專利名稱：肺癌驅(qū)動性基因突變的檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及肺癌驅(qū)動性基因突變的檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
肺癌是世界范圍內(nèi)常見的癌癥，發(fā)病率和死亡率居各癌癥之首。2002年全世界肺癌的新發(fā)病率為138萬，近一半09.9%)發(fā)生在發(fā)展中國家。據(jù)2008年我國衛(wèi)生部的統(tǒng)計，肺癌死亡率為30. 83/10萬。肺癌已經(jīng)成為發(fā)病率和死亡率第一位的惡性腫瘤，肺癌的死亡例數(shù)遠(yuǎn)大于乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌死亡例數(shù)的總和(Orras JM, Fernandez Ε, Gonzalez JR, et. , al. Lung cancer mortality in European regions(1955-1997). Ann Oncol, 2003,14(1) :159-161 ；中華人民共和國衛(wèi)生部，《2008年中國衛(wèi)生統(tǒng)計》年鑒)。肺癌從組織病理學(xué)上可以分為兩大類小細(xì)胞癌(SCLC)和非小細(xì)胞癌(NSCLC)， 其中非小細(xì)胞癌約占所有肺癌病例數(shù)85%，包括鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌。發(fā)達(dá)國家的肺癌患者的5年生存率為15-20%，而我國肺癌患者5年生存率僅為10%。其主要原因是大多數(shù)肺癌由于缺乏高靈敏度的基因突變檢測和確診技術(shù)，以及與之相匹配的科學(xué)的治療方案， 從而失去了治療的最佳時機。因此，肺癌的基因突變檢測和診斷技術(shù)，對于制定與之相匹配的科學(xué)有效的化療方案，提高肺癌患者的生存率，延長生存期有著重大的現(xiàn)實意義。肺癌的發(fā)生主要是由于暴露于致癌環(huán)境下，引起驅(qū)動性基因突變，導(dǎo)致突變細(xì)胞過度增殖而形成。肺癌的驅(qū)動性基因突變是一種惡性的基因突變，是導(dǎo)致肺癌發(fā)生、增值、 轉(zhuǎn)移和耐藥的最根本的原因。美國國立癌癥研究所的肺癌突變聯(lián)盟組織14家研究單位，對 1000例的肺腺癌的驅(qū)動突變進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示約60%的患者含有驅(qū)動性基因突變(Mark G. Kris, et al. Molecular Profiling Defines New Potential Targets for Lung Cancer Treatment. ASC0. 2011，)。進(jìn)一步表明了檢測肺癌驅(qū)動性突變對于肺癌的早期診斷，和化療靶向用藥的預(yù)后有著重要意義?，F(xiàn)任 ASCO (American Society of Clinical Oncology)主席 George W. Sledge 認(rèn)為基因組的研究迎來了腫瘤治療的新紀(jì)元。根據(jù)基因分析，可分為“愚蠢”和“聰明”兩類腫瘤，前者腫瘤，多為純質(zhì)性的單個驅(qū)動突變，治療效果較好，即便耐藥，也發(fā)生較遲；而后者多屬異質(zhì)性，即一種優(yōu)勢驅(qū)動突變與多重驅(qū)動突變并存的腫瘤，常見早發(fā)耐藥。預(yù)示了癌癥的治療已進(jìn)入了基因突變特異性治療(Mutation Specific Therapy)的到來，即必須依據(jù)患者腫瘤基因突變分子來選擇治療藥物，而不是依靠傳統(tǒng)的腫瘤組織病理學(xué)分類來進(jìn)行化療。因此，肺癌的驅(qū)動性突變的檢測是肺癌靶向藥物的開發(fā)與用藥的前提和基礎(chǔ)。多項研究證實，肺癌的驅(qū)動性基因突變主要包括EGFR、KRAS, EML4-ALK、BRAF, PUCA、AKTl、MEKl、MET、HER2、NAS和AKT等驅(qū)動性突變。研究顯示在肺癌中EGFR、KRAS、 BRAF和EML4-ALK的驅(qū)動性突變率約占總突變的60 %，其中EGFR驅(qū)動突變?yōu)?0-30 % ,KRAS 驅(qū)動突變?yōu)?0%、BRAF驅(qū)動突變?yōu)?%、EML4-ALK驅(qū)動突變?yōu)?% (Pao W, Girard N. New driver mutations in non-small-cell lung cancer. Lancet Oncol 2011. 12. 175-80 ； Mark G.Kris, et al. Molecular Profiling Defines New Potential Targets for LungCancer Treatment. ASCO. 2011)。表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Rec印tor，EGH )是一種酪氨酸激酶受體，由其介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)是包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥的主要發(fā)病機理之一，是肺癌化療的最主要靶點之一。目前，臨床上EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)靶向治療的藥物主要有Iressa (易瑞沙)和Tarceva (特羅凱)。研究顯示，這兩種藥物的療效與肺癌患者組織中的EGFR基因外顯子18-21上的突變呈正相關(guān)(Lynch TJ et al. N. Engl. J. Med. 2004 ； 350)。2011年《美國國立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)臨床實踐指南》明確指出，EGFR基因是人體腫瘤中最常見的驅(qū)動性突變基因，在肺癌患者接受靶向藥物化療之前必須進(jìn)行EGFR基因突變檢測。因此，檢測EGFR驅(qū)動性突變，可以有效預(yù)測上述兩種藥物的治療的療效。KRAS基因參與編碼細(xì)胞內(nèi)信號傳遞的蛋白，KRAS基因突變，主要集中發(fā)生在12、 13,61特定的密碼子上，占突變的90%以上。目前，臨床上靶向藥物Cetuximab (愛必妥) 和Panitumumab (帕尼單抗)對無突變的KRAS基因有較好的治療效果，對突變的KRAS基因患者無效。2011年《美國國立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)臨床實踐指南》明確指出，KRAS 基因是人體腫瘤中最常見的驅(qū)動性突變基因，在肺癌患者接受靶向藥物化療之前必須進(jìn)行KRAS基因突變檢測。當(dāng)KRAS驅(qū)動基因突變發(fā)生時，不建議病人使用Cetuximab (愛必妥)或I^anitumumab (帕尼單抗)進(jìn)行分子靶向治療(Lievre et al. KRAS Mutations As an Independent Prognostic Factor in Patients With Advanced Colorectal Cancer Treated With Cetuximab. J. Clin. Oncol. 2008 ；26)。因此，KRAS 驅(qū)動突變基因的檢測，可以預(yù)后Cetuximab (愛必妥)或Panitumumab (帕尼單抗)兩種藥物的療效。BRAF基因是RAF-MEK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的主要成員之一，是一種絲/蘇氨酸特異性激酶，在細(xì)胞增值、分化和凋亡方面發(fā)揮主要作用。約90 %的BRAF基因突變發(fā)生在 Exon 15的1799核苷酸上，導(dǎo)致其編碼的谷氨酸由纈氨酸取代(V600E)。研究發(fā)現(xiàn)，V600E突變可模擬T599和S602兩個位點的磷酸化過程，從而使BRAF蛋白激活異常。臨床研究表明， 靶向藥物Sorafenib (索拉非尼)和PLX4032與BRAF基因驅(qū)動突變呈正相關(guān)(Roche and Plexxikon' s PLX4032 shows 81 % response in metastatic melanoma patients in Ph I trial. The Pharma Letter. 2011. 8)。因此，檢測BRAF驅(qū)動基因突變，可以用來有效預(yù)測上述兩種靶向藥物化療的預(yù)后效果。EML4-ALK基因為棘皮動物微管結(jié)合蛋白4(EML4)與間變淋巴瘤激酶(ALK)形成的融合基因，研究發(fā)現(xiàn)EML4-ALK可誘導(dǎo)腫瘤生成，給予ALK抑制劑后腫瘤可迅速消退。在目前已報道的研究中EML4-ALK融合基因在非小細(xì)胞肺癌中的陽性率約為7%，EML4-ALK融合基因已成為肺癌臨床治療新靶點。臨床研究表明，新藥Crizotinib(克里唑蒂尼)對于 ALK融合基因有很好的治療效果(A Phase III Trial of Crizotinib Versus Standard Of Care In Patients With Advanced Non-Smal1 Cell Lung Cancer(NSCLC)With a Specific Alteration of the Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene. Pfizer Oncology. 2011 ；6)。 因而，對用EML4-ALK驅(qū)動性突變的檢測是實施Crizotinib化療預(yù)后必需的指標(biāo)。目前，約有70%的肺癌患者仍接受化療，為了使肺癌患者能接受到最好的治療，提高生存率，延長患者生存期。實施以驅(qū)動性基因突變分型治療是腫瘤化療必然趨勢。對肺癌患者腫瘤藥物靶點及相關(guān)的驅(qū)動性基因突變的了解是實施肺癌突變特異性治療(Mutation Specific Therapy)和制定正確化療方案的前提和基礎(chǔ)。2011年《美國國立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)臨床實踐指南》已經(jīng)明確把EGFR，KRAS, BRAF等驅(qū)動性突變的檢測應(yīng)該在實施化療前成為常規(guī)化。因此，在實施化療之前對于肺癌主要的驅(qū)動性突變的檢測，對于提高了肺癌患者的生存率，延長患者生存期，避免過度治療有著主要的現(xiàn)實意義。驅(qū)動性突變基因?qū)袤w細(xì)胞稀有突變，具有稀少性、異質(zhì)性、不穩(wěn)定性等特點。因而， 驅(qū)動性突變基因分子檢測必須具備較高的靈敏度。研究發(fā)現(xiàn)，驅(qū)動性突變的量往往都低于直接測序等技術(shù)所能達(dá)到的檢測限，所以直接測序等技術(shù)無法滿足驅(qū)動性突變基因檢測的實際需求。因此，迫切需要開發(fā)一種高靈敏度與高特異性的驅(qū)動性突變基因檢測技術(shù)，以實現(xiàn)采用高靈敏度檢測方法對肺癌患者進(jìn)行多重“驅(qū)動性基因突變”聯(lián)合的檢測，從而為制定肺癌患者的個體化用藥方案和耐藥處理方案提供科學(xué)參考依據(jù)。本發(fā)明提供了一種高靈敏度和高特異性的肺癌驅(qū)動性突變的檢測方法及試劑盒。 該方法可以實現(xiàn)肺癌的多重“驅(qū)動性基因突變”聯(lián)合檢測，大大縮短了檢測的時間，提高了肺癌驅(qū)動性突變檢測的靈敏度和準(zhǔn)確率，從而實現(xiàn)了肺癌驅(qū)動性突變的早期檢測和化療靶向用藥的準(zhǔn)確預(yù)后。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于肺癌驅(qū)動性基因突變檢測的引物和探針，包括 EGFR，KRAS, BRAF和EML4-ALK驅(qū)動性基因突變的檢測探針和引物，通過對驅(qū)動性突變的檢測實現(xiàn)肺癌驅(qū)動突變的早期診斷和化療預(yù)后，其特異引物與雙環(huán)探針包括如下序列表IEGFR驅(qū)動突變特異性引物和雙環(huán)探針核苷酸序列
權(quán)利要求
1.用于檢測肺癌驅(qū)動性基因突變的引物及探針，包括下列4組71條引物和探針 (I)EGFR驅(qū)動突變特異性引物和雙環(huán)探針核苷酸序列其序列為SEQ ID NO :1至SEQID NO 24 ；O) KRAS驅(qū)動突變特異性引物和雙環(huán)探針核苷酸序列SEQ IDNO :25至SEQ ID NO 44 ；(3)BRAF驅(qū)動突變特異性引物和雙環(huán)探針核苷酸序列SEQ ID NO :45至SEQ ID NO 47 ；以及(4)EML4-ALK驅(qū)動突變特異性引物和雙環(huán)探針核苷酸序列SEQ ID NO :48至SEQ ID NO :71。
2.如權(quán)利要求1所述的肺癌驅(qū)動性基因突變檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟(1)提供權(quán)利要求1所述的4組71條引物和探針；(2)待測樣品的處理和模板的提?。?3)配制焚光PCR擴增反應(yīng)體系；(4)用步驟(1)的引物和探針擴增待測驅(qū)動性基因突變靴序列(5)利用雙環(huán)探針與特異性引物的雜交，檢測反應(yīng)體系的FAM和HEX或ROX焚光強度， 以HEX信號達(dá)到設(shè)定閾值(Ct > 18)是表明上樣DNA的量在允許范圍內(nèi)，F(xiàn)AM信號結(jié)果可 信；以FAM達(dá)到設(shè)定的閾值時所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，Ct值為O或 35 陰性；Ct值小于32 陽性。
3.如權(quán)利要求2所述的一種肺癌驅(qū)動性基因突變檢測試劑盒的檢測方法，其特征在 于步驟( 所述的待檢測樣品包括手術(shù)切除的新鮮病理組織，石賭包埋病理組織，石賭切 片，全血，血菜，血清和胸腔積液。
4.一種檢測肺癌驅(qū)動性基因突變的檢測試劑盒，包括權(quán)利要求1所述的4組67條引 物和探針。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測肺癌驅(qū)動性基因突變的檢測試劑盒，包括EGFR、KRAS、BRAF 和EML4-ALK的焚光PCR的反應(yīng)體系分別為EGFR驅(qū)動突變焚光PCR反應(yīng)體系 IX PCR緩沖液模板3 6 ML各引物0. 1 l.Opmol各探針0.5 1.0 pmolTaq 酶2. O 3. O UdNTP0.5 L5mmolMgCLa5. O 7. O mmol總體積20 60 MLKRAS驅(qū)動突變焚光PCR反應(yīng)體系 IX PCR緩沖液模板3-、6MLKRAS引物0.1 ,1. 0μπιο KRAS探針0.5 ,1. 0μπιο iTaq 酶0.5 ,3. 0UHGH引物0.1 ,1. 0μπιο HGH探針0.5 ,1. 0μπιο dNTP0.5 ,1. 5mmolMgCL25.0 ,9. 0mmol總體積20-60 mLBRAF驅(qū)動突變熒光PCR反應(yīng)體系 IX PCR緩沖液模板3 6 pL各引物0. --1. 0 μπιο 各探針ο. δ--1. 0 μπιο iTaq 酶1. 5 3· 0 UdNTP0. 5 L 5 mmolMgCL25. 0 9. 0 mmol總體積20 EML4-ALK驅(qū)動突變熒光PCR反應(yīng)體系Takara 10XPCR Buffer 稀釋為 IX模板3 7ML各引物1. Ο-"4. 0 pmol各探針Ι. 0、"3. 0 pmoliTaq 酶0. 5、-2. 0 UdNTP0.卜"1. 5 mmolMgCL21. 0、-2. 7 mmol甲酰胺1 2%總體積20 丨60 mL
6.-種用于檢測肺癌驅(qū)動性基因突變的引物及探針，其特征在于，其由SEQ ID NO ID NO :71的寡核苷酸引物和探針或與其有至少70%同一性的寡核苷酸引物序列-1 SEQ組成。
全文摘要
本發(fā)明公開了肺癌驅(qū)動性基因突變的檢測試劑盒，其包括用于檢測肺癌EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK驅(qū)動性基因突變的引物、探針。本發(fā)明的方法包括(1)提供4組71條引物和探針；(2)檢測樣品DNA模板的提??；(3)配制檢測EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK驅(qū)動突變的熒光PCR反應(yīng)體系；(4)利用雙環(huán)探針與特異性引物的雜交，檢測反應(yīng)體系的FAM和HEX或ROX熒光強度，根據(jù)FAM和HEX或ROX熒光強度判定結(jié)果。本發(fā)明的方法可以檢測肺癌EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK基因的驅(qū)動性突變，該方法具有靈敏度高，特異性強，檢測速度快，檢測方便等特點。
文檔編號C12N15/11GK102443626SQ201110284778
公開日2012年5月9日 申請日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者張海龍, 施偉杰, 肖桃英, 鄭立謀, 阮力 申請人:廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司