(dá)分離膠時(shí)，將電流調(diào)至40mA，直至樣品離膠的下邊沿Icm左右，停止電泳。3. 2. 2轉(zhuǎn)膜，與抗體孵育及發(fā)光本實(shí)驗(yàn)室采用半干轉(zhuǎn)移法，將A β 42肽轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膠、濾紙、PVDF膜分別在電極緩沖液中浸泡后，按濾紙，膠，PVDF膜，濾紙的順序鋪到轉(zhuǎn)移電泳槽中，1.2mA/ Cm2PVDF膜的比例調(diào)節(jié)電流進(jìn)行半干轉(zhuǎn)移，池后，停止轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜放入5 %脫脂奶粉溶液中室溫封閉lh。與抗體孵育lh，洗滌3次后與1 2000倍稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體孵育30min，洗滌，加ECL發(fā)光試劑，暗室中X光片曝光。掃描光片記錄flfestern Blot結(jié)果。實(shí)施例4細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)4. IFITC 標(biāo)記 A β 42 肽
A β 42肽溶于DMS0，然后用碳酸鹽緩沖液(CBS ρΗ 9. 6)稀釋到2. 5mg/ml。按每毫克A β 42肽60微克FITC的比例加入FITC，室溫避光條件下?lián)u動(dòng)池。用含有NaN3的Tris 緩沖液透析過(guò)夜，中間換4次透析液。4. 2細(xì)胞培養(yǎng)將Ν9小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)于含IOuM β -巰基乙醇、5% FBS的IMEM培養(yǎng)基(購(gòu)自GIBC0)中，待細(xì)胞生長(zhǎng)到80%時(shí)，胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 Ν9小膠質(zhì)細(xì)胞，消化后加入到M孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，每孔1 X IO5個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)胞貼壁后進(jìn)行試驗(yàn)。4. 3Ν9小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)A β 42肽的吞噬作用用1 μ g/ml的FITC標(biāo)記的A β 42肽單獨(dú)與Ν9小膠質(zhì)細(xì)胞孵育，37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min。收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)N9小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度結(jié)果，并分別與不加A β 42肽的Ν9小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行比較，計(jì)算出熒光陽(yáng)性細(xì)胞百分比，從而來(lái)確定Ν9小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)A β 42肽的吞噬作用。檢測(cè)結(jié)果顯示(如圖1) :Αβ 42肽在1 μ g/ml時(shí)就可以引起Ν9小膠質(zhì)細(xì)胞1.79% 的吞噬作用(與空白對(duì)照組比較)，因而在后續(xù)的試驗(yàn)中A β 42肽的濃度都是1 μ g/1，并且用1 μ g/mlFITC標(biāo)記的Αβ 42肽單獨(dú)作用Ν9小膠質(zhì)細(xì)胞作為陰性對(duì)照。 4. 4同型對(duì)照抗體對(duì)Ν9小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用的影響本實(shí)驗(yàn)中，為了排除無(wú)關(guān)抗體對(duì)Ν9小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用存在影響的可能性，設(shè)計(jì)了小鼠抗結(jié)核桿菌TB抗體(亞型分別為IgGl)作為同型對(duì)照抗體，同型對(duì)照抗體與人體內(nèi)的抗體無(wú)同源性，對(duì)照抗體與FITC標(biāo)記的Αβ 42肽共同孵育Ih后作用于Ν9小膠質(zhì)細(xì)胞。用上述同型對(duì)照抗體與1 μ g/ml A β 42共同孵育Ih后，對(duì)Ν9小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用的影響。結(jié)果顯示(如圖2)同型對(duì)照抗體小鼠抗結(jié)核桿菌TB抗體在10 μ g/ml以下時(shí)對(duì) N9小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用的影響不顯著。由此可見(jiàn)，無(wú)關(guān)抗體濃度低于10 μ g/ml時(shí)(與陰性對(duì)照組比較)，對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用影響不顯著。4. 5抗體株6C8對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用的影響將1 μ g/ml的FITC標(biāo)記的A β 42肽分別與5、10 μ g/ml抗體株6C8分別混合后， 37°C孵育lh。加入到培養(yǎng)N9小膠質(zhì)細(xì)胞的M孔板中，37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min。 收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)試抗體孵育后，對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用的影響。結(jié)果顯示，抗體6C8與Αβ 42肽共同孵育組，Ν9小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬Aβ 42肽的能力比單純的Αβ42肽組提高了 13.3% (如圖3)。這說(shuō)明抗體株6C8可以顯著促進(jìn)Ν9小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)A β 42的吞噬作用。4. 7流式細(xì)胞儀檢測(cè)0.05%胰蛋白酶消化后收集各組細(xì)胞，BSA FBS洗滌兩次后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)， 以熒光強(qiáng)度為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，并與陰性對(duì)照組比較，計(jì)算出陽(yáng)性細(xì)胞百分比。 每次試驗(yàn)都設(shè)只加Αβ 42肽的陰性對(duì)照組和不加42肽及其抗體的空白對(duì)照組。為了排除非特異性結(jié)合，在實(shí)驗(yàn)中設(shè)有無(wú)關(guān)的小鼠抗結(jié)核桿菌TB抗體作為同型對(duì)照。實(shí)施例5抗體親和力實(shí)驗(yàn)
將Αβ42肽稀釋至100ng/ml，酶標(biāo)板每孔加入lOOul，4°C包被過(guò)夜，PBST洗滌3 次，37°C 5% BSA封閉2h，PBST洗滌3次，晾干備用。Aβ 42肽從lug/ml開(kāi)始倍比稀釋?zhuān)缓蠹尤虢K濃度為0. 05ug/ml的單克隆抗體 6C8，混勻，4°C孵育過(guò)夜。IOOul混合液加入包被好的酶標(biāo)板條，ELISA方法檢測(cè)0D495。按公式KJ (A0-A) = 1+1(/ ，其中Atl為無(wú)A β 42肽時(shí)測(cè)的OD值，A為不同濃度A β 42肽時(shí)測(cè)的 OD值，K為親和力常數(shù)，為A β 42肽濃度，分別求出K值，計(jì)算其平均值為親和力常數(shù)。不同濃度的Aβ 42肽與0. 05ug/ml的抗體競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA結(jié)果所示(如圖4)， A β 42肽在0. 03125ug/ml時(shí)就明顯抑制抗體與包被抗原的結(jié)合。通過(guò)計(jì)算，單克隆抗體6C8的親和力常數(shù)為K6C8 = 0. 018ug/ml。實(shí)施例6抗體序列測(cè)定對(duì)單克隆抗體6C8的進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果為其重鏈可變區(qū)(VH)的氨基酸序列為 SED IDNO :3，輕鏈可變區(qū)(VL)氨基酸序列為SED ID NO 4 ；重鏈可變區(qū)(VH)編碼基因的核苷酸序列如SED ID NO 1所示，輕鏈可變區(qū)(VL)編碼基因的核苷酸序列如SEDID NO :2。實(shí)施例7免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)中，以老年癡呆癥小鼠模型的腦組織進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，并以正常小鼠腦組織作為陰性對(duì)照組。將組織切成4-6um厚度的切片，放于多聚_L_賴(lài)氨酸封閉的或者超霜凍的顯微載玻片上；在冷風(fēng)干燥器里干燥至少30min ；干燥過(guò)的組織塊立即使用，或者置于密封盒子里于-20°C或_80°C保存。將干燥過(guò)的組織塊置于含有4%多聚甲醛、0.5%葡萄糖的PBS中固定lOmin， PBS-S中漂洗一次。在H2O2A). 02% NaN3的PBS-S中浸泡30min，抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，用PBS-S漂洗玻片。在封閉液中浸泡IOmin以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)；將多余的封閉液吸掉，加入2-5μ g/ml的稀釋于PBS-BSA-S的一抗，4°C孵育過(guò)夜；用PBS-S漂洗3次，每次5min ；吸干多余的PBS-S，加入2-5μ g/ml HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育30_60min ；用PBS-S 漂洗3次，每次5min ；加入新配制的二氨基聯(lián)苯胺3-5min，在一抗結(jié)合部位會(huì)出現(xiàn)棕黃色沉淀。流水沖洗5min，蘇木紅染液染色I(xiàn)min ；分別用70，96，100%的乙醇進(jìn)行脫水，二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片、鏡檢。結(jié)果顯示抗體6C8與正常腦組織均無(wú)非特異性結(jié)合，而與小鼠老年癡呆模型腦組織的斑點(diǎn)特異的結(jié)合。實(shí)施例8抗原表位鑒定分別用人工合成的多肽A β 42的3種片段，CV-9 (32_40aa)、CA-9 (34_42aa)和 DC-9 (l-9aa)，包被酶標(biāo)板，常規(guī)ELISA方法測(cè)抗體6C8的0D，檢測(cè)抗體6C8與3種多肽片段結(jié)合情況，從而決定抗體的抗原表位?？贵w6C8與不同肽段結(jié)合情況顯示該株抗體與DC-9結(jié)合，而與其它肽段不結(jié)合， 說(shuō)明這種抗體抗原表位是A β 42肽的1-9個(gè)氨基酸殘基，即是針對(duì)A β 42肽N端抗體。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)老年性癡呆的試劑，其中包括作為活性成分的單克隆抗體，所述單克隆抗體(a)重鏈可變區(qū)包括SEQID NO :3所示氨基酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)包括SEQID NO :4所示氨基酸序列；(c)重鏈可變區(qū)包括SEQID NO :3所示氨基酸序列，且輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO 4 所示氨基酸序列；(d)重鏈可變區(qū)與SEQID NO 3所示氨基酸序列具有至少90%同一性；或(e)輕鏈可變區(qū)與SEQID NO :4所示氨基酸序列具有至少90%同一性。
2.權(quán)利要求1所述的試劑，其中所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQID NO :3，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO :4。
3.權(quán)利要求2所述的試劑，其中編碼所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的核苷酸序列為 SEQ IDNO :1，編碼所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的核苷酸序列為SEQ ID NO :2。
4.權(quán)利要求1所述的試劑，其中進(jìn)一步還包括能夠產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記物以及使用說(shuō)明書(shū)。
5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)中所述的單克隆抗體。
6.一種雜交瘤細(xì)胞，其分泌產(chǎn)生權(quán)利要求4中所述的單克隆抗體。
7.一種治療老年性癡呆的藥物組合物，其中包括權(quán)利要求4中所述的單克隆抗體和藥用載體。
8.權(quán)利要求4所述的單克隆抗體在制備老年性癡呆早期診斷試劑中的用途。
9.權(quán)利要求4所述的單克隆抗體在制備用于治療老年性癡呆的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種抗老年性癡呆抗體及其序列和制備方法。實(shí)驗(yàn)證明所述抗體能夠特異性檢測(cè)老年性癡呆，并能顯著促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)纖維和斑塊的吞噬，因此本發(fā)明所述抗體能夠用于老年性癡呆的早期診斷和治療。
文檔編號(hào)C12N5/20GK102360015SQ20111027747
公開(kāi)日2012年2月22日 申請(qǐng)日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日
發(fā)明者葉慶煒 申請(qǐng)人:徐州逸仕生物技術(shù)有限公司