專利名稱：一種水稻胚乳特異性啟動子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物信息學(xué)、生物技術(shù)和植物基因工程領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明提供了一種水稻胚乳特異性啟動子。
背景技術(shù)：
水稻是我國最重要的糧食作物，人們?nèi)粘Ｊ秤玫拇竺?加工后的精米)即為水稻的胚乳，胚乳的形成和發(fā)育直接影響著水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)，同時胚乳也是一個優(yōu)良的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。通過生物技術(shù)和基因工程策略可以提高種子中稀有蛋白質(zhì)、維生素和必需氨基酸的含量，提高稻米的營養(yǎng)價值和改善稻米的品質(zhì)，從而培育出品質(zhì)更加優(yōu)良的稻米。如何實現(xiàn)外源基因在轉(zhuǎn)基因水稻中定點、定時、高效表達(dá)一直是轉(zhuǎn)基因育種工作者追求的目標(biāo)。選用具有組織特異性、表達(dá)水平高的啟動子是實現(xiàn)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物特定組織中高效表達(dá)的關(guān)鍵。目前，國內(nèi)外針對組織特異性啟動子的研究已獲得一些理想的啟動子，但這類啟動子的數(shù)量依然有限，尚不能滿足植物基因工程多方面應(yīng)用的需求。隨著基因組學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用生物信息學(xué)的研究方法分析生物信息化數(shù)據(jù)，利用水稻數(shù)據(jù)庫提供的功能基因的注釋和表達(dá)模式的相關(guān)信息，查詢并篩選出水稻不同組織中特異性表達(dá)的功能基因以及一些對生長代謝調(diào)控起關(guān)鍵作用的基因，進(jìn)一步設(shè)計實驗進(jìn)行基因表達(dá)模式驗證和調(diào)控機(jī)理分析，將是一條高效的篩選組織特異性表達(dá)啟動子的新途徑。篩選和分離一些具有組織專一性、高表達(dá)水平的啟動子以及分析有關(guān)的重要特異性調(diào)控元件功能，在基因工程研究中有著廣泛的用途。胚乳是糧食作物營養(yǎng)的最重要組成部分，因此分離胚乳特異性強(qiáng)表達(dá)啟動子對植物品質(zhì)的改良具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種水稻胚乳特異性啟動子。該啟動子具有啟動目的基因在轉(zhuǎn)基因作物的胚乳中特異性表達(dá)的功能。本發(fā)明所提供的水稻胚乳特異性啟動子，為下述DNA序列之一
(1)具有SEQID NO. 1所示的DNA序列；
(2)與SEQID NO. 1有80 %以上同源性，且能夠控制目的基因在植物胚乳中特異性表達(dá)的DNA序列；
(3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可以與SEQID NO. 1所示的DNA序列雜交，且能控制目的基因在植物胚乳中特異性表達(dá)的DNA序列；
(4)在SEQID NO. 1所示的序列基礎(chǔ)上進(jìn)行5，端和3，端分段缺失的DNA序列；
(5)在SEQID NO. 1所示的序列基礎(chǔ)上進(jìn)行單核苷酸或寡核苷酸插入、缺失或替換所產(chǎn)生的DNA序列。將具有SEQ ID NO. 1所示DNA序列的水稻hieW基因啟動子命名為floated-凡上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0. IX SSC或0. 1 XSSPE,0. 1% SDS溶液，65°C下進(jìn)行雜交。本發(fā)明的水稻胚乳特異性啟動子來源于水稻Iatexl基因的上游序列，所述水稻 Iatexl基因，具有如SEQ ID N0. 2所示的DNA序列。本發(fā)明的還提供了一種從水稻中克隆胚乳特異性啟動子的方法。該方法首先通過解讀生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和水稻功能基因組數(shù)據(jù)庫，從中篩選在胚乳特異性表達(dá)的候選基因；然后通過半定量RT-PCR鑒定候選基因時空表達(dá)，確定候選基因在胚乳特異性表達(dá)的行為；最后通過PCR擴(kuò)增，克隆胚乳特異性表達(dá)基因的上游啟動子片段，并通過DNA重組構(gòu)建胚乳特異性啟動子的表達(dá)載體，培育轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行啟動子的功能驗證。本發(fā)明通過轉(zhuǎn)基因水稻分析的實驗證實Ashi^ri+啟動子可控制目的基因特異性地在水稻的胚乳組織中表達(dá)，在其它組織部位則基本不表達(dá)。本發(fā)明提供的Oslatexl-P 啟動子可用于基因工程改良稻米胚乳相關(guān)性狀。


圖1，水稻植株中基因的表達(dá)模式，通過半定量RT-PCR分析，以Actin作為內(nèi)參基因；其中，R，根；S，莖；L，葉；Ε，胚；ΕΝ1，胚乳(DAF15);EN2，成熟胚乳(DAF25);DAF (Day After Flower)指開花后天數(shù)；CK為陰性對照。圖2，Real-time PCR分析10個胚乳基因在水稻胚乳發(fā)育不同時期的差異表達(dá)； 其中，DAF指開花后天數(shù)；橫坐標(biāo)上DAF5、DAFlO, DAF25分別代表開花后5、10、25天的胚乳；柱形圖上方阿拉伯?dāng)?shù)字表示不同的水稻基因，I, GluDl ；2，GluC-, ,, GluB4 ；4，GluBl ；5， GluA2 ^,Prolamin-13 ；7, SS~1 ；8, Latex-I ·’％Ρ450_1 -,\^)，LTPL29。圖3，Iatexl基因的定時定量表達(dá)與水稻胚乳灌漿速率的內(nèi)在關(guān)聯(lián)；其中，A為 Iatexl基因在水稻種子胚乳灌漿過程中定時定量表達(dá)水平的測定；B為水稻胚乳灌漿速率的測定；橫坐標(biāo)上 DAF1-2、DAF3、DAF5、DAF10、DAF15、DAF20、DAF25 分別代表開花后 1_2、3、 5、10、15、20、25 天的胚乳。圖4，pCXGUS-P-latexl植物表達(dá)載體構(gòu)建示意圖；其中，A為T-DNA的結(jié)構(gòu)示意圖；B為pCXGUS-P-latexl表達(dá)載體圖譜。圖5，轉(zhuǎn)pCXGUS-P-latexl載體的水稻TO代植株⑶S組織化學(xué)染色圖；其中，A為轉(zhuǎn)基因植株的⑶S組織化學(xué)染色圖，1-5分別為轉(zhuǎn)基因植株根、莖、葉、穎花、種子；B為非轉(zhuǎn)基因植株的⑶S組織化學(xué)染色圖，6-10分別為非轉(zhuǎn)基因植株根、莖、葉、穎花、種子。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。以下實施例用于說明本發(fā)明而不限制本發(fā)明的范圍。實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例1通過數(shù)據(jù)庫檢索篩選水稻胚乳特異性表達(dá)候選基因
已有的研究表明，胚乳特異性表達(dá)基因主要集中在種子貯藏蛋白類基因、淀粉合成調(diào)控相關(guān)的酶基因、種子過敏蛋白及生理代謝調(diào)控相關(guān)基因等。通過綜合查詢幾個主要的植物及水稻基因組數(shù)據(jù)庫 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)、EMBL (http://www. ebi. ac.uk/emb1)>Gramene (http://www. gramene. org)禾口 RAP—DB (http://rapdb. dna. affrc. go. jp)，選擇了 50個水稻種子發(fā)育相關(guān)的基因，包括種子貯藏蛋白基因、淀粉合成酶基因、 種子代謝調(diào)控相關(guān)基因等。進(jìn)一步參考種子基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫kedGeneDB (http//sgdb. cbi. pku. edu. cn)，選擇在表達(dá)譜分析中只在胚乳組織表達(dá)，而在其它組織部位基本不表達(dá)的基因，確定了其中之一的編碼水稻膠乳蛋白的基因0s06g0528300作為胚乳特異性表達(dá)的基因，命名為水稻基因，具有如SEQ ID NO. 2所示的DNA序列。實施例2水稻不同組織總RNA的提取
用TRNzol Total RNA Reagent試劑盒(TIANGEN生物技術(shù)公司)分別提取粳稻日本晴根、莖、葉、穎花、種子、開花授粉后10天、25天的胚和胚乳的總RNA，具體的實驗步驟參照試劑盒說明書。為了去除總RNA中可能存在的基因組DNA的污染，對所提取的總RNA全部進(jìn)行DNaseI (TAKARA公司)消化處理。經(jīng)DNaseI (RNA-free) 37 °C處理Ih后，重復(fù)RNA 的抽提操作以獲得高純度總RNA。然后再用i^rmentaS#K1622試劑盒(Fermentas公司)對所提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT)，獲得cDNA第一鏈，用于RT-PCR實驗。半定量RT-PCR鑒定特異基因的空間表達(dá)
以實施例2獲得的cDNA為模板，日本晴基因組DNA和ddH20分別作陽性對照和陰性對照的模板，在相同的條件下同時擴(kuò)增內(nèi)參A -Actin基因，每次取5 μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(25 UL體系)，在1.5 %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離檢測。根據(jù)產(chǎn)物的條帶強(qiáng)弱調(diào)整cDNA模板的加入量，進(jìn)行兩三次擴(kuò)增調(diào)整后，獲得亮度一致的β-Actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶，從而可保證25 μ L體系中加入的各cDNA模板的濃度一致。PCR反應(yīng)體系為25 PL，包括反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μ L，2 X Reaction Mix 12.5yL (含 MgCl2、dNTP 等)，10μΜ 的 A-Jcii/ 基因引物 Actin F 和 Actin R各 1 yL，0.5U Golden DNA Polymerase (2. 5U/12. 5 μ L)，ddH20 補(bǔ)齊至 25 μ L。內(nèi)參 Jcii/ 基因的 PCR 反應(yīng)條件為: 940C 5min,94°C 30S,58°C 30S，72°C 30S，共 27 個循環(huán)；最后 72°C延伸 8 min。內(nèi)參基因引物為 Actin F: 5’-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3，，Actin R: 5’-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3，， 產(chǎn)物擴(kuò)增大小為335 bp。以內(nèi)參A擴(kuò)增亮度一致的各cDNA模板的加入量為標(biāo)準(zhǔn)，用相同的模板量擴(kuò)增候選的水稻hteW基因，每個PCR擴(kuò)增設(shè)定三個平行反應(yīng)。實施例的結(jié)果表明，hteW 基因在水稻胚乳組織中特異性表達(dá)，其它部位則未檢測到基因的表達(dá)(附圖1)。實施例4 realtime-PCR進(jìn)一步鑒定特異基因的時空表達(dá)
進(jìn)一步采樣收集水稻根、莖、葉、穎花，同時采集種子胚乳灌漿過程中各時期的樣品， 即收集水稻開花授粉后3天、5天、10天、15天、20天、25天的種子，于低溫下迅速挑胚處理獲得各時期的胚乳樣品，應(yīng)用RNAsimple Total RNA Kit試劑盒(TIANGEN生物公司)分別提取總 RNA。各總 RNA 經(jīng) DnaseI (RNA-free)處理后，再用 RNAclean Kit 試劑盒(TIANGEN 生物公司)純化處理可獲得高質(zhì)量的總RNA，再用i^ermentas#K1622試劑盒(Fermentas公司)對所提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄可獲得cDNA第一鏈。實驗中以各樣品cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR實驗中的相對定量分析。以A-Iii/ 為內(nèi)參基因，采用hteW基因的定量PCR特異引物Uatex-I Y2·. 5‘ -GGAGGTCAATGTTCAAAGCG-3‘,latexl R2: 5，-TGGACGGTCAGGATGGATG-3，)進(jìn)行實時熒光定量PCR分析。熒光定量PCR反應(yīng)體系為25 μ L，包括反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)cDNA 1 μ L，SYBR Premix Ex Taq (TAKARA 公司)(2Χ)12·5 μ L，基因特異引物 F2 和 R2 (10 μ Μ)各 1 μ L，ROX Reference Dye II (TAKARA 公司)(50Χ)0·5 μ L，ddH20 補(bǔ)足體積至 25 μ L。其擴(kuò)增程序如下95 V 30S, 950C 5S, 60°C 34S，讀板，共40個循環(huán)；最后是熔解曲線程序95 V 15S, 600C Imin, 95 V 15S，60°C 15S。每個樣本均需要進(jìn)行三次平行重復(fù)，結(jié)果取其平均值。在相同的條件下，每個反應(yīng)板中不同的模板都需要在相同條件下同時擴(kuò)增內(nèi)參基因和目標(biāo)候選基因，并設(shè)定其中一個cDNA樣品作為參照樣品。結(jié)果分析時，定量PCR分析軟件會自動設(shè)定熒光閾值，確定該熒光閾值下特定的循環(huán)數(shù)Ct值。然后根據(jù)AACt法(平均相對含量=2-^ ΔΔα，Δ Ct=Ct精確計算各基因的相對表達(dá)量。實施例結(jié)果表明，基因在開花后10-25天的水稻胚乳組織中高效表達(dá)(附圖2)。實施例5水稻胚乳灌漿速率的測定
種植日本晴水稻于省農(nóng)科院舊實驗樓的一小塊試驗基地，記錄播種日期，進(jìn)行正常田間管理，待到接近抽穗期時，選取長勢優(yōu)良的水稻植株掛牌編號。然后每天上午8:30-9:30 去實時觀察各掛牌植株的抽穗和開花情況，對當(dāng)天開花的小穗準(zhǔn)確記錄好開花日期并做好標(biāo)記。在實時觀察和標(biāo)記植株抽穗期間，隨機(jī)準(zhǔn)確收集水稻胚乳灌漿的不同時期(按開花后的天數(shù)推移來計算)的新鮮種子，裝袋并做好標(biāo)記，每袋20-50粒種子左右，先后共收集6個時期的種子(開花授粉后3天、5天、10天、15天、20天、25天的種子)。對每天新鮮收集的種子，于精密天平上稱重(除去種子袋的重量)，在各種子袋上分別記錄好總鮮重，并準(zhǔn)確計數(shù)出每袋種子的數(shù)量。然后將已稱過鮮重的種子裝回相應(yīng)的種子袋，封裝好袋口后于45°C烘箱中烘烤30小時左右。最后取出烘干的種子，在相同的精密天平上再次稱量其總干重并做好記錄。實施例結(jié)果表明，基因在開花后在表達(dá)水平變化模式與水稻胚乳灌漿速率的變化模式呈正相關(guān)(附圖3)。實施例6啟動子的克隆
以基因組DNA為模板，根據(jù)基因上游約2 1Λ的啟動子序列，基于其胚乳特異性調(diào)控元件的位置分布特征，設(shè)計出特異性引物，用TaKaRa LA Taq酶(TAKARA公司)(5 U/ μ L)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，并用DNA凝膠回收試劑盒回收與擴(kuò)增產(chǎn)物相應(yīng)大小的DNA條帶，獲得Iatex-I基因5’端啟動子片段。PCR反應(yīng)體系為50 μ L， 包括 TaKaRa LA Taq 酶(5 U/μ L) 0. 5 μ L, 2XLA PCR Buffer II 5 μ L (含 MgCl2), dNTP (2. 5 mM) 8 yL，啟動子擴(kuò)增特異性引物F/R (10 μ Μ)各1 μ L，日本晴基因組DNA模板 2 μ L，ddH20補(bǔ)齊至50 μ L，擴(kuò)增平行設(shè)3次重復(fù)，其PCR擴(kuò)增程序為94 V，5min ； 94°C Imin，630C 40S，72°C 2min，共32個循環(huán)；最后72°C延伸8 min。啟動子擴(kuò)增片段引物序列如下 F: 5，-CACGGGCTAATAACTAACCTACGC-3，，R: 5，- TCTCCGATACACAGTAGCAGCAG-3，。實施例7構(gòu)建啟動子與Gtt？基因融合表達(dá)載體
利用pCXGUS-P (NCBI中注冊號為FJ905224)進(jìn)行表達(dá)載體構(gòu)建。該載體質(zhì)粒是以雙鏈環(huán)狀形式存在的，鑒于其構(gòu)建過程和特有的載體設(shè)計特征，需要首先選用特定的限制性內(nèi)切酶對獲得的載體質(zhì)粒pCXGUS-P進(jìn)行雙位點單酶切，然后通過DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行酶切片段的瓊脂糖凝膠回收，所獲得的載體骨架大片段為一個線性的T載體，能夠直接用于連接實施例6中通過PCR獲得的Oslatexl啟動子片段。Xcml酶酶切載體質(zhì)粒pCXGUS-P的體系為50 μ L 載體質(zhì)粒pCXGUS-P 6 μ L (35 ng/ μ V),Xcm\ 內(nèi)切酶 1 μ L，10XNE Buffer 5 μ L, ddH20 補(bǔ)足體積至 50 μ L,酶切體系置于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)酶切2小時左右，然后加入5 μ L IOXloading Buffer終止酶切反應(yīng)，并電泳檢測酶切效果和DNA凝膠回收載體骨架大片段。通過TA克隆策略把PCR獲得的floated啟動子片段克隆到經(jīng)過酶切的 PCXGUS-P線性T載體。所得到的重組質(zhì)粒經(jīng)過純化后，送TAKARA公司測序；獲得測序結(jié)果后應(yīng)用Blast分析程序進(jìn)行比對分析。實施例的結(jié)果表明，所克隆的啟動子片段具有SEQ ID NO. 1序列，所構(gòu)建載體如附圖4所示。實施例8轉(zhuǎn)基因植株的⑶S活性檢測
采用電激法將pCXGUS-P-latexl轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株LBA4404，再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染法進(jìn)行水稻遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株。分別取陽性轉(zhuǎn)基因植株和對照的野生型日本晴植株的根、莖、葉、穎花、種子樣品， 種子進(jìn)行縱切處理，保留完整的胚和胚乳，按Jefferson (1987)的方法，將待測樣品侵入 ⑶S染色液中，37°C保溫數(shù)小時至過夜，然后對葉片、莖等綠色組織用75%乙醇脫色處理后， 再觀察并拍照記錄GUS的染色結(jié)果。實施例的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株中的根、莖、葉、穎花、胚等組織部位均無GUS染色檢出，而其胚乳則能明顯檢測到GUS染色(附圖5)，非轉(zhuǎn)基因植株的所有組織部位則均無 GUS染色檢出，說明Oslatexl啟動子能驅(qū)動目的基因在水稻胚乳中特異性表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種編碼水稻膠乳蛋白的基因，命名為水稻Iatexl基因，具有如SEQ ID NO. 2所示的DNA序列。
2.一種水稻胚乳特異性啟動子，來源于水稻hted基因的上游序列，為下述DNA序列之一(1)具有SEQID NO. 1所示的DNA序列；(2)與SEQID NO. 1有80 %以上同源性，且能夠控制目的基因在植物胚乳中特異性表達(dá)的DNA序列；(3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可以與SEQID NO. 1所示的DNA序列雜交，且能控制目的基因在植物胚乳中特異性表達(dá)的DNA序列；(4)在SEQID NO. 1所示的序列基礎(chǔ)上進(jìn)行5，端和3，端分段缺失的DNA序列；(5)在SEQID NO. 1所示的序列基礎(chǔ)上進(jìn)行單核苷酸或寡核苷酸插入、缺失或替換所產(chǎn)生的DNA序列。
3.一種含有權(quán)利要求2所述的水稻胚乳特異性啟動子的表達(dá)載體。
4.一種農(nóng)桿菌宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。
5.一種轉(zhuǎn)基因水稻細(xì)胞，該水稻細(xì)胞被導(dǎo)入權(quán)利要求2所述的水稻胚乳特異性啟動子。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種編碼水稻膠乳蛋白的基因，命名為水稻latex1基因，具有如SEQIDNO.2所示的DNA序列，以及來源于該水稻latex1基因上游序列的水稻胚乳特異性啟動子，命名為Oslatex1-P啟動子。本發(fā)明通過轉(zhuǎn)基因水稻分析的實驗證實Oslatex1-P啟動子可控制目的基因特異性地在水稻的胚乳組織中表達(dá)，在其它組織部位則基本不表達(dá)。本發(fā)明提供的Oslatex1-P啟動子可用于基因工程改良稻米胚乳相關(guān)性狀。
文檔編號C12N15/63GK102304524SQ20111027913
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月20日
發(fā)明者周云, 王 鋒 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所