專利名稱：從海水中分離與純化石油烴降解純菌株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于受溢油污染海水的生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種從海水中分離與純化石油烴降解純菌株的方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著世界各國(guó)對(duì)石油及其制品日漸增長(zhǎng)的需求，在海上開(kāi)采、裝卸、運(yùn)輸以及利用石油過(guò)程中溢油事故時(shí)有發(fā)生，不但造成大量的原油流失，還對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，日趨嚴(yán)重地威脅著海洋及陸域的生態(tài)環(huán)境，對(duì)海洋環(huán)境、自然資源和養(yǎng)殖資源等都有長(zhǎng)期的危害，因此，海洋溢油污染已經(jīng)成為人們必須面對(duì)的重大環(huán)境問(wèn)題。在海洋溢油處理技術(shù)中，生物修復(fù)技術(shù)具有高效、經(jīng)濟(jì)、安全、無(wú)二次污染等特點(diǎn)，已成為現(xiàn)場(chǎng)去除海洋溢油污染的重要選擇途徑，特別是對(duì)機(jī)械裝置無(wú)法清除的薄油層，同時(shí)又限制使用化學(xué)藥劑時(shí)，運(yùn)用生物修復(fù)可顯出其更大的優(yōu)越性。若在海洋溢油處理修復(fù)工程中使用內(nèi)源微生物進(jìn)行降解，由于內(nèi)源微生物生長(zhǎng)速度慢及活性低而修復(fù)的效率不高，因此，需要接種一些降解石油烴污染物的高效菌，即通過(guò)向海洋溢油環(huán)境中加入大量的可存活的并能表現(xiàn)降解活性的石油烴降解菌，以提高海洋中石油污染物的降解速率和程度。然而由于缺少高效的可應(yīng)用于海洋溢油處理的石油烴降解菌，制約了海洋溢油生物修復(fù)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用。因此，需要從海洋環(huán)境中分離與純化出降解速率較快的純菌株，然后再把它們應(yīng)用于實(shí)際海洋溢油污染環(huán)境的生物治理，這對(duì)于治理和修復(fù)海洋溢油污染有重要的意義。但是常規(guī)分離與純化降解菌株的技術(shù)無(wú)法適用于對(duì)海水中存在的石油烴降解純菌株的分離與純化。而且分離與純化的環(huán)境條件及過(guò)程參數(shù)選定等都對(duì)分離與純化出降解菌的降解效能有密切的關(guān)系，這些都需要經(jīng)過(guò)一系列的試驗(yàn)研究后才能確定出最佳范圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種從海水中分離與純化石油烴降解純菌株的方法。其具體步驟如下(1)選取海水樣品4000mL，放置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?2)向體積為2500mL的玻璃瓶中加入IOg原油，加入40mL正己烷溶解后均勻平鋪于玻璃瓶瓶底，為除去正己烷將玻璃瓶開(kāi)口放置3天；(3)向步驟⑵中的玻璃瓶中入500mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、IOmL微量金屬液和2mL維生素 c 溶液；其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為=NH4NO3 :2. Og · L-1，NaCl :10. 5g/L，KH2PO4 :2. 5g · L-1， FeCl3 :0. IOg · ΙΛ MgSO4 :3. 5g · Λ CaCl2 · 2Η20 :0. 15g · L—1 ；微量金屬液的組成為: CoCl2 · 6H20 :45mg ·廠1，CuCl2 :0. 25mg ·廠1，H3BO3 :6. 5mg ·廠1，MnCl2 · 4H20 :35mg ·廠1， Na2MoO4 · 2H20 :3. 5mg · Λ NiCl2 · 2H20 :2. 5mg · Λ ZnCl2 :3. 5mg · L-1 ；(4)向步驟(3)中的玻璃瓶?jī)?nèi)接入步驟(1)中海水樣品IOOOmL,然后置于溫度為 10 15°C轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)10 12個(gè)月，為維持玻璃瓶?jī)?nèi)液體總量不變，每隔一周補(bǔ)充步驟(1)中海水樣品；(5)向體積為250mL的錐形瓶中加入1. Og原油，加入4. OmL正己烷溶解后均勻平鋪于錐形瓶瓶底，為除去正己烷將錐形瓶開(kāi)口放置2天；(6)向步驟(5)中錐形瓶中加入50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1. OmL微量金屬液和0. 2mL維生素c溶液；(7)向步驟(6)中錐形瓶中接入經(jīng)步驟(4)處理后玻璃瓶?jī)?nèi)的溶液5mL，然后置于溫度為10 15°C轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)6 8天；(8)按接種體積比為50 1的比例將步驟(7)中錐形瓶?jī)?nèi)的溶液轉(zhuǎn)入另一按步驟 (5)至(6)處理后的錐形瓶?jī)?nèi)，然后置于溫度為10 15°C轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)6 8天，(9)按接種體積比為50 1的比例將步驟⑶中錐形瓶?jī)?nèi)的溶液轉(zhuǎn)入另一按步驟 (5)至(6)處理后的錐形瓶?jī)?nèi)，然后置于溫度為10 15°C轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)6 8天；(10)重復(fù)步驟⑶和(9)三次，每次在進(jìn)行步驟⑶時(shí)，以步驟(9)中錐形瓶?jī)?nèi)的溶液代替步驟(7)中錐形瓶?jī)?nèi)的溶液；(11)向體積為IOOOmL的玻璃瓶?jī)?nèi)加入800mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、20. OmL微量金屬液、
4. OmL維生素c溶液，搖勻后作為液體培養(yǎng)基備用；(12)向體積為150mL的錐形瓶?jī)?nèi)加入50mL按步驟(11)配制的液體培養(yǎng)基和 0. 60g瓊脂，然后在溫度為121°C的高壓鍋中滅菌20分鐘，在室溫下冷卻至65 70°C時(shí)，在超凈工作臺(tái)中將其倒入體積為160mL的培養(yǎng)皿中，為除去培養(yǎng)基表面多余的水分將該培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)中放置2天；(13)在超凈工作臺(tái)中向步驟(12)中的培養(yǎng)皿中加入1. 5mL原油濃度為15g/L的正己烷溶液，來(lái)回傾斜轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使溶有原油的正己烷溶液均勻分布，為除去培養(yǎng)基表面的正己烷將該培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)中放置2天；(14)向體積為25mL的錐形瓶?jī)?nèi)加入IOmL按步驟(11)配制的液體培養(yǎng)基和0. 25g 瓊脂，在溫度為121°C的高壓鍋中滅菌20分鐘，在超凈工作臺(tái)中冷卻至38 40°C ；(15)在超凈工作臺(tái)中向步驟(14)的錐形瓶中加入ImL步驟(10)中錐形瓶?jī)?nèi)的溶液，搖勻后吸取ImL慢慢加入步驟(13)中的培養(yǎng)皿中，來(lái)回傾斜轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使培養(yǎng)基溶液均勻分布；將培養(yǎng)皿放入溫度為15°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察，9 13天后便可發(fā)現(xiàn)有明顯的菌落出現(xiàn)；(16)在超凈工作臺(tái)中向體積為25mL的錐形瓶中加入1. 5mL原油濃度為15g/L的正己烷溶液，為除去丙酮將錐形瓶開(kāi)口放置2天；(17)向步驟(16)中的錐形瓶?jī)?nèi)加入IOmL按步驟(11)配制的液體培養(yǎng)基；(18)在超凈工作臺(tái)中挑取步驟(1 培養(yǎng)皿中的菌落，將其接種至步驟(17)中的錐形瓶中，在溫度為10 15°C、轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)4 6天；(19)將步驟(1 至步驟(18)作為一個(gè)分離純化周期；重復(fù)步驟(1 至步驟 (18)，但每次用前一個(gè)分離純化周期中步驟(18)的菌液代替步驟(15)中用到的ImL步驟 (10)中錐形瓶?jī)?nèi)的溶液；分離純化6個(gè)周期以上即可得到能夠高效去除溢油污染海水中石油烴的降解純菌株。
本發(fā)明的有益效果是所述的方法能夠分離與純化到高效去除溢油污染海水中石油烴的降解純菌株。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種從海水中分離與純化石油烴降解純菌株的方法。首先向加入原油、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液和維生素c溶液的玻璃瓶?jī)?nèi)接入海水樣品，在溫度為10 15°C、轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)培養(yǎng)10 12個(gè)月后，進(jìn)行循環(huán)轉(zhuǎn)接，在循環(huán)次數(shù)大于6次后得到富集石油烴降解菌群的溶液。在超凈工作臺(tái)中制作以石油烴為唯一碳源和能源的瓊脂固體培養(yǎng)基底層平板，在底層平板上制作含有石油烴降解菌群的瓊脂固體培養(yǎng)基頂層平板，然后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 13天。在超凈工作臺(tái)中向加入石油烴、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液、維生素c溶液的錐形瓶?jī)?nèi)接入培養(yǎng)基平板中的菌落，在溫度為10 15°C、轉(zhuǎn)速為 100r/min的振蕩器中培養(yǎng)4 6天。然后進(jìn)行循環(huán)轉(zhuǎn)接，在循環(huán)次數(shù)大于6次后即可得到石油烴降解純菌株。下面是以運(yùn)用分離與純化得到的石油烴降解純菌株進(jìn)行了溢油污染海水中石油烴的降解試驗(yàn)，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例運(yùn)用本發(fā)明方法分離與純化得到的石油烴降解純菌株進(jìn)行了溢油污染海水中石油烴的降解試驗(yàn)，結(jié)果表明得到的石油烴降解純菌株能夠?qū)κ蜔N進(jìn)行有效的降解當(dāng)石油烴的初始濃度為7. 3g/L時(shí)，6天后能降解到3. 3g/L，對(duì)石油烴的降解率可達(dá)到54. 79%。
權(quán)利要求
1. 一種從海水中分離與純化石油烴降解純菌株的方法，其特征在于，該方法的具體步驟如下(1)選取海水樣品4000mL，放置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?2)向體積為2500mL的玻璃瓶中加入IOg原油，加入40mL正己烷溶解后均勻平鋪于玻璃瓶瓶底，為除去正己烷將玻璃瓶開(kāi)口放置3天；(3)向步驟⑵中的玻璃瓶中入500mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、IOmL微量金屬液和2mL維生素c溶液；其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為=NH4NO3 · 2. Og · ΙΛ NaCl :10. 5g/L，KH2PO4 :2. 5g ·廠1，F(xiàn)eCl3 0. IOg · ΙΛ MgSO4 :3. 5g · ΙΛ CaCl2 · 2Η20 :0. 15g · Γ1 ；微量金屬液的組成為=CoCl2 · 6Η20 45mg · ΙΛ CuCl2 :0. 25mg ·廠1，H3BO3 :6. 5mg · Λ MnCl2 · 4Η20 :35mg · Λ Na2MoO4 · 2Η20 3. 5mg · ΙΛ NiCl2 · 2Η20 :2· 5mg · Λ ZnCl2 :3· 5mg · Γ1 ；(4)向步驟(3)中的玻璃瓶?jī)?nèi)接入步驟(1)中海水樣品IOOOmL,然后置于溫度為10 15°C轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)10 12個(gè)月，為維持玻璃瓶?jī)?nèi)液體總量不變，每隔一周補(bǔ)充步驟(1)中海水樣品；(5)向體積為250mL的錐形瓶中加入1.Og原油，加入4. OmL正己烷溶解后均勻平鋪于錐形瓶瓶底，為除去正己烷將錐形瓶開(kāi)口放置2天；(6)向步驟(5)中錐形瓶中加入50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1.OmL微量金屬液和0. 2mL維生素 c溶液；(7)向步驟(6)中錐形瓶中接入經(jīng)步驟(4)處理后玻璃瓶?jī)?nèi)的溶液5mL，然后置于溫度為10 15°C轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)6 8天；(8)按接種體積比為50 1的比例將步驟(7)中錐形瓶?jī)?nèi)的溶液轉(zhuǎn)入另一按步驟(5) 至(6)處理后的錐形瓶?jī)?nèi)，然后置于溫度為10 15°C轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)6 8天，(9)按接種體積比為50 1的比例將步驟(8)中錐形瓶?jī)?nèi)的溶液轉(zhuǎn)入另一按步驟(5) 至(6)處理后的錐形瓶?jī)?nèi)，然后置于溫度為10 15°C轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)6 8天；(10)重復(fù)步驟⑶和(9)三次，每次在進(jìn)行步驟⑶時(shí)，以步驟(9)中錐形瓶?jī)?nèi)的溶液代替步驟(7)中錐形瓶?jī)?nèi)的溶液；(11)向體積為IOOOmL的玻璃瓶?jī)?nèi)加入800mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、20.OmL微量金屬液、4. OmL 維生素c溶液，搖勻后作為液體培養(yǎng)基備用；(12)向體積為150mL的錐形瓶?jī)?nèi)加入50mL按步驟(11)配制的液體培養(yǎng)基和0.60g瓊脂，然后在溫度為121°C的高壓鍋中滅菌20分鐘，在室溫下冷卻至65 70°C時(shí)，在超凈工作臺(tái)中將其倒入體積為160mL的培養(yǎng)皿中，為除去培養(yǎng)基表面多余的水分將該培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)中放置2天；(13)在超凈工作臺(tái)中向步驟(12)中的培養(yǎng)皿中加入1.5mL原油濃度為15g/L的正己烷溶液，來(lái)回傾斜轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使溶有原油的正己烷溶液均勻分布，為除去培養(yǎng)基表面的正己烷將該培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)中放置2天；(14)向體積為25mL的錐形瓶?jī)?nèi)加入IOmL按步驟(11)配制的液體培養(yǎng)基和0.25g瓊脂，在溫度為121°C的高壓鍋中滅菌20分鐘，在超凈工作臺(tái)中冷卻至38 40°C ；(15)在超凈工作臺(tái)中向步驟(14)的錐形瓶中加入ImL步驟(10)中錐形瓶?jī)?nèi)的溶液，搖勻后吸取ImL慢慢加入步驟(1 中的培養(yǎng)皿中，來(lái)回傾斜轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使培養(yǎng)基溶液均勻分布；將培養(yǎng)皿放入溫度為15°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察，9 13天后便可發(fā)現(xiàn)有明顯的菌落出現(xiàn)；(16)在超凈工作臺(tái)中向體積為25mL的錐形瓶中加入1.5mL原油濃度為15g/L的正己烷溶液，為除去丙酮將錐形瓶開(kāi)口放置2天；(17)向步驟(16)中的錐形瓶?jī)?nèi)加入IOmL按步驟(11)配制的液體培養(yǎng)基；(18)在超凈工作臺(tái)中挑取步驟(1 培養(yǎng)皿中的菌落，將其接種至步驟(17)中的錐形瓶中，在溫度為10 15°C、轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)4 6天；(19)將步驟(1 至步驟(18)作為一個(gè)分離純化周期；重復(fù)步驟(1 至步驟(18)，但每次用前一個(gè)分離純化周期中步驟(18)的菌液代替步驟(15)中用到的ImL步驟(10)中錐形瓶?jī)?nèi)的溶液；分離純化6個(gè)周期以上即可得到能夠高效去除溢油污染海水中石油烴的降解純菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了屬于受溢油污染海水的生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域的一種從海水中分離與純化石油烴降解純菌株的方法。首先向加入原油、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液和維生素c溶液的錐形瓶?jī)?nèi)接入海水樣品，進(jìn)行石油烴降解菌群的富集。在超凈工作臺(tái)中制作以石油烴為唯一碳源和能源的瓊脂固體培養(yǎng)基底層平板，在底層平板上制作含有石油烴降解菌群的瓊脂固體培養(yǎng)基頂層平板，然后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9～13天。在超凈工作臺(tái)中向加入石油烴、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液、維生素c溶液的錐形瓶?jī)?nèi)接入培養(yǎng)基平板中的菌落，在溫度為10～15℃條件下培養(yǎng)4～6天。然后進(jìn)行循環(huán)轉(zhuǎn)接，在循環(huán)次數(shù)大于6次后即可得到石油烴降解純菌株。
文檔編號(hào)C12N1/00GK102329730SQ20111028206
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者丁愛(ài)中, 李帥冉, 王鴻婷, 程莉蓉, 范福強(qiáng), 豆俊峰, 鄭蕾 申請(qǐng)人:北京師范大學(xué)