專利名稱：一種鑒定結(jié)核分枝桿菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒定結(jié)核分枝桿菌的方法，尤其涉及一種通過檢測結(jié)核桿菌編碼基因Rvl508c序列來判定結(jié)核分枝桿菌的方法。
背景技術(shù)：
結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)，俗稱結(jié)核桿菌，是引起結(jié)核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺結(jié)核最為多見。結(jié)核病至今仍是一種重要的傳染病，估計世界人口中 1/3感染結(jié)核分枝桿菌。據(jù)WHO報道，每年約有800萬新病例發(fā)生，至少有300萬人死于該病，在某些發(fā)展中國家成人中結(jié)核分枝桿菌攜帶率高達(dá)80%，其中約59TlO%攜帶者可發(fā)展為活動性結(jié)核病。近二十年由于艾滋病的流行，感染了 HIV的結(jié)核分枝桿菌攜帶者，由于病毒破壞了機體的免疫功能，發(fā)展為活動性結(jié)核病的可能性比未感染HIV者高3(Γ50倍，且結(jié)核的病程發(fā)展更快。
在與患者接觸的人群中約有2(Γ30%人為結(jié)核潛伏感染者，他們身體健康并沒有臨床癥狀，也不屬于疾病狀態(tài)，細(xì)菌處于潛伏狀態(tài)中。雖然其中絕大部分人終身不會患病， 但是仍然大約會有10%的感染者會在未來若干年中發(fā)展成為活動性結(jié)核。此外結(jié)核桿菌可發(fā)生形態(tài)、菌落、毒力、免疫原性和耐藥性等變異，而且目前醫(yī)學(xué)技術(shù)仍有許多不足，依然可能存在某些未被證實的結(jié)核桿菌，因此，因此，結(jié)核桿菌的判定對提早預(yù)防結(jié)核病、以及新物種的發(fā)現(xiàn)都具有重要的意義。
傳統(tǒng)的鑒定方法為涂片鏡檢，將標(biāo)本直接涂片，用抗酸染色，若找到抗酸陽性菌， 即可初步判定為結(jié)核桿菌，但是敏感性不強，準(zhǔn)確度不高；動物實驗判定結(jié)核分枝桿菌的方法成本高；結(jié)核菌素皮試(Pro)和T細(xì)胞免疫的釋放Y-干擾素的方法(IGRA)均屬于基于細(xì) 胞免疫診斷方法，雖然法已經(jīng)廣泛使用，但只能鑒定結(jié)核疾病，目前不能用于鑒定結(jié)核桿菌。
PCR擴增方法也是目前應(yīng)用較多的判定結(jié)核桿菌的方法，該方法應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌的DNA鑒定，因此，需要找出結(jié)核桿菌中合適的用于PCR擴增的基因序列，然后設(shè)計引物進行PCR擴增和鑒定。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種通過檢測結(jié)核桿菌編碼基因Rvl508c序列來判定結(jié)核分枝桿菌的方法，通過鑒定樣品中是否含有Rvl508c序列來判定是否為結(jié)核分枝桿菌。其中，所述 Rvl508c 序列見 SEQ ID No.1。
本發(fā)明提供的鑒定結(jié)核分枝桿菌的方法，以結(jié)核桿菌編碼基因Rvl508c基因序列為檢測標(biāo)靶，鑒定樣品中是否含有所述Rvl508c序列，如果含有該序列，則判定為結(jié)核分枝桿菌，如果沒有該序列，則不是結(jié)核分枝桿菌。
鑒定Rvl508c序列的方法可以采用已有的任意DNA檢測方法實施，如PCR擴增技術(shù)，基因芯片技術(shù)或半點雜交技術(shù)等等。其中，PCR擴增技術(shù)可以是實時PCR儀進行檢測或凝膠電泳檢測。
根據(jù)本發(fā)明所述鑒定結(jié)核分枝桿菌方法的第一個優(yōu)選實施方式，步驟包括步驟1，以結(jié)核桿菌編碼基因Rvl508c基因序列為檢測靶標(biāo)，設(shè)計一對同源引物，對待測樣品DNA進行PCR擴增；步驟2，PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳以及EB染色；步驟3，擴增產(chǎn)物檢測為陽性，則判定為結(jié)核分枝桿菌；擴增產(chǎn)物為陰性，則不是結(jié)核分枝桿菌。
根據(jù)所述鑒定結(jié)核分枝桿菌方法的進一步優(yōu)選實施方式，根據(jù)Rvl508c基因序列中SEQ ID No. 2序列(SEQ ID No.1中下劃線所示序列)為檢測靶標(biāo)設(shè)計一對同源引物；所述一對同源引物優(yōu)選為正向弓I物5' -gatccccgatagcatcaaga-3'反向弓丨物5' -attggcaagacgaaaacgag-3'但也可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)Rvl508c基因序列設(shè)計其它引物。
本發(fā)明上述的鑒定結(jié)核分枝桿菌方法第一個優(yōu)選實施方式，其中，所述PCR擴增反應(yīng)體系包括Taq緩沖液、2. 5mM濃度MgCl2,0. 2mM濃度dNTP，引物濃度均為O. 2 μ M，IU Taq NDA聚合酶，IOng模板DNA,加入ddH20至總體積為20 μ L。
本發(fā)明上述鑒定結(jié)核分枝桿菌方法第一個優(yōu)選實施方式，其中，所述PCR擴增反應(yīng)條件為940C，5min— (94°C，Imin-65°C，30s—72°C，lmin) X 35 個循環(huán)一72°C，IOmin,即 首先94°C, 5min ； 然后，如下過程進行35個循環(huán):94°C，lmin，再65°C，30s，再72°C，lmin ；最后72°C, IOmin0
根據(jù)本發(fā)明鑒定結(jié)核分枝桿菌的方法的第二個優(yōu)選實施方式，步驟包括步驟1，以結(jié)核桿菌編碼基因Rvl508c基因序列為檢測靶標(biāo)，設(shè)計一對同源引物以及分子探針，所述分子探針的5'和3'端分別進行熒光標(biāo)記；步驟2，利用所述同源引物和分子探針，通過實時定量PCR儀對待測樣品DNA或待測樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進行PCR擴增，并進行分析；步驟3，PCR擴增產(chǎn)物分析結(jié)果為陽性，則判定為結(jié)核分枝桿菌；PCR擴增產(chǎn)物為陰性， 則不是結(jié)核分枝桿菌。
本發(fā)明所述鑒定結(jié)核分枝桿菌的方法的進一步優(yōu)選實施方式，根據(jù)Rvl508c基因序列中SEQ No. 2為檢測靶標(biāo)設(shè)計一對同源引物和分子探針。
其中，所述一對同源引物優(yōu)選為正向弓I物5' -gatccccgatagcatcaaga-3'反向弓丨物5' -attggcaagacgaaaacgag-3'其中，所述分子探針可以是Taqman探針、MGB探針等，所述分子探針優(yōu)選為所述分子探針5'端有6個熒光標(biāo)記基團；3'端進行C-MGB標(biāo)記，其中，C為3'端熒光標(biāo)記基團。
所述分子探針進一步優(yōu)選為5'- 6A-tcgggtttgctgtcctagtc-B-C-3'。
所述分支探針中,A為5'端突光標(biāo)記,如FAM突光素；C為3'端突光標(biāo)記,如NFQ 熒光素為實時定量標(biāo)記，如A可以是，B可以是MGB標(biāo)記，C可以是NFQ熒光素。
但也可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)Rvl508c基因序列設(shè)計其它引物和分子探針。
本發(fā)明上述鑒定結(jié)核分枝桿菌方法的第二個優(yōu)選實施方式，其中，所述PCR反應(yīng)體系包括每15ul含同源引物各500nM，探針濃度為200nM，待測樣品DNA或cDNA模板 10ng。反應(yīng)試劑優(yōu)選為 IyL TaqMan Universal PCR Master Mix。
本發(fā)明上述鑒定結(jié)核分枝桿菌方法的第二個優(yōu)選實施方式，其中，所述PCR反應(yīng)條件為 95°C，IOmin —(92°C，15s — 65°C，lmin) X40 個循環(huán)，即首先95°C, IOmin ；然后，如下過程進行40個循環(huán)92°C，15s，再65°C，lmin。
SEQ ID No.1 gtgattccggtgatgagcgctcgcttcactgggttcccgctcctgccggtcgctcttcgccatggcataacg tcggggcgtggctgtgggttcatcctagatgtcggtgcccagcgccctttcggcaacgacgtcctgttgtcggttgc cacgaggaagatccggtctagactgcccggcgaccgcgttggcaaccatggcgctctgctaccgtttcgcgcagaac cgaggagaatccagatgaagcgacccccggaggtgttgcgcggtg ccgtgaccgcgagccgggagcggctctgggcg atcggctcccaatccgagcgcaccctcatgctcggcaccatcctgctggcgtcggtgatttcggcggcgacggcgta cgccctcagtcagtggtacgcggtcgacgtcttttccactcttttggtagtccctggggactgttggcttgattggg gcatgaatatcggtcggcactgcttcagcgactacgccatggtcgccgccgccgggattcaacccaatcccgcggac tacctgatctcgctacccgccgattaccagccgaccgcggttgctgcatgggcccccgcccgcataccgtatgcgat tttcggactacccagccattggctgggtgcgccgcgcttggggctgatctgttacctggtcgccctaacgatggcgg tcatatctcccgccatctgggcggcccggggggcacgtggtctggagcgagtggtcatcttcgtgacactgggcgcc gcggccatcccggcgtggggggtcatcgatcgaggcaactcgacagggttcgtggtaccgatcgcgctggcttactt cgtggcgttgtcccgacagcggtggggcctcgccaccatcacggtgatcttggccgtcctggtaaagccgcagttcg tcgttctcggcgtggtgttgttggcggctcgacaatggcggtgggctggtatcgggatcaccggcgtggtggtgtcc aatatcgcagcctttctgttgtggccacgaggcttcccggggacgatcgcacagtcgatccacggcatcatcaagtt CaataRttcRttcRRaRRRcttcRaRacccRcRRaacRtRtcctttRRcaaRRcactcctRctactatcaatCRRRC aaRatcccaRaRRRtttcctcactRRtCCRCRaaCRCaRaataRtCRtRRtCRCCRtRetRRCRCtcRRacRCCRta tCCCRCCtRtcatRRtRRRRattRtRttRCtCRCCaCCRCCaCCttctCCCCCRCRRaCRtCRCCttctactatCRC tgcactggtagcccgagaccccaacgggcctcctggtgctgggatattcgaccaactcgcagcccatggagaccgcc gccgcgcggtcggcgtctgcgtgagtttggccgtggcgctgagcatcgtcaacgtcgcggtcccgggccagccgttc tacgtgccgctctatggacagctgggagccaaaggggtagtcggtaccacgccactcgttttcaccacggtgacatg ggcaccgttcttgtggttggtcacgtgcgtagtaatcatcgtctcctacgcgcgcaaacccgctcgcccacatgaca gtcacaacgggcctactcgggagagcgaccaggacaccgctgccagcaccacctcatgcttacccaatccggttgag gagtcctcaccacggggacccggcccaatctgccaaaattacaccccatagSEQ ID No. 2 tactatcaatcgggcaagatcccagagggtttcctcactggtccgcgaacgcagaatagtcgtggtcgccgt gctggcgctcggacgccgtatcccgcctgtcatggtggggattgtgttgctcgccaccgccaccttctcccccgcgg acgtcgccttctactatSEQ ID No. 2進行PCR擴增和分子標(biāo)記的序列tRatccccRataRcatcaaRaactatcaatcRRRcaaRatcccaRaRRRtttcctcactRRtCCRCRaaCRC agacgtggt cgccgt get ggcgct cggacgccgtat cccgcc tgt cat ggtggggattgtgttgctcgccaccgccaccttctcccccgcggacgtcgccttctactatctcgttttcgtcttgccaat 本發(fā)明鑒定結(jié)核分枝桿菌的方法，首先確定了結(jié)核分枝桿菌中的待測基因序列，并以該序列為標(biāo)靶設(shè)計引物(和探針)，準(zhǔn)確性好，靈敏度高，敏感性和特異性高達(dá)100%，為結(jié)核分枝桿菌的鑒定提供了一種新的方案，可用于生物菌株的鑒定、結(jié)核感染的鑒定以及藥物研發(fā)過程中藥效、以及結(jié)核桿菌耐藥性等方面的研究。
具體實施方式
本發(fā)明提供了一種鑒定結(jié)核分枝桿菌的方法，以結(jié)核桿菌編碼基因Rvl508c基因序列為檢測標(biāo)靶，鑒定樣品中是否含有所述Rvl508c序列，如果含有該序列，則判定為結(jié)核分枝桿菌，如果沒有該序列，則不是結(jié)核分枝桿菌。
鑒定Rvl508c序列的方法可以采用已有的任意DNA檢測方法實施，如PCR擴增技術(shù)，基因芯片技術(shù)或半點雜交技術(shù)等等。其中，PCR擴增技術(shù)可以是實時PCR儀進行檢測或凝膠電泳檢測。
PCR技術(shù)為例，下面通過基團實施例對本發(fā)明鑒定結(jié)核分枝桿菌的方法進行詳細(xì)的介紹和描述，以使更好的理解本發(fā)明，但下述實施例并不限制本發(fā)明范圍。
實施例1 步驟1，設(shè)計引物 以SEQ ID No. 2為標(biāo)靶設(shè)計一對同源引物如下正向弓I物5' -gatccccgatagcatcaaga-3'反向弓丨物5' -attggcaagacgaaaacgag-3'步驟2，PCR擴增提取臨床菌株NDA作為模板DNA，利用步驟I中設(shè)計的同源引物進行PCR擴增，擴增體系如下IOXTaq PCR 緩沖液2yLIU Taq DNA 聚合酶IUMgCl22. 5mMdNTP 溶液O. 2mM正向引物0.2μΜ反向引物0.2μΜ模板 DNAIOngddH20加至總體積為20 μ L擴增條件94°C,5min— (94 °C, lmin—65 °C, 30s—72 °C, lmin) X35 個循環(huán)一72 °C， IOmin步驟3，凝膠電泳將步驟3中的擴增產(chǎn)物進行2%凝膠電泳和EB染色。
凝膠電泳和EB染色均可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)已有知識采用現(xiàn)有技術(shù)實施。
步驟4，判定結(jié)核分枝桿菌經(jīng)步驟3凝膠電泳和EB染色，擴增產(chǎn)物為陽性，則判定為結(jié)核分枝桿菌，如果擴增產(chǎn)物為陰性，則不是結(jié)核分枝桿菌。
實施例2步驟1，設(shè)計引物和分子探針以SEQ ID No. 2為標(biāo)靶設(shè)計一對同源引物和分子探針，正向弓I物5' -gatccccgatagcatcaaga-3'反向弓丨物5' -attggcaagacgaaaacgag-3'分子探針5' - 6FAM-tcgggtttgctgtcctagtc-MGB-NFQ-3'步驟2，PCR擴增提取臨床標(biāo)本的DNA作為模板DNA，利用步驟I中設(shè)計的同源引物和分子探針通過實時 PCR儀擴增分析，擴增體系如下反應(yīng)試劑TaqMan Universal PCR Master Mix IuL 分子探針20nM正向引物500 nM反向引物500 nM模板 DNAIOng總體積15 μ L擴增條件95°C, IOmin- (92°C，15s — 65°C，lmin) X40 個循環(huán)步驟3,判定結(jié)核分枝桿菌 經(jīng)步驟3中實施PCR儀進行分析，擴增產(chǎn)物為陽性，則判定為結(jié)核分枝桿菌，如果擴增產(chǎn)物為陰性，則不是結(jié)核分枝桿菌。
實施例3步驟1，設(shè)計引物和分子探針以SEQ ID No. 2為標(biāo)靶設(shè)計一對同源引物和分子探針，正向弓I物5' -gatccccgatagcatcaaga-3'反向弓丨物5' -attggcaagacgaaaacgag-3'分子探針5' - 6FAM-tcgggtttgctgtcctagtc-MGB-NFQ-3'步驟2，PCR擴增提取臨床標(biāo)本的RNA，并將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板DNA，利用步驟I中設(shè)計的同源引物和分子探針通過實時PCR儀擴增分析，擴增體系如下反應(yīng)試劑TaqMan Universal PCR Master Mix IuL 分子探針20nM正向引物500 nM反向引物500 nM模板 DNAIOng總體積15 μ L擴增條件95°C, IOmin- (92°C，15s — 65°C，lmin) X40 個循環(huán)步驟3,判定結(jié)核分枝桿菌經(jīng)步驟3中實施PCR儀進行分析，擴增產(chǎn)物為陽性，則判定為結(jié)核分枝桿菌，如果擴增產(chǎn)物為陰性，則不是結(jié)核分枝桿菌。
通過上述描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，本發(fā)明也可以采用基因芯片的方法進行判定結(jié)核分枝桿菌。
以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本 發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種鑒定結(jié)核分枝桿菌的方法，其特征在于，步驟包括步驟1，以結(jié)核桿菌編碼基因Rvl508c基因序列為檢測靶標(biāo)，設(shè)計一對同源引物，對待測樣品DNA進行PCR擴增；步驟2，PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳以及EB染色；步驟3，擴增產(chǎn)物檢測為陽性，則判定為結(jié)核分枝桿菌；擴增產(chǎn)物為陰性，則不是結(jié)核分枝桿菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，根據(jù)Rvl508c基因序列中SEQID No. 2為檢測靶標(biāo)設(shè)計一對同源引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增反應(yīng)體系包括Taq PCR緩沖液、2. 5mM濃度MgCl2,0. 2mM濃度dNTP,所述同源引物濃度均為O. 2 μ M,IU濃度的Taq NDA聚合酶，IOng模板DNA，加入ddH20至總體積為20 μ L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增反應(yīng)條件為首先94°C, 5min ；然后，如下過程進行35個循環(huán):94°C，lmin，再65°C，30s，再72°C，lmin ；最后72°C, IOmin0
5.一種鑒定結(jié)核分枝桿菌的方法，其特征在于，步驟包括步驟1，以結(jié)核桿菌編碼基因Rvl508c基因序列為檢測靶標(biāo)，設(shè)計一對同源引物以及分子探針，所述分子探針的5'和3'端分別進行熒光標(biāo)記；步驟2，利用所述同源引物和分子探針，通過實時定量PCR儀對待測樣品DNA或RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進行PCR擴增，并進行分析；步驟3，PCR擴增產(chǎn)物分析結(jié)果為陽性，則判定為結(jié)核分枝桿菌；PCR擴增產(chǎn)物為陰性，則不是結(jié)核分枝桿菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，根據(jù)Rvl508c基因序列中SEQID No. 2為檢測靶標(biāo)設(shè)計一對同源引物和分子探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述分子探針5'端有6個熒光標(biāo)記基團；3 ^端進行C-MGB標(biāo)記，其中，C為:V端熒光標(biāo)記基團。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)體系包括每15ul含同源引物各500nM，探針濃度為200nM，待測樣品DNA或cDNA模板10ng。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)條件為首先95°C, IOmin ；然后，如下過程進行40個循環(huán)921，158，再651，lmin。
10.一種鑒定結(jié)核分枝桿菌的方法，其特征在于，以結(jié)核桿菌編碼基因Rvl508c基因序列為檢測標(biāo)靶，鑒定樣品中是否含有所述Rvl508c序列，如果含有該序列，則判定為結(jié)核分枝桿菌，如果沒有該序列，則不是結(jié)核分枝桿菌。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種鑒定結(jié)核分枝桿菌的方法，首先以結(jié)核桿菌編碼基因Rv1508c序列為待測基因序列，并以該序列為檢測靶標(biāo)設(shè)計引物(和探針)進行檢測，本發(fā)明方法準(zhǔn)確性好，靈敏度高，為結(jié)核分枝桿菌的鑒定提供了一種新的方案，可用于生物菌株的鑒定、結(jié)核感染的鑒定以及藥物研發(fā)過程中藥效、以及結(jié)核桿菌耐藥性等方面的研究。
文檔編號C12Q1/68GK103014135SQ20111028278
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者秦蓮花, 胡忠義, 鄭瑞娟 申請人:上海市肺科醫(yī)院