專利名稱：鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的pcr引物對及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對及其應(yīng)用，特別涉及可以鑒定或輔助鑒定牛、羊、豬、雞和鴨這五種動(dòng)物中至少一種動(dòng)物的組織和/或器官的 PCR引物對。
背景技術(shù)：
目前在國內(nèi)生肉和肉制品的生產(chǎn)和銷售領(lǐng)域，一些不法商販為了牟取暴利，利用摻雜摻假等手段欺騙消費(fèi)者的事件時(shí)有發(fā)生。比如用豬肉冒充羊肉、豬肉冒充牛肉以及用雞肉或鴨肉冒充其它價(jià)格較高肉類等。因此一套快速、準(zhǔn)確鑒別肉種類，并且能夠適應(yīng)混合肉制品鑒定的方法，無疑會為執(zhí)法人員提供了強(qiáng)大的技術(shù)支撐。傳統(tǒng)的肉制品鑒定的方法主要是基于蛋白質(zhì)水平的分析，包括電泳法、免疫法、 ELISA等技術(shù)。操作過程中首先需制備相應(yīng)物種的抗體，然后抗原和抗體間進(jìn)行免疫反應(yīng)， 最后通過電泳或者顯色等方法進(jìn)行鑒別。這類鑒別技術(shù)受蛋白質(zhì)(主要起作用的部分為抗原決定簇)結(jié)構(gòu)的影響很大，實(shí)際應(yīng)用中經(jīng)常出現(xiàn)的問題包括1.熱加工過程會改變蛋白質(zhì)(抗原決定簇)的結(jié)構(gòu)，因而無法檢測熱加工的肉類；2.對混合肉類的檢測可能出現(xiàn)交叉反應(yīng)，因?yàn)椴煌锓N蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可能具有某種程度的相似性，檢驗(yàn)的靈敏程度取決于制備的抗體的特異性強(qiáng)弱?；谝陨显颍院怂釣榛A(chǔ)的檢測方法成為近幾年食品檢測領(lǐng)域的發(fā)展方向， 包括DNA分子雜交法和PCR方法等。DNA分子雜交法操作復(fù)雜，且成本較高，目前已逐漸被 PCR方法所取代。PCR方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，可對混合肉類進(jìn)行鑒別和區(qū)分，即使摻雜少量異種肉，也能用PCR方法加以鑒別；PCR方法可用于熱加工的肉制品鑒別當(dāng)中，高溫過程僅僅打斷了核酸的片斷，并不會完全降解核酸，因而熱加工的肉制品當(dāng)中仍然存在可擴(kuò)增的模板，這在飼料工業(yè)肉骨粉來源的鑒別過程中得到了很好的證實(shí)；PCR反應(yīng)的迅速，結(jié)果易于觀測，使得這種檢測方法目前廣泛應(yīng)用在飼料、保健品的動(dòng)物源性成分的鑒別當(dāng)中。目前，也有使用PCR方法進(jìn)行牛、羊、豬、雞、鴨等肉類鑒別的報(bào)道，但普遍著重于單個(gè)肉種，系統(tǒng)性較差；即使將方法整合，在PCR鑒別過程中，不同肉種的退火溫度同一性較差，需要進(jìn)行多個(gè)退火溫度，進(jìn)行不同PCR反應(yīng)才能進(jìn)行判斷。PCR技術(shù)中，引物設(shè)計(jì)是PCR成功的關(guān)鍵因素，好的引物將使檢測實(shí)驗(yàn)更加快捷，
結(jié)果更加清晰。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對或引物對組合物，以及利用所述引物對或引物對組合物鑒定待測動(dòng)物組織和/或器官中是否含有牛、羊、豬、雞和鴨這五種動(dòng)物中至少一種動(dòng)物的組織和/或器官的方法。本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對既可為鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對，也可為在含有鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對的前提下，再含有鑒定或輔助鑒定豬、牛、羊、雞、鴨組織和/或器官的5個(gè) PCR引物對中其余四個(gè)引物對中的全部、或任意三對、或任意兩對、或任一對形成的引物對組合物。具體分為如下五種1、鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對組合物，由獨(dú)立包裝的五個(gè)引物對組成，第一對引物是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對，第二對引物是由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對，第三對引物是由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的 PCR引物對，第四對引物是由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對，第五對引物是由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的PCR引物對；所述動(dòng)物為牛、羊、 豬、雞、鴨中的至少一種。2、鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對組合物，由獨(dú)立包裝的四個(gè)引物對組成，其中一個(gè)引物對是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對，另外三個(gè)引物對為下述四個(gè)引物對中的任三個(gè)由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/ 或器官的PCR引物對、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的PCR引物對；所述動(dòng)物為牛、羊、 豬、雞、鴨中的至少一種。3、鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對組合物，由獨(dú)立包裝的三個(gè)引物對組成，其中一個(gè)引物對是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對，另外二個(gè)引物對為下述四個(gè)引物對中的任二個(gè)由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/ 或器官的PCR引物對、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的PCR引物對；所述動(dòng)物為牛、羊、 豬、雞、鴨中的至少一種。4、鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對組合物，由獨(dú)立包裝的二個(gè)引物對組成，其中一個(gè)引物對是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對，另外一個(gè)引物對為下述四個(gè)引物對中的任一個(gè)由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/ 或器官的PCR引物對、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的PCR引物對；所述動(dòng)物為牛、羊、豬、雞、鴨中的至少一種。上述1中所述五個(gè)引物對在PCR反應(yīng)體系中的配比為1 :1:1:1: 1 ；上述2 中所述四個(gè)引物對在PCR反應(yīng)體系中的配比為1 :1:1: 1 ；上述3中所述三個(gè)引物對在PCR反應(yīng)體系中的配比為1 1 1 ；上述4中所述二個(gè)引物對在PCR反應(yīng)體系中的配比為1 1。5、鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對，由兩條單鏈DNA組成，所述兩條DNA單鏈分別為序列表中序列1所示的單鏈DNA，和序列表中序列2所示的單鏈DNA。其中，序列表中的序列1由M個(gè)核苷酸組成，序列2由沈個(gè)核苷酸組成，序列3 由M個(gè)核苷酸組成，序列4由22個(gè)核苷酸組成，序列5由22個(gè)核苷酸組成，序列6由觀個(gè)核苷酸組成，序列7由22個(gè)核苷酸組成，序列8由22個(gè)核苷酸組成，序列9由沈個(gè)核苷酸組成，序列10由21個(gè)核苷酸組成。上述動(dòng)物組織和/或器官可來源于豬、牛、羊、雞和鴨這五種動(dòng)物中任一種動(dòng)物組織和/或器官，也可以來源于豬、牛、羊、雞和鴨這五種動(dòng)物中的任兩種、任三種、任四種或五種動(dòng)物的混合組織和/或器官。含有上述引物對組合物或單獨(dú)的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。為了提高上述試劑盒的準(zhǔn)確性，所述試劑盒除含有上述引物對組合物或單獨(dú)的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對外，還含有限制性內(nèi)切酶，所述限制性內(nèi)切酶為EcoR I和/或Hind III ；所述動(dòng)物為牛、羊、豬、雞、鴨中的至少一種。由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和 /或器官的PCR引物對，可PCR擴(kuò)增獲得豬肉線粒體腺苷三磷酸酶VI亞基和VIII亞基基因的基因片段(如序列表中序列11和序列12所示)，該基因片段共有611個(gè)核苷酸，其中前M位和后沈位分別為序列表中序列1和序列2所示上下游引物，第133-138位是Hind III的識別序列。由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和 /或器官的PCR引物對，可PCR擴(kuò)增獲得牛肉線粒體DNA細(xì)胞色素C氧化酶II亞基基因的基因片段(如序列表中序列13和序列14所示)，該基因片段共有494個(gè)核苷酸，其中前M 位和后22位分別為序列表中序列3和序列4所示上下游引物，第沈3-268位是Hind III 的識別序列。由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和 /或器官的PCR引物對，可PCR擴(kuò)增獲得羊肉線粒體DNA細(xì)胞色素B基因的基因片段(如序列表中序列15和序列16所示)，該基因片段共有716個(gè)核苷酸，其中前22位和后觀位分別為序列表中序列5和序列6所示上下游引物，第253-258位是EcoRI的識別序列。由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和 /或器官的PCR引物對，可PCR擴(kuò)增獲得雞肉線粒體DNA腺苷三磷酸合成酶VI亞基和VIII 亞基基因的基因片段(如序列表中序列17和序列18所示)，該基因片段共有259個(gè)核苷酸，其中前22位和后22位分別為序列表中序列7和序列8所示上下游引物，第97-102位是Hind III的識別序列。由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的PCR弓丨物對，可PCR擴(kuò)增獲得鴨肉線粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶亞基III基因的基因片段(如序列表中序列19和序列20所示)，該基因片段共有350個(gè)核苷酸，其中前沈位和后21位分別為序列表中序列9和序列10所示上下游引物，第173-178位是Hind III 的識別序列。本發(fā)明所提供的引物對組合物或引物對的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該制備方法具體可包括將所述引物對組合物或引物對中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝的步驟。上述鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的試劑盒的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該制備方法具體可包括如下步驟上述引物對組合物或引物對中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種物質(zhì)包裝在同一試劑盒內(nèi)PCR 反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP (dATP，dTTP，dCTP和dGTP)和限制性內(nèi)切酶，所述限制性內(nèi)切酶為Hind III和/或EcoR I。所述動(dòng)物為豬、牛、羊、雞和鴨中至少一種。利用所述引物對組合物或引物對，或所述PCR試劑盒鑒定或輔助鑒定待測動(dòng)物組織和/或器官中是否含有牛、羊、豬、雞和鴨這五種動(dòng)物中至少一種動(dòng)物組織和/或器官的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，利用所述引物對組合物或引物對的鑒定或輔助鑒定待測動(dòng)物組織和/或器官中是否含有牛、羊、豬、雞和鴨這五種動(dòng)物中至少一種動(dòng)物組織和/或器官的方法包括下述1)和2)的步驟1)在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，以待測動(dòng)物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用上述四種引物對組合物中的任一種組合物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；2)檢測步驟1)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有哪種或哪些動(dòng)物組織和/或器官如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是580-640bp，如611bp的DNA片段，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有豬組織和/ 或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是460-520bp，如494bp的DNA片段，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有牛組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是690-750bp，如 716bp的DNA片段，所述的DNA片段待測動(dòng)物組織和/或器官中含有羊組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是230480bp，如259bp的DNA片段，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有雞組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是330-380bp，如350bp的DNA 片段，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有鴨組織和/或器官。所述檢測所得到的PCR產(chǎn)物大小的方法是將所得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示580-640bp之間的一條帶，如611bp，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有豬組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示460-520bp之間的一條帶，如494bp，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有牛組織和 /或器官；如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示690-750bp之間的一條帶，如716bp， 所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有羊組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示230480bp之間的一條帶，如259bp，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有雞組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示330-380bp之間的一條帶，如 350bp，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有鴨組織和/或器官。
所述待測動(dòng)物組織和/或器官來源于下述動(dòng)物中的至少一種牛、羊、豬、雞、鴨。利用所述PCR試劑盒的鑒定或輔助鑒定待測動(dòng)物組織和/或器官中是否含有牛、 羊、豬、雞和鴨這五種動(dòng)物中至少一種動(dòng)物組織和/或器官的方法，包括下述a)和c)的步驟a)在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，以待測動(dòng)物組織和/或器官的基因組DNA為模板， 選用60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，所述試劑盒中的引物對組合物或引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增；b)檢測步驟a)得到的PCR產(chǎn)物的大小，根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測動(dòng)物組織和/ 或器官中含有哪種或哪些動(dòng)物組織和/或器官的方法同上；c)對經(jīng)步驟b)檢測的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，所述酶切鑒定的步驟及確定所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有哪種或哪些動(dòng)物組織和/或器官的方法為下述中的至少一種cl)將所述大小是580-640bp，如611bp的DNA片段用HindIII進(jìn)行酶切鑒定，如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被Hind III酶切為100_200bp和450_550bp的兩個(gè)片段，如135bp 和476bp，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有豬組織和/或器官；c2)將所述大小為460-520bp，如494bp的DNA片段用Hind III進(jìn)行酶切鑒定的步驟，如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被Hind III酶切為200-300bp的兩個(gè)片段，如^^p和229bp， 所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有牛組織和/或器官；c3)將所述大小為690_750bp，如716bp的DNA片段用EcoR I進(jìn)行酶切鑒定的步驟，如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被EcoR I酶切為200-300bp和400-500bp的兩個(gè)片段，如 255bp和461bp，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有羊組織和/或器官；c4)將所述大小為230480bp，如259bp的DNA片段用Hind III進(jìn)行酶切鑒定的步驟，如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被Hind III酶切為50_100bp和150_200bp的兩個(gè)片段，如 99bp和160bp，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有雞組織和/或器官；c5)將所述大小為330-380bp，如350bp的DNA片段用Hind III進(jìn)行酶切鑒定的步驟，如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被Hind III酶切為150_200bp的兩個(gè)片段(根據(jù)實(shí)際電泳分辨率，可能重疊為一條條帶)，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有鴨組織和/或器官。所述待測動(dòng)物組織和/或器官來源于下述動(dòng)物中的至少一種牛、羊、豬、雞、鴨。所述待測動(dòng)物組織和/或器官具體可為結(jié)締組織(如血液)、肌肉組織。本發(fā)明的牛、羊、豬、雞、鴨特異性引物，均選用了 62°C的退火溫度，實(shí)現(xiàn)了在同一溫度一次PCR完成所有鑒別。同時(shí)，PCR產(chǎn)物的酶切鑒定，進(jìn)一步增強(qiáng)了檢測的精確度。本發(fā)明的檢測方法特異性強(qiáng)，能鑒別摻雜牛、羊、豬、雞和/或鴨的組織和/或器官。整個(gè)結(jié)果清晰、可信度高。本發(fā)明的方法檢測過程耗時(shí)短，從提取基因組到酶切結(jié)束，最短僅需要8 小時(shí)的時(shí)間(樣品數(shù)量多時(shí)酌情延長)。


圖1為民豬、小耳豬、黃牛、水牛、山羊、綿羊、原雞、土雞、北京鴨、紹興鴨10種肉類基因組的提取結(jié)果。從左至右的十一條泳道分別為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL15000，民豬、小耳豬、 黃牛、水牛、山羊、綿羊、原雞、土雞、北京鴨、紹興鴨的基因組電泳圖。
圖2為豬特異引物PCR檢測民豬、小耳豬、黃牛、水牛、山羊、綿羊、原雞、土雞、北京鴨、紹興鴨肌肉樣品結(jié)果。從左至右的十一條泳道分別為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)lOObpLadder，民豬、小耳豬、黃牛、水牛、山羊、綿羊、原雞、土雞、北京鴨、紹興鴨的PCR結(jié)果。圖3為牛特異引物PCR檢測民豬、小耳豬、黃牛、水牛、山羊、綿羊、原雞、土雞、北京鴨、紹興鴨肌肉樣品結(jié)果。從左至右的十一條泳道分別為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)lOObpLadder，民豬、小耳豬、黃牛、水牛、山羊、綿羊、原雞、土雞、北京鴨、紹興鴨的PCR結(jié)果。圖4為羊特異引物PCR檢測民豬、小耳豬、黃牛、水牛、山羊、綿羊、原雞、土雞、北京鴨、紹興鴨肌肉樣品結(jié)果。從左至右的十一條泳道分別為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)lOObpLadder，民豬、小耳豬、黃牛、水牛、山羊、綿羊、原雞、土雞、北京鴨、紹興鴨的PCR結(jié)果。圖5為雞特異弓丨物PCR檢測民豬、小耳豬、黃牛、水牛、山羊、綿羊、原雞、土雞、北京鴨、紹興鴨肌肉樣品結(jié)果。從左至右的十一條泳道分別為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)50bpLadder，民豬、小耳豬、黃牛、水牛、山羊、綿羊、原雞、土雞、北京鴨、紹興鴨的PCR結(jié)果。圖6為鴨特異引物PCR檢測民豬、小耳豬、黃牛、水牛、山羊、綿羊、原雞、土雞、北京鴨、紹興鴨肌肉樣品結(jié)果。從左至右的十一條泳道分別為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)50bpLadder，民豬、小耳豬、黃牛、水牛、山羊、綿羊、原雞、土雞、北京鴨、紹興鴨的PCR結(jié)果。圖7為五個(gè)引物對組合物PCR檢測民豬、小耳豬、黃牛、水牛、山羊、綿羊、原雞、土雞、北京鴨、紹興鴨肌肉樣品結(jié)果。從左至右的十一條泳道分別為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)IOObp Ladder,民豬、小耳豬、黃牛、水牛、山羊、綿羊、原雞、土雞、北京鴨、紹興鴨的PCR結(jié)果。圖8㈧為五個(gè)引物對PCR擴(kuò)增特異性片段的酶切結(jié)果(一)。其中M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)50bp Ladder, 1 民豬肌肉的PCR產(chǎn)物，2 民豬PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果，3 小耳豬肌肉的PCR產(chǎn)物，4 小耳豬PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果，5 黃牛肌肉的PCR產(chǎn)物，6 黃牛PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果，7 水牛肌肉的PCR產(chǎn)物，8 水牛PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果，9 山羊肌肉的PCR產(chǎn)物，10 山羊PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果，11 綿羊肌肉的PCR產(chǎn)物，12 綿羊PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果。圖8(B)為五個(gè)引物對PCR擴(kuò)增特異性片段的酶切結(jié)果(二)。其中，M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)50bp Ladder, 1 原雞肌肉的PCR產(chǎn)物，2 原雞PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果，3 土雞肌肉的 PCR產(chǎn)物，4 土雞PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果，5 北京鴨肌肉的PCR產(chǎn)物，6 北京鴨PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果，7 紹興鴨肌肉的PCR產(chǎn)物，8 紹興鴨PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果。圖9為五個(gè)引物對組合物PCR檢測摻雜豬肉、牛肉、羊肉、雞肉的鴨肉樣品結(jié)果。其中，M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)IOObp Ladder, 1 五個(gè)引物對組合物PCR擴(kuò)增的摻雜0. 豬肉、牛肉、羊肉和雞肉的鴨肉，2 五個(gè)引物對組合物PCR擴(kuò)增的純鴨肉。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、檢測動(dòng)物純肌肉樣品一、制備鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對以豬肉線粒體腺苷三磷酸酶VI亞基和VIII亞基基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增該基因的引物對。上游引物的序列為5 ‘ -CAGAATCAATTGAACTCAAAACTC-3 ‘(序列表中的序列 1)，下游引物的序列為5 ‘ -TAGTGTTGATGTTGAGTAGTGCTAAT-3 ‘(序列表中的序列2)。該引物對即為鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對。該引物對擴(kuò)增民豬和小耳豬的靶序列如序列表中序列11和序列12所示。序列表中的序列11和序列12的第133-138位是Hind III的識別序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后將成為兩條片段，長度分別為135bp和476bp。以牛肉線粒體DNA細(xì)胞色素C氧化酶II亞基基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增該基因的引物對。上游引物的序列為5‘ -CGCTTGTCTTCTTAATTAGCTCAT-3‘(序列表中的序列3)， 下游引物的序列為5‘ -GTAATATAAGCCTGGACGGGAC-3‘(序列表中的序列4)。該引物對即為鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對。該引物對擴(kuò)增黃牛和水牛的靶序列如序列表中序列13和序列14所示。序列表中的序列13和序列14的第沈3-268位是Hind III的識別序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后將成為兩條片段，長度分別為265bp和229bp。以羊肉線粒體DNA細(xì)胞色素B基因?yàn)榘谢颍O(shè)計(jì)特異擴(kuò)增該基因的引物對。上游引物的序列為5 ‘ -CGGCATTCATAGGCTATGTTTT-3 ‘(序列表中的序列5)，下游引物的序列為5' -GACCGGAATGATAAGGAAATATATAATA-3'(序列表中的序列6)。該引物對即為鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對。該引物對擴(kuò)增山羊和綿羊的靶序列如序列表中序列15和序列16所示。序列表中的序列15和序列16的第253-258位是EcoR I的識別序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后將成為兩條片段，長度分別為255bp和46rtp。以雞肉線粒體DNA腺苷三磷酸合成酶VI亞基和VIII亞基基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增該基因的引物對。上游引物的序列為5' -TTATCCAACCCAAACTTCTTTC-3‘(序列表中的序列7)，下游引物的序列為5 ‘ -TTGTTTTGTGATTAGGTGGGTG-3 ‘(序列表中的序列8)。 該引物對即為鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對。該引物對擴(kuò)增原雞和土雞的靶序列如序列表中序列17和序列18所示。序列表中的序列17和序列18的第97-102 位是Hind III的識別序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后將成為兩條片段，長度分別為99bp和160bp。以鴨肉線粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶亞基III基因?yàn)榘谢颍O(shè)計(jì)特異擴(kuò)增該基因的弓I物對。上游弓I物的序列為5 ‘ -ATGTGATTCCACTACAACTCATCTAT-3 ‘(序列表中的序列 9)，下游引物的序列為5 ‘ -TGGTGGGCTCATGTGACAGTT-3 ‘(序列表中的序列10)。該引物對即為鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的PCR引物對。該引物對擴(kuò)增北京鴨和紹興鴨的靶序列如序列表中序列19和序列20所示。序列表中的序列19和序列20的第173-178位是 Hind III的識別序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后將成為兩條片段，長度相差小于^p，在2%瓊脂糖凝膠電泳中不能明顯區(qū)分，電泳結(jié)果應(yīng)顯示為一條帶。二、檢測動(dòng)物純肌肉樣品1、檢測樣品的制備該實(shí)驗(yàn)中的樣品均是純肌肉，分別是黃牛、水牛、山羊、綿羊、民豬、小耳豬、原雞、 土雞、北京鴨、紹興鴨肌肉樣品。2、利用步驟一的引物對PCR擴(kuò)增線粒體基因組上的相關(guān)基因片段1)樣品基因組的提取使用北京全式金生物技術(shù)有限公司Easy Pure Genomic DNA Extraction Kit (貨號EE101-01)提取步驟1中樣品的基因組DNA。結(jié)果表明，步驟1中的所有樣品使用該試劑盒均能有效提取到基因組，提取的數(shù)量在電泳檢測時(shí)可見(如圖1)，足夠用作PCR反應(yīng)的模板。2)單重PCR和五重PCR反應(yīng)及電泳檢測
11
分別以上述步驟1中各個(gè)樣品的基因組DNA為模板，利用如下五個(gè)引物對或者是所述五個(gè)引物對的組合物進(jìn)行單重PCR和五重PCR 由序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA 組成的用于鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的引物對；由序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的用于鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的引物對；由序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的用于鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的引物對；由序列7和序列8 所示的兩條單鏈DNA組成的用于鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的引物對；由序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的用于鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的引物對。其中，單個(gè)引物對的PCR體系10XBuffer 2. 0 μ L(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號DR001A)，dATP, dTTP, dCTP和dGTP各2. 5mM的4種dNTP混合物(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D4030)2.0yL，濃度為20 μ M的上游引物l.OyL，濃度為 20 μ M的下游引物1. 0 μ L，模板(總DNA) 2. 0 μ L, 5U/ μ L的Taq DNA聚合酶(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號DR001A) 0. 5 μ L，加雙蒸水至20 μ L。其中，當(dāng)上游引物為序列1時(shí)，下游引物為序列2，此時(shí)PCR體系為擴(kuò)增豬基因的 PCR體系；當(dāng)上游引物為序列3時(shí)，下游引物為序列4，此時(shí)PCR體系為擴(kuò)增?；虻腜CR體系；當(dāng)上游引物為序列5時(shí)，下游引物為序列6，此時(shí)PCR體系為擴(kuò)增羊基因的PCR體系；當(dāng)上游引物為序列7時(shí)，下游引物為序列8，此時(shí)PCR體系為擴(kuò)增雞基因的PCR體系；當(dāng)上游引物為序列9時(shí)，下游引物為序列10，此時(shí)PCR體系為擴(kuò)增鴨基因的PCR體系。五個(gè)引物對組合物的PCR體系10XBuffer 2. 0 μ L(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號DR001A)，dATP, dTTP, dCTP和dGTP各2. 5mM的4種dNTP混合物(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D4030) 2.0 μ L，濃度為20 μ M的上游引物(序列1、3、5、7和 9所示單鏈DNA)各1. 0 μ L，濃度為20 μ M的下游引物(序列2、4、6、8和10所示單鏈DNA) 各1. O μ L，模板(總DNA) 2. OyL, 5U/ μ L的Taq DNA聚合酶(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號DR001A) 0. 5 μ L，加雙蒸水至20 μ L。PCR 程序:95°C, IOmin 預(yù)變性；95°C, 30s, 62 "C，30s, 72 "C，45s,擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；72°C，延伸5min ；4°C，保溫結(jié)束。將PCR反應(yīng)獲得的產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳濃度為2%。3、純肌肉樣品的PCR結(jié)果電泳檢測結(jié)果顯示(1)采用由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中民豬和小耳豬的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物中得到一條大小580-640bp的條帶(圖2)，其它黃牛、水牛、山羊、綿羊、原雞、土雞、北京鴨、紹興鴨肌肉樣品中沒有該條帶。說明豬特異引物專一性非常好，與其他動(dòng)物沒有交叉反應(yīng)；沒有非特異的雜帶產(chǎn)生。⑵采用由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈 DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中黃牛和水牛的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中得到一條大小460-520bp的條帶(圖3)，其它民豬、小耳豬、山羊、綿羊、 原雞、土雞、北京鴨、紹興鴨肌肉樣品中沒有該條帶。說明牛特異引物專一性非常好，與其他動(dòng)物沒有交叉反應(yīng)；沒有非特異的雜帶產(chǎn)生。⑶采用由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中山羊和綿羊的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中得到一條大小690-750bp的條帶(圖4)，其它民豬、小耳豬、黃牛、水牛、原雞、土雞、北京鴨、紹興鴨肌肉樣品中沒有該條帶。說明羊特異引物專一性非常好，與其他動(dòng)物沒有交叉反應(yīng)；沒有非特異的雜帶產(chǎn)生。(4)采用由序列表中序列7和序列 8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中原雞和土雞的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中得到一條大小230480bp的條帶(圖5)，其它民豬、 小耳豬、黃牛、水牛、山羊、綿羊、北京鴨、紹興鴨肌肉樣品中沒有該條帶。說明雞特異引物專一性非常好，與其他動(dòng)物沒有交叉反應(yīng)；沒有非特異的雜帶產(chǎn)生。( 采用由序列表中序列 9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的PCR引物對進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中北京鴨和紹興鴨的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中得到一條大小330-380bp的條帶(圖 6)，其它民豬、小耳豬、黃牛、水牛、山羊、綿羊、原雞、土雞肌肉樣品中沒有該條帶。說明鴨特異引物專一性非常好，與其他動(dòng)物沒有交叉反應(yīng)；沒有非特異的雜帶產(chǎn)生。(6)采用五個(gè)引物對組合物在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中民豬和小耳豬的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中只有一條大小580-640bp的條帶，黃牛和水牛的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中只有一條大小460_520bp的條帶，山羊和綿羊的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中只有一條大小690-750bp的條帶，原雞和土雞的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中只有一條大小230480bp的條帶，北京鴨和紹興鴨的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中只有一條大小 330-380bp的條帶(圖7)。這一結(jié)果再次說明五種PCR引物對專一性非常好，與其他動(dòng)物沒有交叉反應(yīng)，沒有非特異的雜帶產(chǎn)生；另外，這一結(jié)果還表明，五種引物對可以同時(shí)使用， 在檢測靈敏度方面能達(dá)到與單獨(dú)使用各引物對相同的效果，引物對組合物的形式使得一次 PCR反應(yīng)完成五種肉類的檢測，大大節(jié)約了檢測時(shí)間與成本。4、酶切鑒定將PCR擴(kuò)增獲得的民豬、小耳豬、黃牛、水牛、原雞、土雞、北京鴨、紹興鴨的條帶使用Hind III進(jìn)行酶切反應(yīng)；山羊和綿羊的條帶使用EcoR I進(jìn)行酶切反應(yīng)。酶切體系10 X Buffer 1. 0 μ L，限制性內(nèi)切酶0. 5 μ L，PCR產(chǎn)物8. 5 μ L，加雙蒸水至 20μ L。其中，當(dāng)PCR產(chǎn)物為民豬、小耳豬、黃牛、水牛、原雞、土雞、北京鴨或紹興鴨的條帶時(shí)，上述IOXBuffer為與Hind III匹配使用的IOXBuffer (購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D1060A)，上述限制性內(nèi)切酶為Hind 111(購自寶生物工程(大連)有限公司， 貨號D1060A ；當(dāng)PCR產(chǎn)物為山羊和綿羊的條帶時(shí)，上述IOXBuffer為與EcoR I匹配使用的 IOXBuffer (購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D1040A)，上述限制性內(nèi)切酶為EcoR I (購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D1040A)。酶切反應(yīng)獲得的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳濃度為2%。結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增獲得的民豬、小耳豬肌肉的條帶均被酶切為100_200bp和 450-550bp的兩條條帶；黃牛、水牛肌肉的條帶均被酶切為200-300bp的兩條條帶；原雞、 土雞肌肉的條帶均被酶切為50-100bp和150-200bp的兩條條帶；北京鴨、紹興鴨肌肉的條帶均被酶切為150-200bp的兩條條帶；山羊、綿羊肌肉的條帶均被酶切為200-300bp和 400-500bp的兩條條帶(圖8)。說明PCR產(chǎn)物符合最初的設(shè)計(jì)，不是非特異性擴(kuò)增的結(jié)果， 說明PCR反應(yīng)結(jié)果真實(shí)有效。5、測序驗(yàn)證將民豬、小耳豬肌肉的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果表明民豬(序列表中的序列11)和小耳豬(序列表中的序列12) PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中家豬AP0034^. 1基因腺苷酸磷酸酶VI亞基和VIII亞基片段的序列同源性達(dá)到98%以上，大小為611bp。
13
將黃牛、水牛肌肉的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果表明黃牛(序列表中的序列13)和水牛(序列表中的序列14)PCR產(chǎn)物的序列分別與NCBI數(shù)據(jù)庫中黃牛AY526085. 1和水牛NC_006^5的細(xì)胞色素C氧化酶II亞基基因片段的序列同源性達(dá)到98%以上，大小為 494bp。將山羊、綿羊肌肉的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果表明山羊(序列表中的序列15)和綿羊(序列表中的序列16)PCR產(chǎn)物的序列分別與NCBI數(shù)據(jù)庫中山羊GU068049和綿羊 AY858379. 1的細(xì)胞色素B基因片段的序列同源性達(dá)到98%以上，大小為716bp。將原雞、土雞肌肉的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果表明原雞(序列表中的序列17)和土雞(序列表中的序列18)PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中原雞AY235571. 1腺苷酸磷酸合成酶VI亞基和VIII亞基片段的序列同源性達(dá)到98%以上，大小為259bp。將北京鴨、紹興鴨肌肉的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果表明北京鴨(序列表中的序列 19)和紹興鴨(序列表中的序列20) PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中北京鴨EU755252細(xì)胞色素氧化酶亞基III基因片段的同源性達(dá)到98%以上，大小為350bp。上述實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的檢測方法特異性強(qiáng)，引物之間沒有交叉反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物符合預(yù)計(jì)的大小，且都能被設(shè)計(jì)好的限制性內(nèi)切酶切割，說明擴(kuò)增產(chǎn)物不是非特異性擴(kuò)增的結(jié)果。整個(gè)結(jié)果清晰、可信度高。實(shí)施例2檢測摻雜肌肉樣品一、制備鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對設(shè)計(jì)和制備方法同實(shí)施例1 一。二、檢測動(dòng)物肌肉樣品1、檢測樣品的制備該實(shí)驗(yàn)中的樣品是摻雜豬肉、羊肉、牛肉和雞肉的鴨肉在99. 6g北京鴨鴨肉中摻雜0. Ig民豬肉、0. Ig山羊肉、0. Ig黃牛肉和0. Ig土雞肉，制成摻雜0. 豬肉、羊肉、牛肉、 雞肉的鴨肉，同時(shí)以未摻雜的純鴨肉為對照。2、利用步驟一的引物對PCR擴(kuò)增線粒體基因組上的相應(yīng)基因片段1)樣品基因組的提取制備方法同實(shí)施例1步驟二 2。2) PCR反應(yīng)及電泳檢測以上述步驟1中摻雜豬肉、羊肉、牛肉和雞肉的鴨肉和純鴨肉的基因組DNA分別為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系為=IOXBuffer 2. 0 μ L(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號DR001A)，dATP, dTTP, dCTP和dGTP各2. 5mM的4種dNTP混合物(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D4030)2.0yL，濃度為20 μ M的上游引物(序列1、3、5、7和9所示單鏈DNA) 1.0 μ L，濃度為20 μ M的下游引物(序列2、4、6、8和10所示單鏈DNA) 1. 0 μ L，模板(總DNA) 2. OuL, 5U/ μ L的Taq DNA聚合酶(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號 DR001A) 0. 5 μ L，加雙蒸水至 20 μ L。將PCR反應(yīng)獲得的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳濃度為2%。3、摻雜動(dòng)物肌肉樣品的檢測結(jié)果電泳檢測結(jié)果顯示摻雜豬肉、羊肉、牛肉和雞肉的鴨肉樣品得到5條帶，大小分別為 230-280bp (雞)、330-380bp (鴨)、460_520bp (牛)、580_640bp (豬)、690_750bp (羊)；
14而純鴨肉中只有一條大小330-380bp (鴨)的條帶(圖9)。4、測序驗(yàn)證將如下PCR 產(chǎn)物均進(jìn)行測序230-280bp (雞)、330_380bp (鴨)、460_520bp (牛)、 580-640bp(豬)、690-750bp(羊)，結(jié)果表明民豬(序列表中的序列11)PCR產(chǎn)物的序列與 NCBI數(shù)據(jù)庫中家豬AP003^8. 1基因腺苷酸磷酸酶VI亞基和VIII亞基片段的序列同源性達(dá)到98%以上，大小為611bp ；黃牛(序列表中的序列13)PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中黃牛AY526085. 1的細(xì)胞色素C氧化酶II亞基基因片段的序列同源性達(dá)到98%以上，大小為494bp ；山羊(序列表中的序列15) PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中山羊⑶068049的細(xì)胞色素B基因片段的序列同源性達(dá)到98%以上，大小為716bp ；土雞(序列表中的序列18) PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中原雞AY235571. 1腺苷酸磷酸合成酶VI亞基和VIII亞基片段的序列同源性達(dá)到98%以上，大小為259bp ；北京鴨(序列表中的序列19) PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中北京鴨EU755252細(xì)胞色素氧化酶亞基III基因片段的序列同源性達(dá)到98%以上，大小為350bp。上述實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的檢測方法特異性強(qiáng)，能鑒別肉中是否含有豬、牛、羊、雞和鴨這五種動(dòng)物中至少一種肉類的組分，引物之間沒有交叉反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物符合預(yù)計(jì)的大小， 且都能被設(shè)計(jì)好的限制性內(nèi)切酶切割，說明擴(kuò)增產(chǎn)物不是非特異性擴(kuò)增的結(jié)果。整個(gè)結(jié)果清晰、可信度高。
權(quán)利要求
1.鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對組合物，由獨(dú)立包裝的五個(gè)引物對組成，第一對引物是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對，第二對引物是由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對，第三對引物是由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR 引物對，第四對引物是由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對，第五對引物是由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的PCR引物對；所述動(dòng)物為牛、羊、豬、 雞、鴨中的至少一種。
2.鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對組合物，為下述1)、2)或3)1)由獨(dú)立包裝的四個(gè)引物對組成，其中一個(gè)引物對是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對，另外三個(gè)引物對為下述四個(gè)引物對中的任三個(gè)由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列7和序列8 所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的PCR引物對；所述動(dòng)物為牛、羊、豬、雞、鴨中的至少一種；2)由獨(dú)立包裝的三個(gè)引物對組成，其中一個(gè)引物對是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對，另外二個(gè)引物對為下述四個(gè)引物對中的任二個(gè)由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列7和序列8 所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的PCR引物對；所述動(dòng)物為牛、羊、豬、雞、鴨中的至少一種；3)由獨(dú)立包裝的二個(gè)引物對組成，其中一個(gè)引物對是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對，另外一個(gè)引物對為下述四個(gè)引物對中的任一個(gè)由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列7和序列8 所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定鴨組織和/或器官的PCR引物對；所述動(dòng)物為牛、羊、豬、雞、鴨中的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物對組合物，其特征在于權(quán)利要求1所述五個(gè)引物對在PCR反應(yīng)體系中的配比為1 :1:1:1: 1 ；權(quán)利要求2中1)所述四個(gè)引物對在PCR 反應(yīng)體系中的配比為1 :1:1: 1 ；權(quán)利要求2中2)所述三個(gè)引物對在PCR反應(yīng)體系中的配比為1 1 1;權(quán)利要求2中3)所述二個(gè)引物對在PCR反應(yīng)體系中的配比為1 1。
4.鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對，由兩條單鏈DNA組成，所述兩條DNA單鏈分別為序列表中序列1所示的單鏈DNA，和序列表中序列2所示的單鏈DNA。
5.鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的試劑盒，其特征在于所述試劑盒含有權(quán)利要求1-4中任一所述的引物對組合物或引物對和限制性內(nèi)切酶，所述限制性內(nèi)切酶為EcoR I和/或Hind III ；所述動(dòng)物為牛、羊、豬、雞、鴨中的至少一種。
6.權(quán)利要求1-4中任一所述的引物對組合物或引物對的制備方法，其特征在于所述制備方法包括將權(quán)利要求1-4中任一所述的引物對組合物或引物對中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝的步驟。
7.權(quán)利要求5所述的PCR試劑盒的制備方法，包括如下步驟將權(quán)利要求1-4中任一所述的引物對組合物或引物對中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi)PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP和限制性內(nèi)切酶；所述限制性內(nèi)切酶為Hind III和/或EcoR I。
8.利用權(quán)利要求1-4中任一所述的引物對組合物或引物對鑒定或輔助鑒定待測動(dòng)物組織和/或器官中是否含有牛、羊、豬、雞和鴨這五種動(dòng)物中至少一種動(dòng)物組織和/或器官的方法，包括下述(1)和O)的步驟所述(1)為如下A)-E)中任一步驟A)在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，以待測動(dòng)物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權(quán)利要求1所述的引物對組合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；B)在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，以待測動(dòng)物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權(quán)利要求2中1)所述的引物對組合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；C)在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，以待測動(dòng)物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權(quán)利要求2中2、所述的引物對組合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；D)在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，以待測動(dòng)物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權(quán)利要求2中幻所述的引物對組合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；E)在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，以待測動(dòng)物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權(quán)利要求3所述的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)檢測步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有哪種或哪些動(dòng)物組織和/或器官如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是580-640bp，如611bp的DNA片段，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有豬組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是460-520bp，如494bp的DNA片段，所述待測動(dòng)物組織和 /或器官中含有牛組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是690-750bp，如716bp 的DNA片段，所述的DNA片段待測動(dòng)物組織和/或器官中含有羊組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是230480bp，如259bp的DNA片段，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有雞組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是330-380bp，如350bp的DNA片段，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有鴨組織和/或器官；所述待測動(dòng)物組織和/或器官來源于下述動(dòng)物中的至少一種牛、羊、豬、雞、鴨。
9.利用權(quán)利要求5所述的試劑盒鑒定或輔助鑒定待測動(dòng)物組織和/或器官中是否含有牛、羊、豬、雞和鴨這五種動(dòng)物中至少一種動(dòng)物組織和/或器官的方法，包括下述a)和c) 的步驟a)在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，以待測動(dòng)物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權(quán)利要求4所述試劑盒中的引物對組合物或引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增；b)檢測步驟a)得到的PCR產(chǎn)物的大小，確定所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有哪種或哪些動(dòng)物組織和/或器官，方法如權(quán)利要求7步驟( 所述；c)對經(jīng)步驟b)檢測的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，所述酶切鑒定的步驟及確定所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有哪種或哪些動(dòng)物組織和/或器官的方法為下述中的至少一種cl)將所述大小是580-640bp，如611bp的DNA片段用Hind III進(jìn)行酶切鑒定，如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被Hind III酶切為100_200bp和450_550bp的兩個(gè)片段，如135bp和 476bp，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有豬組織和/或器官；c2)將所述大小為460-520bp，如494bp的DNA片段用Hind III進(jìn)行酶切鑒定的步驟， 如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被Hind III酶切為200-300bp的兩個(gè)片段，如和229bp，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有牛組織和/或器官；c3)將所述大小為690-750bp，如716bp的DNA片段用EcoR I進(jìn)行酶切鑒定的步驟，如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被EcoR I酶切為200-300bp和400-500bp的兩個(gè)片段，如255bp和 461bp，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有羊組織和/或器官；c4)將所述大小為230480bp，如259bp的DNA片段用Hind III進(jìn)行酶切鑒定的步驟， 如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被Hind III酶切為50_100bp和150_200bp的兩個(gè)片段，如99bp 和160bp，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有雞組織和/或器官；c5)將所述大小為330-380bp，如350bp的DNA片段用Hind III進(jìn)行酶切鑒定的步驟， 如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被Hind III酶切為150_200bp的兩個(gè)片段，所述待測動(dòng)物組織和 /或器官中含有鴨組織和/或器官；所述待測動(dòng)物組織和/或器官來源于下述動(dòng)物中的至少一種牛、羊、豬、雞、鴨。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述方法，其特征在于所述檢測所得到的PCR產(chǎn)物大小的方法是將所得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示580-640bp之間的一條帶，如611bp，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有豬組織和/ 或器官；如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示460-520bp之間的一條帶，如494bp， 所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有牛組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示690-750bp之間的一條帶，如716bp，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有羊組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示230-280bp之間的一條帶，如 259bp，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有雞組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示330-380bp之間的一條帶，如350bp，所述待測動(dòng)物組織和/或器官中含有鴨組織和/或器官。
全文摘要
本發(fā)明公開了鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的引物對為鑒定或輔助鑒定牛、羊、豬、雞和鴨組織和/或器官的共五個(gè)PCR引物對中，包含鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對在內(nèi)的至少一種引物對；所述鑒定或輔助鑒定豬、牛、羊、雞和鴨組織和/或器官的共五個(gè)PCR引物對依次分別由序列表中序列1和序列2所示的兩條DNA單鏈、序列3和序列4所示的兩條DNA單鏈組成、序列5和序列6所示的兩條DNA單鏈、序列7和序列8所示的兩條DNA單鏈、序列9和序列10所示的兩條DNA單鏈組成。本發(fā)明五個(gè)引物對均選用了62℃的退火溫度，實(shí)現(xiàn)了在同一溫度一次PCR完成所有鑒別，且特異性強(qiáng)，檢測過程耗時(shí)短。
文檔編號C12N15/11GK102312003SQ201110283419
公開日2012年1月11日 申請日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者于雷, 侯東軍, 姜艷彬, 尹艷, 李通, 李穎, 楊紅菊, 王海 申請人:于雷