專利名稱：鑒定北京基因型結(jié)核分枝桿菌的分子標(biāo)識和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒定結(jié)核分枝桿菌的分子標(biāo)識和方法，尤其涉及一種鑒定北京基因型結(jié)核分枝桿菌的分子標(biāo)識和方法。
背景技術(shù)：
世界衛(wèi)生組織報(bào)告指出，結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病是世界上感染率最高的感染性疾病，同時(shí)也是全球各種傳染病中引起最多死亡的疾病，據(jù)估計(jì)，全球人口中的三分之一感染結(jié)核分枝桿菌。其中，北京基因型結(jié)核分枝桿菌(#. tb Beijing genotype,又稱北京株，Beijing Strain)最早發(fā)現(xiàn)于中國、蒙古、俄羅斯等地，是結(jié)核分枝桿菌中的重要家族，傳播疾病快、耐藥性強(qiáng)，而且北京基因型結(jié)核分枝桿菌在吞噬細(xì)胞或單核球內(nèi)，具有更好的生長能力，該家族病毒成員導(dǎo)致了較高的耐藥率和死亡率，世界范圍內(nèi)多個地區(qū)耐藥率的 增長與該家族有關(guān)。據(jù)臺灣衛(wèi)生署調(diào)查研究，在較年輕的結(jié)核病感染人群中，北京株感染比例較高，小于24歲的結(jié)核病患者,北京株感染所占比例高達(dá)61. 5%。據(jù)西班牙Gran Canaria Island的研究，北京株感染人數(shù)成逐年增加的趨勢?？傊?，北京株在世界各國有逐漸蔓延的趨勢。北京株致病比例與男女性別統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性，北京株在30歲以下青少年比例較高，而且北京株較其它結(jié)核分枝桿菌具有較高的致病性，傳播率以及耐藥性；加之結(jié)核病具有潛伏感染的特點(diǎn)，因此，對北京基因型結(jié)核分枝桿菌的鑒定對于結(jié)核的預(yù)防非常重要。間隔區(qū)寡核苷酸分型法(spoligotyping)是鑒定北京基因型結(jié)核分枝桿菌的金標(biāo)準(zhǔn)，由于這種方法過于復(fù)雜和繁瑣，存在花費(fèi)時(shí)間長、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，許多研究者都致力于找出快速低廉的替代方法。PCR方法已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌的鑒定，尋找分子標(biāo)識是PCR方法的關(guān)鍵所在，目前常用的鑒定北京基因型結(jié)核分枝桿菌的分子標(biāo)識主要包括1)具有類似IS6110類型(15 20拷貝);2)均屬于主遺傳群I ;3)基因組DNA A DNA N位點(diǎn)有一個IS6110插入；4)具有相同的特征性間隔寡型(S00034);5)耐異胭肼相關(guān)的kat G基因315位密碼子的雙核苷酸改變(AGC — ACA) ；6) RD105區(qū)缺失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種新的鑒定北京基因型結(jié)核分枝桿菌的分子標(biāo)識，以及利用所述分子標(biāo)識鑒定北京基因型結(jié)核分枝桿菌的方法；所述分子標(biāo)識為位于結(jié)核分枝桿菌Rv0050編碼基因中的CCG簡單串聯(lián)重復(fù)序列，為鑒定北京基因型結(jié)核分枝桿菌提供了一種新的途徑和方法。本發(fā)明第一個目的是提供一種用于鑒定北京基因型結(jié)核分枝桿菌的分子標(biāo)識，所述分子標(biāo)識為寡核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列(CCG)4CCT(CCG)4TCG,具體為CCGCCGCCGCCGCCTCCGCCGCCGCCGTCG。
所述序列中，含有10個重復(fù)單元，從左到右，第5個重復(fù)單元發(fā)生改變(CCG — CCT)，第十個重復(fù)單元發(fā)生改變(CCG — TCG)，其余八個重復(fù)單元為CCG。本發(fā)明第二個目的是提供一種鑒定北京基因型結(jié)核分枝桿菌的方法，步驟包括 步驟1，以含有微衛(wèi)星CCG位點(diǎn)的Rv0050基因序列為模板，設(shè)計(jì)一對同源引物；
步驟2，提取待測樣品DNA為模板DNA，利用步驟I中設(shè)計(jì)的一對同源引物進(jìn)行PCR擴(kuò)
增；
步驟3，將PCR產(chǎn)物克隆測序獲得PCR擴(kuò)增片段的核酸序列，如果擴(kuò)增片段中有的CCG簡單串聯(lián)重復(fù)序列形態(tài)是(CCG) 4CCT (CCG) 4TCG，則判定為北京基因型結(jié)核分枝桿菌，如果擴(kuò)增片段中有的CCG簡單串聯(lián)重復(fù)序列形態(tài)不是(CCG)4 CCT (CCG)4TCG,則不是北京基因型結(jié)核分枝桿菌。其中，所述一對同源引物優(yōu)選為
5，-TTGAAGGGCACGTCGAACGAG-3，；
5，-GGGACCGATCGGGATGGTAA-3，。本發(fā)明第三個目的是提供另一種鑒定北京基因型結(jié)核分枝桿菌的方法，步驟包括
步驟1，以含有微衛(wèi)星CCG位點(diǎn)的RV0050基因序列為模板，設(shè)計(jì)一對同源引物；
步驟2，提取待測樣品DNA為模板DNA，利用步驟I中設(shè)計(jì)的一對同源引物進(jìn)行PCR擴(kuò)
>曰，
步驟3，將步驟2中得到擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳、染色，對比所述擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶與(CCG) 4CCT (CCG) 4TCG在相同條件下下PCR擴(kuò)增和電泳標(biāo)準(zhǔn)條帶，如果擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)條帶大小相同，則為北京基因型結(jié)核分枝桿菌，如果擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)條帶大小不同，則不是北京基因型結(jié)核分枝桿菌。其中，所述一對同源引物優(yōu)選為
5，-TTGAAGGGCACGTCGAACGAG-3，；
5，-GGGACCGATCGGGATGGTAA-3，。本發(fā)明上述的鑒定方法中，所述電泳為6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。本發(fā)明上述的鑒定方法中，所述電泳條件包括將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于94°C變性7分鐘，然后經(jīng)變性聚丙烯酰胺電泳，1500V條件下電泳1. 5^2小時(shí)。本發(fā)明上述的鑒定方法中，所述染色為硝酸銀染色。本發(fā)明提供了一種鑒定北京基因型結(jié)核分枝桿菌的分子標(biāo)識、以及使用所述分子標(biāo)識鑒定北京基因型結(jié)核分枝桿菌的方法，該方法簡單、快速、廉價(jià)，準(zhǔn)確性高，敏感度和特異性高達(dá)100%，為鑒定北京基因型計(jì)劃分枝桿菌提供了一種新的有效地途徑，可用于臨床北京基因型結(jié)核分枝桿菌感染的鑒定、預(yù)防和治療北京基因型結(jié)核分枝桿菌感染結(jié)核病藥物的研發(fā)篩選、以及北京基因型結(jié)核分枝桿菌耐藥性研究等領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種鑒定北京基因型結(jié)核分枝桿菌的分子標(biāo)識，具體為 CCGCCGCCGCCGCCTCCGCCGCCGCCGTCG。本發(fā)明還提供了利用所述分子標(biāo)識鑒定北京基因型結(jié)核分枝桿菌的方法。
下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明利用所述分子標(biāo)識鑒定北京基因型結(jié)核分枝桿菌的方法進(jìn)行詳細(xì)的描述和介紹，以使更好的理解本發(fā)明，但下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1
步驟1，設(shè)計(jì)引物
以含有微衛(wèi)星CCG位點(diǎn)的RV0050基因序列為模板，設(shè)計(jì)同源引物 同源引物一 5’ -TTGAAGGGCACGTCGAACGAG-3’，
同源引物二 5’ -GGGACCGATCGGGATGGTAA-3’。步驟2，PCR擴(kuò)增
提取結(jié)核分枝桿菌臨床菌株DNA為模板DNA，利用步驟I中設(shè)計(jì)的同源引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下
IOXTaq PCR 緩沖液2yL
MgCl22. 5 mM
dNTPO. 2 mM
同源引物一O. 2μΜ
同源引物二O. 2μΜ
Taq DNA聚合酶IU
模板 DNAIOng
ddH20加至總體積為20 μ L
PCR 反應(yīng)條件94°C，5min— (94°C，30s—65°C，30s—72°C，2min) X 35 個循環(huán)一72°C，7min。即:首先 94°C，5min ;然后重復(fù)如下過程 35 次 94°C，30s—65°C，30s — 72°C，2min ’最后 72°C，7min。步驟3，凝膠電泳檢測
制備6%的變性聚丙烯酰胺凝膠；將步驟2中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于94°C變性7min，上樣于變性聚丙烯酰胺凝膠，1500 V條件下電泳1.5 2 h;硝酸銀染色，將擴(kuò)增條帶與陽性標(biāo)準(zhǔn)條帶比較，根據(jù)條帶的大小判定是否為北京基因型菌株。其中，所述陽性標(biāo)準(zhǔn)條帶為(CCG)4CCT(CCG)4TCG在相同條件下下PCR擴(kuò)增和電泳標(biāo)準(zhǔn)條帶。如果擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)條帶大小相同，則為北京基因型結(jié)核分枝桿菌，如果擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)條帶大小不同，則不是北京基因型結(jié)核分枝桿菌。實(shí)施例2 步驟1，設(shè)計(jì)引物
以含有微衛(wèi)星CCG位點(diǎn)的Rv0050基因序列為模板，設(shè)計(jì)同源引物 同源引物一 5’ -TTGAAGGGCACGTCGAACGAG-3’，
同源引物二 5’ -GGGACCGATCGGGATGGTAA-3’。步驟2，PCR擴(kuò)增
提取結(jié)核分枝桿菌臨床菌株DNA為模板DNA，利用步驟I中設(shè)計(jì)的同源引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下
IOXTaq PCR 緩沖液2yLMgCl22. 5 mM
dNTPO. 2 mM
同源引物一O. 2μΜ
同源引物二O. 2μΜ
Taq DNA聚合酶IU 模板 DNAIOng
ddH20加至總體積為20 μ L
PCR 反應(yīng)條件94°C，5min— (94°C，30s—65°C，30s—72°C，2min) X 35 個循環(huán)一72°C，7min。即:首先 94°C，5min ;然后重復(fù)如下過程 35 次 94°C，30s—65°C，30s — 72°C，2min ’最后 72°C，7min。步驟3，測序檢測
將步驟2中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測序，獲得PCR擴(kuò)增片段的核酸序列，根據(jù)其中含有的CCG簡單串聯(lián)重復(fù)序列形態(tài)是否為(CCG)4 CCT (CCG)4TCG,判定菌株是否為北京基因型菌株。如果擴(kuò)增片段中有的CCG簡單串聯(lián)重復(fù)序列形態(tài)是(CCG)4CCT (CCG)4TCG,則判定為北京基因型結(jié)核分枝桿菌，如果擴(kuò)增片段中有的CCG簡單串聯(lián)重復(fù)序列形態(tài)不是(CCG)4CCT (CCG) 4TCG，則不是北京基因型結(jié)核分枝桿菌。以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于鑒定北京基因型結(jié)核分枝桿菌的寡核苷酸序列，其特征在于，所述寡核苷酸序列包括如下CCG簡單串聯(lián)重復(fù)序列CCGCCGCCGCCGCCTCCGCCGCCGCCGTCG。
2.一種鑒定北京基因型結(jié)核分枝桿菌的方法，其特征在于，步驟包括步驟1，以含有微衛(wèi)星CCG位點(diǎn)的Rv0050基因序列為模板，設(shè)計(jì)一對同源引物；步驟2，提取待測樣品DNA為模板DNA，利用步驟I中設(shè)計(jì)的一對同源引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；步驟3，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測序獲得PCR擴(kuò)增片段的核酸序列，如果擴(kuò)增片段中有的CCG簡單串聯(lián)重復(fù)序列形態(tài)是(CCG)4CCT (CCG)4TCG,則判定為北京基因型結(jié)核分枝桿菌，如果擴(kuò)增片段中有的CCG簡單串聯(lián)重復(fù)序列形態(tài)不是(CCG)4 CCT (CCG)4TCG,則不是北京基因型結(jié)核分枝桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述一對同源引物為5，-TTGAAGGGCACGTCGAACGAG-3，；5，-GGGACCGATCGGGATGGTAA-3，。
4.一種鑒定北京基因型結(jié)核分枝桿菌的方法，其特征在于，步驟包括步驟1，以含有微衛(wèi)星CCG位點(diǎn)的Rv0050基因序列為模板，設(shè)計(jì)一對同源引物；步驟2，提取待測樣品DNA為模板DNA，利用步驟I中設(shè)計(jì)的一對同源引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，步驟3，將步驟2中得到擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳、染色，對比所述擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶與(CCG) 4CCT (CCG)4TCG在相同條件PCR擴(kuò)增和電泳標(biāo)準(zhǔn)條帶，如果擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)條帶大小相同，則為北京基因型結(jié)核分枝桿菌，如果擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)條帶大小不同，則不是北京基因型結(jié)核分枝桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述染色為硝酸銀染色。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述電泳為6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述電泳條件包括將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于94°C變性7分鐘，然后經(jīng)變性聚丙烯酰胺電泳，1500V條件下電泳1.5^2小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述一對同源引物為·5，-TTGAAGGGCACGTCGAACGAG-3，；·5，-GGGACCGATCGGGATGGTAA-3，。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于鑒定北京基因型結(jié)核分枝桿菌的分子標(biāo)識，所述分子標(biāo)識為寡核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列(CCG)4CCT(CCG)4TCG。本發(fā)明還提供了利用所述分子標(biāo)識鑒定北京基因型結(jié)核分枝桿菌的方法，該方法簡單、快速、廉價(jià)，準(zhǔn)確性高，為鑒定北京基因型結(jié)核分枝桿菌提供了一種新的有效地途徑，可用于臨床北京基因型結(jié)核分枝桿菌感染的鑒定、預(yù)防和治療北京基因型結(jié)核分枝桿菌感染結(jié)核病藥物的研發(fā)及篩選、以及北京基因型結(jié)核分枝桿菌耐藥性研究等領(lǐng)域。
文檔編號C12Q1/04GK103014134SQ20111028277
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者秦蓮花, 胡忠義, 王潔, 鄭瑞娟, 崔振玲, 麥廣良 申請人:上海市肺科醫(yī)院