專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)水產(chǎn)品中四種常見(jiàn)致病菌的試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可同時(shí)快速檢測(cè)水產(chǎn)品中沙門(mén)氏菌(Salmonella spp.)、志賀氏菌(Shigella spp.)、金黃色葡萄球菌(Vibrio, parahaemolyticus)和副溶血性弧菌 (Staphylococcus aureus)的多重PCR試劑盒和改良型檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近幾年我國(guó)水產(chǎn)品消費(fèi)量不斷上升，而水產(chǎn)品在養(yǎng)殖、捕撈、儲(chǔ)藏、加工、運(yùn)輸、銷(xiāo)售等環(huán)節(jié)容易受到病原微生物的污染，因此病原微生物檢測(cè)是水產(chǎn)品及其加工品衛(wèi)生檢測(cè)中的一項(xiàng)重要工作，其關(guān)系到消費(fèi)者的健康及生命安全。其中沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、 副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌被認(rèn)為是重要的污染水產(chǎn)品的致病菌，已引起各個(gè)國(guó)家衛(wèi)生檢測(cè)部門(mén)的廣泛重視。我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)DB11/519-2008《生食水產(chǎn)品衛(wèi)生要求》規(guī)定沙門(mén)氏菌、 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、志賀氏菌等不得檢出。嚴(yán)格的食品微生物檢驗(yàn)是保障食品安全的重要環(huán)節(jié)。然而，傳統(tǒng)檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，一般檢測(cè)周期在5-10天，檢測(cè)程序繁瑣，工作量大，很難適應(yīng)現(xiàn)代化食品安全快速檢測(cè)的需要，因此亟需建立一種操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確、靈敏度和特異性都較高的現(xiàn)代化檢測(cè)方法。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展為病原微生物快速檢測(cè)提供了良好的技術(shù)平臺(tái)，如基因探針、NASBA(核酸序列依賴(lài)性擴(kuò)增法)、ATP生物發(fā)光法以及PCR等技術(shù)已逐漸被研究并完善以用于病原微生物的檢測(cè)當(dāng)中。其中多重PCROmiltiplex-PCR)技術(shù)不同于傳統(tǒng)PCR 技術(shù)只能檢測(cè)單一靶基因，其是通過(guò)在同一 PCR反應(yīng)體系里加入多對(duì)特征引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)目標(biāo)核酸片段的PCR反應(yīng)，可用于多種病原微生物的同時(shí)快速檢測(cè)或鑒定。Germini 等根據(jù)沙門(mén)氏菌的irwA基因，單核細(xì)胞增生李斯特菌的prfA基因，大腸桿菌0157:H7的 eaeA基因以及細(xì)菌的16S rRNA基因設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用多重PCR技術(shù)對(duì)全蛋液進(jìn)行測(cè)定，特異性地檢出上述菌種，靈敏度高，檢測(cè)效果穩(wěn)定。國(guó)內(nèi)陳偉等對(duì)肉品中的沙門(mén)氏菌、志賀氏菌及大腸桿菌0157:H7三種致病菌建立了多重PCR檢測(cè)體系，檢測(cè)靈敏度可達(dá)lCFU/ml，可在 24h內(nèi)完成檢測(cè)工作，并集成了快速檢測(cè)試劑盒。然而，目前對(duì)水產(chǎn)品中常見(jiàn)的四種致病菌沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的同時(shí)共增菌方法及多重PCR快速檢測(cè)試劑盒未有報(bào)道和公開(kāi)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于同時(shí)檢測(cè)水產(chǎn)品中沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌四種常見(jiàn)致病菌的多重PCR快速檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，可以有效的節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率。檢測(cè)水產(chǎn)品中四種常見(jiàn)致病菌的試劑盒，包括Mg2+、dNTP、Taq酶、PCR Buffer、引物、滅菌雙蒸水，其特征在于，所述引物由以下序列組成沙門(mén)氏菌引物上游序列5，-GGT CGT CGT TGG GAC TGA TTG G-3，，下游序列 5， -CCG TGG CAT GTC TGA GCA CTT C-3'；
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志賀氏菌引物上游序列5，-GCT CGA AAC GGG CTG TGC TAA TG-3，，下游序列 5， -ACG GTA TCG GAA AGG CGG TCAA-3'；金黃色葡萄球菌引物上游序列5’-AAC GGC AAT ACG CAA AGA GG-3’、下游序列 5' -TAT ACG CTA AGC CAC GTC CAT A-3'；副溶血性弧菌引物上游序列5，-CTGATA ACA ATG ACG CCT CTG CTA AT-3，，下游序歹丨J :5，-TCT GAT ACT CAC CAA TCT GAC GGA ACT-3，。本發(fā)明根據(jù)金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因nuc、沙門(mén)氏菌的侵襲蛋白基因 invA、志賀氏菌的侵染性質(zhì)粒抗原H基因ipaH、副溶血性弧菌的毒力表達(dá)調(diào)控基因toxR作為特征靶基因設(shè)計(jì)出4對(duì)特異性引物(見(jiàn)表1)各引物針對(duì)相應(yīng)致病菌高度種內(nèi)保守，種間特異基因或者毒力相關(guān)基因設(shè)計(jì)。擴(kuò)增后片段長(zhǎng)度大小各異，可通過(guò)電泳進(jìn)行分開(kāi)辨別。表1四種目標(biāo)菌的引物序列和擴(kuò)增PCR產(chǎn)物大小
權(quán)利要求
1.檢測(cè)水產(chǎn)品中四種常見(jiàn)致病菌的試劑盒，包括Mg2+、dNTP、Taq酶、PCRBuffer、引物、 滅菌雙蒸水，其特征在于，所述引物由以下序列組成沙門(mén)氏菌引物上游序列5’ -GGTCGTCGT TGGGACTGATTGG-3’，下游序列 5， -CCGTGGCATGTCTGAGCACTTC-3’ ；志賀氏菌引物上游序列5’ -GCTCGAAACGGGCTGTGCTAATG-3’，下游序列 5， -ACGGTATCGGAAAGGCGGTCA A-3’ ；金黃色葡萄球菌引物上游序列5’ -AACGGCAATACGCAA AGAGG-3’、下游序列 5’ -TATACGCTAAGCCACGTCCATA-3’ ；副溶血性弧菌引物上游序列5，-CTGATAACAATGACGCCTCTGCTA AT-3，，下游序列5，_TC TGATACTCACCAATCTGACGGAACT-3’。
2.檢測(cè)水產(chǎn)品中四種常見(jiàn)致病菌的方法，其特征在于包括以下步驟a)樣品增菌培養(yǎng)配制選擇性增菌培養(yǎng)液，各組分的濃度為緩沖蛋白胨水20g/L、 魚(yú)蛋白胨12 g/L、膽鹽3號(hào)3 g/L、檸檬酸鈉1.5 g/L、氯化鋰1 g/L、亞碲酸鉀1. 2 mg/L、氯化鈉15 g/L、葡萄糖2 g/L、甘露醇1 g/L、丙酮酸鈉4 g/L，調(diào)節(jié)pH值為7. 8 ；取水產(chǎn)品樣品加入選擇性增菌培養(yǎng)液中，均質(zhì)1分鐘，于恒溫振蕩器中37 150 rpm培養(yǎng)6 h；b)提取菌液DNA;c)PCR擴(kuò)增使用權(quán)利要求1所述的試劑盒對(duì)菌液DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)條件如下 采用冷啟動(dòng)，94°C預(yù)變性4 min，變性94°C 30 s，退火58. 1°C 1 min，延伸72°C 1 min，30 個(gè)循環(huán)，終延伸72 °C 5 min ；d)將擴(kuò)增產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)水產(chǎn)品中四種常見(jiàn)致病菌的試劑盒，包括Mg2+、dNTP、Taq酶、PCRBuffer、引物、滅菌雙蒸水。本發(fā)明還提供了檢測(cè)水產(chǎn)品中四種常見(jiàn)致病菌的方法，包括樣品增菌培養(yǎng)、提取菌液DNA、PCR擴(kuò)增、將擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)等步驟。該方法在常規(guī)多重PCR檢測(cè)技術(shù)上，對(duì)該檢測(cè)方法從前增菌到PCR擴(kuò)增等步驟進(jìn)行了改良和優(yōu)化，整合后的多重PCR快速檢測(cè)試劑盒配置便捷，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，檢測(cè)結(jié)果特異性強(qiáng)，靈敏度高。
文檔編號(hào)C12Q1/14GK102337333SQ20111027781
公開(kāi)日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日
發(fā)明者勵(lì)建榮, 朱軍莉, 翁思聰 申請(qǐng)人:浙江工商大學(xué)