專利名稱：豬圓環(huán)病毒ⅱ型、豬細(xì)小病毒和豬偽狂犬病毒的多重pcr檢測及其專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種豬圓環(huán)病毒II型、豬細(xì)小病毒和豬偽狂犬病毒的多重PCR檢測及其專用引物。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒II (PCVII)，豬細(xì)小病毒(PPV)和豬偽狂犬病毒(PRV)的PCR檢測方法是目前快速檢測這三種病原的常用方法，被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室病原診斷，與病毒分離的方法相比較，PCR方法診斷更快速簡便，病毒分離相對來說時(shí)間太長，在臨床上不利于快速診斷，所以目前病毒病的實(shí)驗(yàn)室診斷主要應(yīng)用PCR/RT-PCR方法。目前有一些PCVII，PPV，PRV 的PCR試劑盒已經(jīng)商品化并投入臨床應(yīng)用。目前豬病多病毒混合感染相當(dāng)嚴(yán)重。商品化的PCVII、PPV、PRV的PCR試劑盒都是單項(xiàng)PCR，1個(gè)試劑盒1次試驗(yàn)僅能檢測一種病毒，對于混合感染了 PCVII、PPV、PRV的同份豬病料要確診病原就需要3種試劑盒并且要做3次PCR實(shí)驗(yàn)，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，檢測成本也較高，既不經(jīng)濟(jì)也不快捷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測病毒的專用引物。本發(fā)明提供的檢測病毒的專用引物，包括引物對A、引物對B和引物對C，所述弓丨物對A包括引物1和引物2，所述引物對B包括引物3和引物4，所述弓I物對C包括引物5和引物6，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。所述專用引物由引物對A、引物對B和引物對C組成，所述引物對A由引物1和引物2組成，所述引物對B由引物3和引物4組成，所述引物對C由引物5和引物6組成。所述引物對A、所述引物對B和所述引物對C可獨(dú)立包裝。所述病毒為如下3種病毒中的至少一種豬圓環(huán)病毒II、豬細(xì)小病毒(PPV)和豬偽狂犬病毒。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種制備檢測病毒的PCR試劑。本發(fā)明提供的PCR試劑，由所述的專用引物中的引物對A、引物對B、引物對C、 dNTP、DNA聚合酶和PCR緩沖液組成；所述專用引物中所述引物對A的各引物在所述PCR試劑中的終濃度各為2.0 μ M， 所述引物對B的各引物在所述PCR試劑中的終濃度0. 8 μ Μ，所述引物對C的各引物在所述PCR試劑中的終濃度1.5μΜ;每種所述dNTP在所述PCR試劑中的終濃度均為0. 2mM ；所述DNA聚合酶在所述PCR試劑中的終濃度均為0. 05U/ μ L。所述dNTP、DNA聚合酶和PCR緩沖液購自天根生化科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為
ETlOlo所述病毒為如下3種病毒中的至少一種豬圓環(huán)病毒II、豬細(xì)小病毒(PPV)和豬偽狂犬病毒。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種制備檢測病毒的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒為含有所述的PCR試劑的試劑盒。所述病毒為如下3種病毒中的至少一種豬圓環(huán)病毒II、豬細(xì)小病毒(PPV)和豬偽狂犬病毒。所述專用引物或所述試劑或所述試劑盒在檢測病毒或制備檢測檢測病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述病毒具體為如下3種病毒中的至少一種豬圓環(huán)病毒II、豬細(xì)小病毒和豬偽狂犬病毒。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種檢測或輔助檢測待測樣本病毒的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟用所述引物或所述試劑或所述試劑盒中的所述引物對A、引物對B和引物對C對待測樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，若僅得到大小為1265bp的PCR產(chǎn)物，則樣本中含有或候選含有豬圓環(huán)病毒II ；若僅得到大小為748bp的PCR產(chǎn)物，則樣本中含有或候選含有豬細(xì)小病毒；若僅得到大小為342bp的PCR產(chǎn)物，則樣本中含有或候選含有豬偽狂犬病毒；若得到大小為1265bp的PCR產(chǎn)物和大小為748bp的PCR產(chǎn)物，則樣本中含有或候選含有豬圓環(huán)病毒II和豬細(xì)小病毒；若得到大小為1265bp的PCR產(chǎn)物和大小為342bp的PCR產(chǎn)物，則樣本中含有或候選含有豬圓環(huán)病毒II和豬偽狂犬病毒；若得到大小為748bp的PCR產(chǎn)物和大小為342bp的PCR產(chǎn)物，則樣本中含有或候
選含有豬細(xì)小病毒和豬偽狂犬病毒；若得到大小為1265bp的PCR產(chǎn)物、大小為748bp的PCR產(chǎn)物和大小為342bp的 PCR產(chǎn)物，則樣本中含有或候選含有豬圓環(huán)病毒II、豬細(xì)小病毒和豬偽狂犬病毒。所述1265bp的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列7 ；所述748bp的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列8 ；所述342bp的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列9 ；所述PCR擴(kuò)增中，以待測樣本的基因組DNA為模板；所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為55°C -60°C，所述PCR擴(kuò)增的退火溫度具體為58°C ；所述檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測序。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種檢測圓環(huán)病毒II的引物對。本發(fā)明提供的引物對，由引物1和引物2組成，所述引物1和所述引物2的核苷酸序列分別為序列表中的序列1和序列2?；蛱峁┮环N檢測豬偽狂犬病毒的引物對。
本發(fā)明提供的引物對，由引物5和引物6組成，所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別為序列表中的序列5和序列6。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的豬圓環(huán)病毒II，豬細(xì)小病毒和豬偽狂犬病毒的多重PCR檢測方法，一次反應(yīng)能同時(shí)檢測出PCVII、PPV、PRV三種病毒，所用3對引物特異性較好，引物相互之間有較低的同源性及互補(bǔ)性；所述引物敏感性較好最低能檢測到DNA含量為l.Ong/ul ；所述的多重PCR方法簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、高效，并且經(jīng)過與商品試劑盒比對， 簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、高效，可以大大節(jié)約檢測時(shí)間，及時(shí)對豬的三種常見病做出診斷，而且還大大節(jié)約了檢測成本，特別適用于臨床的大量檢測，在臨床診斷上具有很好的應(yīng)用前景。


圖1為PCVII、PPV、PRV多重PCR以及單項(xiàng)PCR電泳圖結(jié)果圖2為PCVII、PPV、PRV多重PCR特異性電泳圖結(jié)果圖3為PCVII、PPV、PRV多重PCR敏感性電泳圖結(jié)果
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、圓環(huán)病毒II (PCVII)、豬細(xì)小病毒(PPV)和豬偽狂犬病毒(PRV)的多重 PCR檢測方法構(gòu)建1、引物設(shè)計(jì)在GenBank 中查出 PCVII (Genbank 號(hào) EF524528)、PPV(Genbank 號(hào) AY502114)、 PRV(Genbank號(hào)AF257079)的部分已知序列。對病毒各基因區(qū)進(jìn)行同源性分析，分別選取 PCVII的全基因，PPV的NSl基因，PRV的gB基因中的一段基因?yàn)楦鞑《緮U(kuò)增的靶序列。利用DNAMAN對上述保守區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，對設(shè)計(jì)出來的3種病毒引物利用DNAstar進(jìn)行引物二聚體分析，以避免引物之間形成穩(wěn)定的引物二聚體。選出擴(kuò)增序列為PCVII(1265bp)、 PPV(748bp)、PRV(342bp)的如下3對引物，并對每對引物擴(kuò)增序列的同源性或互補(bǔ)性進(jìn)行分析。避免它們之間有較高的同源性或互補(bǔ)性，從而確定3種病毒的多重PCR引物如下弓丨物對 A 弓丨物 1 :5，agaatccaagaagcggaccc 3，(序列 1)；弓丨物 2 :5，tcacctatgacccctatgt 3，(序列 2)；引物對 B 引物 3 :5，caggcaacagacttggaatg 3，(序列 3)；弓丨物 4 :5，ctcctccgctttgagccatc 3，(序歹Ij 4)；引物對 C 引物 5 :5，cggaggggttcgccgtgctcttca 3，(序列 5)引物 6 :5，tcttggtgtaggtgtcgttggt 3，(序列 6)2、PCR反應(yīng)條件優(yōu)化分別提取豬圓環(huán)病毒II (PCVII)、豬細(xì)小病毒(PPV)和豬偽狂犬病毒(PRV)的基因組 DNA。豬圓環(huán)病毒II(PCVII，Porcine circovirus type 2)記載在 SYBR Green I 熒光定量PCR檢測豬圓環(huán)病毒2型方法的建立，李俊，丁鵬，時(shí)建立，徐紹建，孫文博，吳家強(qiáng)，王金寶，彡中國獸醫(yī)雜志>，2010年12期，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，公眾可從山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心獲得；豬偽狂犬病毒(PRV，Pseudorabies virus)記載在1例豬偽狂犬病毒分離和鑒定， 韓勇，李文剛，項(xiàng)朝榮，高衛(wèi)科，王鑫，魏娟，《中國動(dòng)物檢疫》，2007年，第4期，公眾可從山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心獲得；豬細(xì)小病毒(PPV，Porcine parvovirus)記載在豬細(xì)小病毒的分離鑒定，李剛明， 姜天童，方雨玲，中國獸醫(yī)科技1994年第24卷第10期，公眾可從山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心獲得；分別以PCVII 基因組 DNA、PPV 基因組 DNA、PRV 基因組 DNA 和 PCVII+PPV+PRV 混合基因組DNA(體積比為1 1 1)為模板，均以引物對A、引物對B和引物對C 混合作為引物，按照如下體系和程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增體系25yL:10XPCR Buffer (Mg2+Plus) 2. 5 μ L (天根生化科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為ET101)，上下游混合引物引物對分別為引物對A(各25μΜ)2μ (終濃度各為2μΜ)、引物對B(各 25 μ Μ) 0. 8 μ L (終濃度各為0. 8 μ Μ)、引物對C (各25 μ Μ) 1. 2 μ L (終濃度各為1. 2 μ Μ)， DNA 模板 2 μ L，dNTPs (各 2. 5mM) 2 μ L (終濃度 0. 2mM)，Taq 酶(5U/ μ L) 0. 25 μ L 或(2. 5U/ μ L) 0. 5 μ L (終濃度0. 05U/ μ L)，最后用水補(bǔ)充至25 μ Lo優(yōu)化后的程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min ；94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s， 30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存。結(jié)果如圖1所示，其中1為PCVII+PPV+PRV基因組DNA，2為PCVII基因組DNA，3 為PPV基因組DNA，4為PRV基因組DNA，可以看出，1得到1265bp、748bp和342bp產(chǎn)物，2得到 1265bp，3 得到 748bp，4 得到 342bp。分別將上述PCR產(chǎn)物送去測序，結(jié)果為1265bp的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列7(PCVII的6enbank號(hào)的 EF524528的第63-1327位核苷酸)；748bp的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列8 (PPV的6enbank號(hào)的 AY502114的第207-954位核苷酸)；342bp的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列9 (PRV的6enbank號(hào)AF257079 的第468-809位核苷酸)。因此擴(kuò)增產(chǎn)物通過測序，其序列與6enBank中查出PCVII、PPV、PRV的已知序列比較，證實(shí)是目的基因。3、特異性檢測分別檢測上述涉及的PCR反應(yīng)的引物對A、B、C的特異性，方法如下1)引物對A特異性分別提取PRRSV (豬繁殖與呼吸綜合征病毒)、CSFV (豬瘟病毒)、BVDV (牛病毒性腹瀉病毒)的RNA，分別反轉(zhuǎn)錄得到PRRSV的cDNA、CSFV的cDNA、BVDV的cDNA ；豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV，Porcinereproductive and respiratory syndrome virus)記載在高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學(xué)分析，童光志，周艷君，郝曉芳，田志軍，仇華吉，彭金美，安同慶，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007年 05，公眾可從山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心獲得；豬瘟病毒(CSFV，Classic swine fever virus)記載在豬瘟病毒6SLZ株的分離與鑒定，何小兵，賈懷杰，陳國華，房永祥，李玩生，曾爽，景志忠，《中國獸醫(yī)科學(xué)》，2011年，第2 期，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室甘肅省動(dòng)物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，公眾可從山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心獲得；牛病毒性膨?qū)懖《?BVDV, Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus)記載在牛病毒性腹瀉病毒BVDV-JL株的分離與鑒定，張淑琴，郭利，冷雪，張亭亭，吳永旺，武華，《中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)》，2011年03期，公眾可從山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心獲得；分別以PRRSV 的 cDNA、CSFV 的 cDNA、BVDV 的 cDNA、PCVII 基因組 DNA、PPV 基因組 DNA、PRV基因組DNA為模板，以引物對A為引物，按照上述步驟2中的PCR體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖2的1-6所示，其中1為PCVII，2為PRRSV，3為CSFV，4為BVDV，5為PPV，6 為PRV，可以看出，只有PCVII有1265bp目的條帶，未見其他非特異性帶，說明引物對A特異性高。分別以PRRSV 的 cDNA、CSFV 的 cDNA、BVDV 的 cDNA、PCVII 基因組 DNA、PPV 基因組 DNA、PRV基因組DNA為模板，以引物對B為引物，按照上述步驟2中的PCR體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖2的7-12所示，其中7為PPV，8為PRRSV, 9為CSFV，10為BVDV, 11為PCVII， 12為PRV，可以看出，只有PPV有748bp目的條帶，未見其他非特異性帶，說明引物對B特異性高。分別以PRRSV 的 cDNA、CSFV 的 cDNA、BVDV 的 cDNA、PCVII 基因組 DNA、PPV 基因組 DNA、PRV基因組DNA為模板，以引物對C為引物，按照上述步驟2中的PCR體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖2的13-18所示，其中13為PRV，14為PRRSV, 15為CSFV，16為BVDV, 17為 PCVII，18為PPV，可以看出，只有PRV有342bp目的條帶，未見其他非特異性帶，說明引物對 C特異性高。4、敏感性檢測通過分光光度計(jì)測OD測得由步驟2得到的PCVII基因DNA的濃度為15000 μ g/ μ 1，由步驟2得到的PPV基因DNA的濃度為15000 yg/μ 1,由步驟2得到的PRV基因DNA 的濃度為10000 μ g/μ 1。分別將PCVII基因DNA、PPV基因DNA和PRV基因DNA進(jìn)行10倍系列稀釋后分別作為模板，以引物對Α、B、C為引物，按照步驟2的體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果見圖3的B所示，1-7分別為PCVII基因DNA的IO1-IO7倍稀釋的模板；8_14 分別為PPV基因DNA的IO1-IO7倍稀釋的模板；15-21分別為PRV基因DNA的IO1-IO7倍稀釋的模板；可以看出，無論哪種模板，IO4倍稀釋的模板有比較清晰地目的條帶，IO5倍稀釋的模板有比較弱的目的條帶，稀釋IO6倍及以上的模板已完全看不到目的條帶。將由步驟2得到的PCVII基因DNA、PPV基因DNA和PRV基因DNA混合(體積比為 1:1: 1)，將混合后DNA進(jìn)行10倍系列稀釋后分別作為模板，以引物對A、B、C為引物，按照步驟2的體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果見圖3的A所示，其中1-9分別為混合后的DNA的IO1-IO9倍稀釋的模板，可以看出，IO4倍稀釋的模板有比較清晰地目的條帶，IO5倍稀釋的模板有比較弱的目的條帶， 稀釋IO6倍及以上的模板已完全看不到目的條帶。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的多重PCR可以檢測到PCVII基因DNA的最小濃度為1. 5ng/y 1,PPV基因DNA的最小濃度為1.5ng/y 1，PRV基因DNA的最小濃度為l.Ong/μ 1。而多重PCV 的敏感性與單項(xiàng)PCR的敏感性無明顯差別。5、重復(fù)性對PCVII、PPV、PRV多重PCR方法進(jìn)行多次重復(fù)試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定。6、樣本檢測對106份臨床疑似病料(山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心附設(shè)獸醫(yī)院門診送檢的病死豬肝、腎、肺組織混合樣品(質(zhì)量比約為1 1 1)進(jìn)行檢測，具體如下提取106份臨床疑似病料的基因組DNA(編號(hào)為1_106)，用引物對A、B和C作為引物，按照步驟2的體系和程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1265bp的PCR產(chǎn)物(序列表中的序列7)為PCVII陽性；得到748bp的PCR產(chǎn)物(序列表中的序列8)為PPV陽性；得到342bp的PCR產(chǎn)物(序列表中的序列9)為PRV陽性。得到1265bp 和 748bp 的為 PCVII 和 PPV 陽性；得到1265bp 和 342bp 的為 PCVII 和 PRV 陽性；得到748bp和342bp的為PPV和PRV陽性；得到1265bp、748bp 和 342bp 的為 PCVII, PPV 和 PRV 陽性；均沒有1265bp、748bp 或 342bp 的為 PCVII、PPV 和 PRV 陰性；結(jié)果如下編號(hào)為1-47的得到1265bp的PCR產(chǎn)物(序列表中的序列7)為PCVII陽性(共 47 份)；編號(hào)為48-69的得到748bp的PCR產(chǎn)物(序列表中的序列8)為PPV陽性(共21 份)；編號(hào)為70-80的得到342bp的PCR產(chǎn)物(序列表中的序列9)為PRV陽性(共10 份)；編號(hào)為81-82的得到1265bp和748bp的為PCVII和PPV陽性(共2份)；編號(hào)為83-87的得到1265bp和342bp的為PCVII和PRV陽性(共42份)；編號(hào)為88-106的均沒有1265bp、748bp或342bp的擴(kuò)增，說明沒有感染PCVII、PPV 和PRV中的任一種。采用商品PCVII檢測試劑盒(北京世紀(jì)元亨)、PPV檢測試劑盒(北京世紀(jì)元亨) 以及PRV檢測試劑盒(北京世紀(jì)元亨)分別對上述106份樣品進(jìn)行單項(xiàng)PCR，結(jié)果與本發(fā)明上述的結(jié)果一致，比對結(jié)果符合率為100%。
權(quán)利要求
1.一種檢測病毒的專用引物，包括引物對A、引物對B和引物對C， 所述引物對A包括引物1和引物2，所述引物對B包括引物3和引物4， 所述引物對C包括引物5和引物6，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
2.根據(jù)權(quán)利要求2所述專用引物，其特征在于所述專用引物由引物對A、引物對B和引物對C組成，所述引物對A由引物1和引物2組成， 所述引物對B由引物3和引物4組成， 所述引物對C由引物5和引物6組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述專用引物，其特征在于所述病毒為如下3種病毒中的至少一種豬圓環(huán)病毒II、豬細(xì)小病毒和豬偽狂犬病毒。
4.一種制備檢測病毒的PCR試劑，由權(quán)利要求1-3中任一所述的專用引物中的引物對 A、引物對B、引物對C、dNTP、DNA聚合酶和PCR緩沖液組成；所述專用引物中所述引物對A的各引物在所述PCR試劑中的終濃度各為2. 0 μ M，所述引物對B的各引物在所述PCR試劑中的終濃度0. 8 μ Μ，所述引物對C的各引物在所述PCR 試劑中的終濃度1.5μΜ;每種所述dNTP在所述PCR試劑中的終濃度均為0. 2mM ； 所述DNA聚合酶在所述PCR試劑中的終濃度均為0. 05U/ μ L。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述PCR試劑，其特征在于所述病毒為如下3種病毒中的至少一種豬圓環(huán)病毒II、豬細(xì)小病毒和豬偽狂犬病毒。
6.一種制備檢測病毒的試劑盒，為含有權(quán)利要求4或5所述的PCR試劑的試劑盒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述試劑盒，其特征在于所述病毒為如下3種病毒中的至少一種 豬圓環(huán)病毒II、豬細(xì)小病毒和豬偽狂犬病毒。
8.權(quán)利要求1-3中任一所述引物或權(quán)利要求4或5所述試劑或權(quán)利要求6或7所述試劑盒在檢測病毒或制備檢測檢測病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述病毒具體為如下3種病毒中的至少一種豬圓環(huán)病毒II、豬細(xì)小病毒和豬偽狂犬病毒。
9.一種檢測或輔助檢測待測樣本病毒的方法，包括如下步驟權(quán)利要求1-3中任一所述引物或權(quán)利要求4或5所述試劑或權(quán)利要求6或7所述試劑盒中的所述引物對Α、引物對B和引物對C對待測樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，若僅得到大小為1265bp的PCR產(chǎn)物，則樣本中含有或候選含有豬圓環(huán)病毒II ； 若僅得到大小為748bp的PCR產(chǎn)物，則樣本中含有或候選含有豬細(xì)小病毒； 若僅得到大小為342bp的PCR產(chǎn)物，則樣本中含有或候選含有豬偽狂犬病毒； 若得到大小為1265bp的PCR產(chǎn)物和大小為748bp的PCR產(chǎn)物，則樣本中含有或候選含有豬圓環(huán)病毒II和豬細(xì)小病毒；若得到大小為1265bp的PCR產(chǎn)物和大小為342bp的PCR產(chǎn)物，則樣本中含有或候選含有豬圓環(huán)病毒II和豬偽狂犬病毒；若得到大小為748bp的PCR產(chǎn)物和大小為342bp的PCR產(chǎn)物，則樣本中含有或候選含有豬細(xì)小病毒和豬偽狂犬病毒；若得到大小為1265bp的PCR產(chǎn)物、大小為748bp的PCR產(chǎn)物和大小為342bp的PCR產(chǎn)物，則樣本中含有或候選含有豬圓環(huán)病毒II、豬細(xì)小病毒和豬偽狂犬病毒； 所述1265bp的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列7 ； 所述748bp的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列8 ； 所述342bp的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列9 ； 所述PCR擴(kuò)增中，以待測樣本的基因組DNA為模板；所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為55°C _60°C，所述PCR擴(kuò)增的退火溫度具體為58°C ； 所述檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測序。
10. 一種檢測圓環(huán)病毒II的引物對，由引物1和引物2組成，所述引物1和所述引物2 的核苷酸序列分別為序列表中的序列1和序列2 ；或一種檢測豬偽狂犬病毒的引物對，由引物5和引物6組成，所述引物5和所述引物6 的核苷酸序列分別為序列表中的序列5和序列6。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬圓環(huán)病毒II型、豬細(xì)小病毒和豬偽狂犬病毒的多重PCR檢測及其專用引物。本發(fā)明提供了檢測病毒的專用引物，包括引物對A、引物對B和引物對C，所述引物對A包括引物1和引物2，所述引物對B包括引物3和引物4，所述引物對C包括引物5和引物6，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的豬圓環(huán)病毒II，豬細(xì)小病毒和豬偽狂犬病毒的多重PCR檢測方法，簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、高效，在臨床診斷上具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102329893SQ201110283930
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者蘭鄒然, 孫圣福, 張棟, 李云崗, 杜蘭榮 申請人:山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心