專利名稱：小球藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小球藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法。它是一種條件溫和，低成本，便捷的，使外源基因安全地進(jìn)入小球藻細(xì)胞的新方法。在生物技術(shù)領(lǐng)域建立小球藻生物反應(yīng)器， 對(duì)于生產(chǎn)高價(jià)值產(chǎn)品，特別是來(lái)源緊俏的基因工程產(chǎn)品具有廣泛的應(yīng)用前景。
背景技術(shù)：
橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea)為綠藻門小球藻屬真核單細(xì)胞綠藻，是一種重要的綠色微藻資源。小球藻是一種理想的蛋白質(zhì)資源，被聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO) 列為二十一世紀(jì)人類的綠色營(yíng)養(yǎng)源健康食品。小球藻具有原核生物的一些特點(diǎn)體積小、生態(tài)分布廣、易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)速度快、應(yīng)用價(jià)值高。小球藻還含有葉綠素，可利用光能進(jìn)行光合作用，像植物一樣自養(yǎng)生長(zhǎng)，培養(yǎng)成本低廉。同時(shí)，作為真核藻類，它又具有真正的細(xì)胞核， 對(duì)于一些需要大量生產(chǎn)而又對(duì)原核生物生長(zhǎng)不利的物質(zhì)或表達(dá)需要翻譯修飾的復(fù)雜蛋白， 可利用小球藻生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)。此外，小球藻不含內(nèi)毒素，因而利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將小球藻改造成新型高效的生物反應(yīng)器，對(duì)于生產(chǎn)高價(jià)值產(chǎn)品，特別是來(lái)源緊俏的產(chǎn)品具有廣泛應(yīng)用前景。Maruyama認(rèn)為在高場(chǎng)強(qiáng)及長(zhǎng)時(shí)間的脈沖持續(xù)期，小球藻細(xì)胞可得到高的通透性，吸納外源DNA的能力較強(qiáng)。Maruyama等以小球藻(C. saccharophila)為受體，采用高壓電擊法，在600-900V電場(chǎng)強(qiáng)度，400ms脈沖持續(xù)時(shí)間的條件下，將質(zhì)粒pBI221導(dǎo)入藻細(xì)胞， 并檢測(cè)到了 gus基因的瞬間表達(dá)(Maruyama M et al.，1994)。王逸云等在5000V脈沖電壓，50ms脈沖持續(xù)時(shí)間，脈沖次數(shù)為211次，循環(huán)次數(shù)為90次的高強(qiáng)度電場(chǎng)力條件下，將質(zhì)粒 pBI121/phyAII轉(zhuǎn)入藻細(xì)胞(王逸云，2005)。張小宇等在6000-9000V脈沖電壓，20_50ms 脈沖持續(xù)時(shí)間，脈沖次數(shù)為21°條件下，將兔防御素基因NP-I轉(zhuǎn)入藻細(xì)胞，獲得了穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白質(zhì)的小球藻生物反應(yīng)器(張小宇，2006)。以上報(bào)道的方法可以將外源基因轉(zhuǎn)入小球藻，但是這些方法均存在著缺點(diǎn)與不足。首先，高強(qiáng)度或長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)脈沖損傷小球藻細(xì)胞；其次，實(shí)現(xiàn)上述高電壓及長(zhǎng)時(shí)間脈沖刺激等實(shí)驗(yàn)條件，必需具備價(jià)格昂貴的設(shè)備，增加了實(shí)驗(yàn)成本和實(shí)驗(yàn)難度。因此，尋找一種溫和、不需要專門設(shè)備的使外源基因安全地轉(zhuǎn)入小球藻細(xì)胞的新方法非常有必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種新的小球藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法，可以克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。本發(fā)明首先獲得了具有高通透性細(xì)胞壁的活體小球藻，溫和地導(dǎo)入基因載體及外源基因，使小球藻表達(dá)外源基因，建立小球藻生物反應(yīng)器。本發(fā)明是一種溫和不需要專門設(shè)備以及安全的構(gòu)建小球藻生物反應(yīng)器的方法，利用本生物反應(yīng)器成功地產(chǎn)出了 gus基因的表達(dá)產(chǎn)物。本發(fā)明提供的小球藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法包括的步驟1)預(yù)培養(yǎng)篩選獲得高通透性細(xì)胞壁的活體小球藻
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小球藻液體培養(yǎng)物，接種量至SE培養(yǎng)基中25°C靜置培養(yǎng)，光照條件3000 40001x，每4h搖動(dòng)一次，連續(xù)照明，培養(yǎng)3天。4000rpm離心，收集小球藻細(xì)胞。25°C靜置條件下，MBBM液體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)Mh，30°C條件下，用纖維素酶處理小球藻細(xì)胞4h，得到纖維素酶酶解的小球藻細(xì)胞培養(yǎng)液。2)小球藻生物反應(yīng)器構(gòu)建取步驟1)的小球藻培養(yǎng)液lmL，4000rpm離心5min，棄上清，用0. Snol/LNaCl 和0. 05mol/LCaCl2混合液ImL重懸細(xì)胞，將小球藻濃度調(diào)整到3 8X IO7個(gè)/mL ；27°C 下，取0. 4mL上述藻液至1. 5mL離心管中，加入25 μ L(l. 77ng/ μ L)攜帶gus基因的質(zhì)粒 pSP-Ubi-GUS DNA{含kocin(博萊霉素)抗性基因ble}，同時(shí)做的陰性對(duì)照不加入質(zhì)粒 pSP-Ubi-GUS DNA。靜置 15min。再分別加入 200 μ L 的 PNC 溶液(0. 8mol/LNaCl，0. 05mol/ LCaCl2,40% PEG 4000)，靜置 30min。4000rpm 離心 5min，棄去上清液，分別加入 ImL SEC 液體培養(yǎng)基(SE培養(yǎng)基中加入0. 5mol/L蔴糖)和2 μ L濃度為10mg/mL Zeocin (博萊霉素)， 混合均勻，分別涂布于含有10ug/mL Zeocin的SEC固體培養(yǎng)基(SEC培養(yǎng)基中加入1. 3% 的瓊脂)上，置于25°C培養(yǎng)箱中，光照條件3000 40001x靜置培養(yǎng)。挑取單藻落于含有 lOyg/mLkocin的SEC液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物為小球藻生物反應(yīng)器。對(duì)照組沒有藻落出現(xiàn)。接種于不含kocin的SEC固體培養(yǎng)基上的對(duì)照組有藻落出現(xiàn)。3)小球藻生物反應(yīng)器中g(shù)us基因產(chǎn)物的檢測(cè)在無(wú)菌條件下，挑取kocin抗性的單藻落轉(zhuǎn)接入500 μ L含有10 μ g/mL Zeocin 的SEC液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2 3天。8000rpm離心5min，收集藻體沉淀，加入0. ImL固定液(95%乙醇冰醋酸=3 1)固定30min。加入IOOyL⑶S染液，37°C下過(guò)夜染色。觀察藻液變化，呈現(xiàn)出藍(lán)色時(shí)證明gus基因已被轉(zhuǎn)入小球藻細(xì)胞，其表達(dá)產(chǎn)物將反應(yīng)底物催化成新生物質(zhì)。本發(fā)明提供的一種新的小球藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法，首先獲得了具有高通透性細(xì)胞壁的活體小球藻，以溫和的簡(jiǎn)便的新方法使外源基因安全地進(jìn)入小球藻細(xì)胞。本發(fā)明不需要在高強(qiáng)度電場(chǎng)力或長(zhǎng)時(shí)間電脈沖的電擊條件下來(lái)建立小球藻生物反應(yīng)器，避免了小球藻細(xì)胞遭受高強(qiáng)度電場(chǎng)力或長(zhǎng)時(shí)間電脈沖的打擊。利用本生物反應(yīng)器成功地產(chǎn)出了 gus 基因的產(chǎn)物。


圖1、組織化學(xué)染色法對(duì)小球藻生物反應(yīng)器所產(chǎn)gus基因產(chǎn)物的驗(yàn)證。圖2、質(zhì)粒pSP-Ubi-GUS的構(gòu)建圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，實(shí)施例僅為解釋性的，決不意味著它以任何方式限制本發(fā)明的范圍。1)藻種小球藻(Chlorella ellipsoidea)藻種由天津師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室篩選并保存，并且可以公開銷售。2)試劑=NaCl, HCl，KCl，EDTA, KNO3, NaNO3, H3BO3, KH2PO4, Na2EDTA, Ca (NO3)2, FeCl3 · 6H20, K2HPO4 · 3H20, MgSO4 · 7H20, CaCl2 · 2H20, MnCl2 · 4H20, ZnSO4 · 7H20, CuSO4 · 5H20,Na2MoO4 · 2H20，酵母粉，葡萄糖，山梨醇，甘露醇，以上實(shí)驗(yàn)試劑均購(gòu)于天津普博欣公司； 纖維素酶(Cellulase Onozuka R-10)，2-脫氧-D-葡萄糖購(gòu)于日本Yakult Honsha公司；X-Gluc, TritonX-100, PEG 4000，Tris，乙酸鉀，冰乙酸，Na3PO4 (ρΗ7. 0), K3 [Fe (CN)6], K4[Fe(CN)6]，溶菌酶，蔗糖，蛋白胨均購(gòu)于天津大學(xué)科威試劑有限公司Jeocin購(gòu)于北京邁晨科技。SE 液體培養(yǎng)基(pH 7. 0) 0. 25g NaNO3,0. 075g K2HPO4 ·3Η20，0· 075g MgSO4 ·7Η20， 0. 025g CaCl2 · 2Η20，0· 175g KH2PO4,0. 025g NaCl，40mL 土壤浸提液，0. 005g FeCl3 · 6H20, ImL Fe-EDTA, ImL A5 混合液，958mL 蒸餾水。(Fe-EDTA :lg Na2 .EDTA，0. 081g FeCl3 ·6Η20， 50mL HCl (0. IN)，50mL 蒸餾水；A5 混合液:0. 286g H3BO3,0. 181g MnCl2 · 4Η20，0· 022g ZnSO4 · 7Η20，0· 0079g CuSO4 · 5Η20, IOOmL 蒸餾水)。MBBM 培養(yǎng)基(pH 7.0) :0. 5g NH4Cl，0.075g MgSO4,0. 17g KH2PO4,0. 075g K2HPO4, 0. 025g CaCl2,0. 025g NaCl，0. 05g 酵母粉，ImL A6 混合液，7. 5g 2-脫氧-D-葡萄糖， 3. 75g 葡萄糖，用 dH20 定容到 1L。A6 混合液0. 28g H3BO3,0. 25g MnSO4 · 7H20，0. 0222g ZnSO4 · 7Η20，0· 0079g CuSO4 · 5Η20，0· 0021g Na2MoO4 · 2H20, IOOmL dH20。特別指出，本文中沒有特別注明的百分比均為質(zhì)量百分比。3)質(zhì)粒的構(gòu)建取基因載體質(zhì)粒 pSP124S (Lumbreras，V.，Stevens, D. R. and Purton, S. Efficient foreign gene expression in Chlamydomonas reinhardtii mediated by an endogenous intron. Plant J. 1998,14(4) :441-448)，將 pSP124S DNA 與 Ubi-gus基因⑴bi為啟動(dòng)子)PCR產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶Bam HI和Hin dill處理，分別得到具有粘性末端的DNA片段，使用DNA ligation Kit將DNA片段連接，構(gòu)建重組DNA。 重組質(zhì)粒命名為kocin抗性基因ble，攜帶外源gus基因，見圖2。4) GUS 染液:50mmol/L PBS 緩沖液(pH 7. 0)，5mmol/L 鐵氰化鉀(K3 [Fe (CN)6]), 5mmol/L 亞鐵氰化鉀{K4[Fe (CN)6] · 3H20} ,0. 3% X-葡萄糖醛酸苷(X-Gluc) ,0. 5% Triton X-100。5)實(shí)施步驟(1)提高小球藻細(xì)胞壁通透性從初始細(xì)胞密度為2. 86 X IO8個(gè)/mL的小球藻培養(yǎng)液中取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小球藻液體培養(yǎng)物，1 %接種量至SE液體培養(yǎng)基中，25°C靜置培養(yǎng)，光照條件3000 40001χ，每4h搖動(dòng)一次，連續(xù)照明，培養(yǎng)3天。分別取ImL培養(yǎng)液置于離心管中，4000rpm離心，除去SE液體培養(yǎng)基，收集藻細(xì)胞。分別按照表1所列實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。收集藻細(xì)胞分別加入含有不同量纖維素酶的高滲酶解緩沖液10. 025mol/L磷酸緩沖液(由0. 2mol/LNaH2P04 ·2Η20 和0. 2mo VLNa2HPO4 · 12H20配置而成)，pH 6. 0，含有0. 3mol/L山梨醇/甘露醇}，混勻，置于水溫30°C的水浴恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速80rpm，酶解4h。表1各種酶解實(shí)驗(yàn)條件
權(quán)利要求
1.一種小球藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟1)預(yù)培養(yǎng)篩選獲得高通透性細(xì)胞壁的活體小球藻取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小球藻液體培養(yǎng)物，1 %接種量至PH7的SE液體培養(yǎng)基中，25°C靜置培養(yǎng)，光照條件3000 40001x，每4h搖動(dòng)一次，連續(xù)照明，培養(yǎng)3天，4000rpm離心，收集小球藻細(xì)胞；25°C靜置條件下，MBBM液體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)Mh，30°C條件下，用纖維素酶處理小球藻細(xì)胞，得到具有高通透性細(xì)胞壁的小球藻細(xì)胞培養(yǎng)液；2)小球藻生物反應(yīng)器構(gòu)建取步驟1)的小球藻培養(yǎng)液lmL，4000rpm離心5min，棄上清，用0. 8mol/L NaCl和 0. 05mol/L CaCl2混合液ImL重懸細(xì)胞，將小球藻濃度調(diào)整到3 8X107個(gè)/mL ；27 °C 下，取0.4mL上述藻液至1.5mL離心管中，加入25 μ L(0D26Q 1.77)攜帶gus基因的質(zhì)粒 pSP-Ubi-GUS 0嫩{含&0(^11，博萊霉素)抗性基因ble}，靜置15min ；再分別加入200 μ L的 PNC 溶液，其組成0. 8mol/L NaCl, 0. 05mol/L CaCl2,40% PEG 4000，靜置 30min ;4000rpm 離心5min，棄去上清液，分別加入ImL SEC液體培養(yǎng)基和2 μ L濃度為10mg/mL Zeocin,混合均勻，分別涂布于含有l(wèi)Oug/mL Zeocin的SEC固體培養(yǎng)基上，置于25°C培養(yǎng)箱中，光照條件3000 40001x靜置培養(yǎng)。挑取單藻落于含有10 μ g/mL kocin的SEC液體培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)物為小球藻生物反應(yīng)器；所述的SEC液體培養(yǎng)基的組成SE培養(yǎng)基中加入0. 5mol/L蔗糖所述的SEC固體培養(yǎng)基的組成SE培養(yǎng)基中加入1. 3%的瓊脂；3)小球藻生物反應(yīng)器中g(shù)us基因產(chǎn)物的檢測(cè)在無(wú)菌條件下，挑取kocin抗性的單藻落轉(zhuǎn)接入500 μ L含有10 μ g/mL Zeocin的SEC 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2 3天；SOOOrpm離心5min，收集藻體沉淀，加入0. ImL固定液固定 30min ；加入100 μ L⑶S染液，37°C下過(guò)夜染色；觀察藻液變化，呈現(xiàn)出藍(lán)色時(shí)證明gus基因已被轉(zhuǎn)入小球藻細(xì)胞，其表達(dá)產(chǎn)物將反應(yīng)底物催化成新生物質(zhì)；所述的固定液組成95% 乙醇冰醋酸=3:1。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的SE液體培養(yǎng)基的組成0.25g NaNO3, 0. 075g K2HPO4 · 3Η20，0· 075g MgSO4 · 7Η20，0· 025g CaCl2 · 2Η20，0· 175g KH2PO4, 0. 025gNaCl，40mL 土壤浸提液，0. 005g FeCl3 · 6H20, ImL Fe-EDTA, ImL A5 混合液，958mL 蒸餾水；Fe-EDTA :lg Na2 · EDTA，0. 081g FeCl3 · 6H20，50mL HCl (0. IN)，50mL 蒸餾水；A5 混合液:0. 286g H3BO3,0. 181g MnCl2 · 4H20,0. 022g ZnSO4 · 7H20,0. 0079g CuSO4 · 5H20, IOOmL 蒸餾水。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的MBBM培養(yǎng)基組成0.5g NH4Cl, 0. 075g MgSO4,0. 17g KH2PO4,0. 075g K2HPO4,0. 025g CaCl2,0. 025g NaCl，0. 05g 酵母粉， lmLA6混合液，7. 5g 2-脫氧-D-葡萄糖，3. 75g葡萄糖，用dH20定容至Ij IL ；A6混合液:0. 28g H3BO3,0. 25g MnSO4 ·7Η20，0· 0222g ZnSO4 ·7Η20，0. 0079g CuSO4 ·5Η20，0· 002IgNii2MoO4 ·2Η20， IOOmL dH20，pH7.0。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的纖維素酶處理?xiàng)l件是由0.2mol/ LNaH2PO4 · 2H20 和 0. 2mol/L Na2HPO4 · 12H20 配置而成磷酸緩沖液，pH6. 0，含有 0. 3mol/L 山梨醇/甘露醇，混勻，置于水溫30°C的水浴恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速80rpm，處理4h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種小球藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法。它包括的步驟預(yù)培養(yǎng)篩選獲得高通透性細(xì)胞壁的活體小球藻、小球藻生物反應(yīng)器構(gòu)建和小球藻生物反應(yīng)器中g(shù)us基因產(chǎn)物的檢測(cè)。利用本生物反應(yīng)器成功地產(chǎn)出了gus基因的表達(dá)產(chǎn)物。本發(fā)明是一種條件溫和，低成本，便捷的，使外源基因安全地進(jìn)入小球藻細(xì)胞的新方法。在生物技術(shù)領(lǐng)域建立小球藻生物反應(yīng)器，對(duì)于生產(chǎn)高價(jià)值產(chǎn)品，特別是來(lái)源緊俏的基因工程產(chǎn)品具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102337217SQ20111028206
公開日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者劉麗麗, 王艷琪 申請(qǐng)人:天津師范大學(xué)