專利名稱：一種人類主要組織相容性復(fù)合體ⅰ類分子相關(guān)基因a基因測(cè)序分型方法及試劑盒的制作方法
一種人類主要組織相容性復(fù)合體丨類分子相關(guān)基因A基因測(cè)序分型方法及試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)序分型方法，特別是涉及人類主要組織相容性復(fù)合體I類分子相關(guān)基因A(major histocompatibility complex class I chain related gene A,MICA)的測(cè)序分型方法。
背景技術(shù)：
人類主要組織相容性復(fù)合體I類分子相關(guān)基因A基因(MICA基因)位于人第6號(hào)染色體的短臂HLA-III類基因區(qū)，屬于非經(jīng)典HLA-I類基因家族的功能基因。 MICA基因全長(zhǎng)11722bp(NM_000247)，編碼1382bp的轉(zhuǎn)錄物。整個(gè)基因包括6 ^
外顯子(外顯子1 6)，外顯子1編碼L前導(dǎo)肽，外顯子2 構(gòu)域，外顯子5編碼跨膜(TM)區(qū)，外顯子6編碼胞質(zhì)區(qū)。
表1 MICA基因各外顯子及內(nèi)含子長(zhǎng)度
4分別編碼細(xì)胞外α 1 3結(jié)
權(quán)利要求
1.一種人類主要組織相容性復(fù)合體I類分子相關(guān)基因A基因測(cè)序分型的方法，其特征在于，所述測(cè)序?yàn)殡p向測(cè)序，并還可以包括第1和第6外顯子的測(cè)序。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其步驟為提取樣品基因組DNA;設(shè)計(jì)PCR引物對(duì)樣品進(jìn)行基因組DNA的PCR擴(kuò)增；設(shè)計(jì)測(cè)序引物對(duì)所獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，分別對(duì)其中第1、2、3、4、5、6外顯子進(jìn)行正、反向雙向測(cè)序；或者先對(duì)第2至第5外顯子基因序列測(cè)序，根據(jù)結(jié)果再?zèng)Q定對(duì)第1至第6外顯子測(cè)序；根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分型。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增中用到了三對(duì)PCR擴(kuò)增引物，其中第一對(duì)PCR擴(kuò)增引物為第1外顯子PCR擴(kuò)增引物，其上游引物位于人類主要組織相容性復(fù)合體I類分子相關(guān)基因A基因的5'-啟動(dòng)子區(qū)域，包含了部分5’-啟動(dòng)子區(qū)，下游引物位于人類主要組織相容性復(fù)合體I類分子相關(guān)基因A基因的第1內(nèi)含子區(qū)域；第二對(duì)PCR擴(kuò)增引物為第2至第5外顯子的PCR擴(kuò)增引物，其上游引物位于第1內(nèi)含區(qū)域，下游引物位于第5內(nèi)含子區(qū)域；第三對(duì)PCR擴(kuò)增引物為第6外顯子的PCR擴(kuò)增引物，其上游引物位于第5內(nèi)含子區(qū)域， 下游引物位于3'-非翻譯區(qū)UTR。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增中用到的引物序列分別為擴(kuò)增第一外顯子的上游引物MICA-PCR-1-F1和下游引物MICA-PCR-1-R1，具體序列為SEQID NO :1 禾口 SEQ ID NO 2 ；擴(kuò)增第2至第5外顯子的上游引物MICA-PCR-2345-F10和下游引物 MICA-PCR-2345-R10，具體序列為:SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 ；擴(kuò)增第6外顯子的上游引物MICA-PCR-6-F4和下游引物MICA-PCR-6-R4，，具體序列為 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO :6。
5.權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為基因組 DNA IOOng1 μ .10 χ Pfu Buffer2. 5 μ dNTP (2. 5mM)2. 5 μ PCR 正向引物(10 μΜ)0. 5μ PCR 反向引物(10 μΜ)0. 5μΙ PfuUltra fusion HS DNA polymerase (5 /μΟ 0. 5μΙ加 ddH20 至25 μ 或所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為
6.權(quán)利要求4或5任一所述的方法，其特征在于第1外顯子的PCR擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為 47^p，第2至第5外顯子的PCR擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為2M9bp，第6外顯子的PCR擴(kuò)增片斷長(zhǎng)為 570bp。
7.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR測(cè)序擴(kuò)增中用到的測(cè)序引物包括 第一外顯子正向測(cè)序引物MICA-Seq-1-F，其序列為SEQ ID NO :7，反向測(cè)序引物MICA-kq-1-R，其序列為SEQ ID NO 8 ；第二外顯子正向測(cè)序引物MICA-Seq-2-F，其序列為SEQ ID NO :9，反向測(cè)序引物 MICA-kq-2-R，其序列為:SEQ ID NO 10 ；第三外顯子正向測(cè)序引物MICA-Seq-3-F,其序列為SEQID NO 11，反向測(cè)序引物 MICA-kq-3-R，其序列為:SEQ ID NO 12 ；第四外顯子正向測(cè)序引物MICA-Seq-4-F，其序列為SEQ ID NO:13，反向測(cè)序引物 MICA-Seq-4-R，其序列為:SEQ ID NO :714 ；第五外顯子反向測(cè)序引物MICA-Seq-5-R，其序列為SEQ ID NO:15，反向測(cè)序引物 MICA-kq-5-R，其序列為:SEQ ID NO 16 ；第六外顯子正向測(cè)序引物MICA-Seq-6-F，其序列為SEQ ID NO:17。反向測(cè)序引物 MICA-kq-6-R，其序列為SEQ ID NO :18。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述測(cè)序反應(yīng)體系為
9.具有SEQID NO :1至SEQ ID NO :18任一項(xiàng)所示序列的核甘酸。
10.一種用于權(quán)利要求1所述方法的試劑盒，包括SEQ ID NO :1和SEQ ID Ν0:2，和或 SEQ ID NO :3 禾口 SEQ ID NO :4，和或 SEQ ID NO :5 禾口 SEQ ID NO :6 的序列，以及一種或多種選自SEQ ID NO :7至SEQ ID NO 18的測(cè)序引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人類主要組織相容性復(fù)合體I類分子相關(guān)基因A基因測(cè)序分型方法及試劑盒，本發(fā)明的具體方法為提取樣品基因組DNA；設(shè)計(jì)PCR引物對(duì)樣品進(jìn)行基因組DNA的PCR擴(kuò)增；設(shè)計(jì)測(cè)序引物對(duì)所獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，分別對(duì)其中第1、2、3、4、5、6外顯子進(jìn)行正、反向雙向測(cè)序；根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分型。該方法可以解決目前MICA基因進(jìn)口商品化測(cè)序試劑盒僅有單向測(cè)序試劑盒，避免單向測(cè)序堿基信號(hào)強(qiáng)度不一致及不能清晰反應(yīng)突變存在的缺點(diǎn)，解決MICA模棱兩可基因分型結(jié)果，獲得第1和第6外顯子堿基序列。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102352409SQ20111028242
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月21日
發(fā)明者徐筱娉, 楊寶成, 鄧志輝, 高素青 申請(qǐng)人:深圳市血液中心