專利名稱：神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠促進皮膚產(chǎn)生神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的制造方法。
背景技術(shù)：
皮膚具有產(chǎn)生神經(jīng)酰胺(ceramide)和葡萄糖神經(jīng)酰胺(glucosylceramide)的能力。在皮膚中、特別是表皮角質(zhì)層中聚集著由表皮細胞合成分泌得到的神經(jīng)酰胺，它是細胞間脂質(zhì)的主要成分。而由表皮細胞合成得到的神經(jīng)酰胺暫時以葡萄糖神經(jīng)酰胺或者神經(jīng)鞘磷脂(sphingomyelin)的形式被儲存起來；之后被排出至細胞外,在葡糖腦苷酯酶 (glucocerebrosidase)和神經(jīng)磷脂酶(sphingomyelinase)的作用下,再次形成神經(jīng)酰胺, 從而發(fā)揮作為細胞間脂質(zhì)的功能。皮膚中的神經(jīng)酰胺和葡萄糖神經(jīng)酰胺具有提高皮膚的保濕功能和皮膚的屏障功能等的生理作用。
但是，近來由于環(huán)境、氣候等的影響，皮膚容易變得干燥，因此由皮膚自身產(chǎn)生神經(jīng)酰胺等來改善皮膚的保濕功能就顯得不足夠。
因而人們嘗試了從外部向皮膚補充神經(jīng)酰胺的方法。例如，在專利文獻I中記載了培養(yǎng)假絲酵母(Candida)屬的微生物來制造葡萄糖神經(jīng)酰胺的方法,通過將該葡萄糖神經(jīng)酰胺涂布在人體的干燥性皮膚上能夠改善皮膚的保濕功能。該方法是直接從培養(yǎng)后的菌體中獲取大量存在的葡萄糖神經(jīng)酰胺，因此所合成的葡萄糖神經(jīng)酰胺的神經(jīng)酰胺骨架與人體中存在的神經(jīng)酰胺類的神經(jīng)酰胺骨架不同，其在兩處具有碳 碳雙鍵且具有支鏈。因此，將這種從微生物中直接提取得到的葡萄糖神經(jīng)酰胺涂布在人體皮膚上的話，有可能不能與人體皮膚相適應而產(chǎn)生使用安全性方面的問題。
另外，從外部向皮膚補充神經(jīng)酰胺的方法與以往使用的保濕劑等同樣有保濕效果的持續(xù)性不夠的問題，而且有些狀態(tài)的皮膚對從外界補給的神經(jīng)酰胺等的吸收不充分，從而導致不能充分發(fā)揮保濕效果。
而另一方面，如果能夠增強或促進皮膚本身的神經(jīng)酰胺或葡萄糖神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生能力，則無需從外部補充神經(jīng)酰胺或葡萄糖神經(jīng)酰胺，而能夠通過促進皮膚自身產(chǎn)生神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺來提高皮膚的屏障功能和保濕功能。這樣，由于是由皮膚自身產(chǎn)生神經(jīng)酰胺或葡萄糖神經(jīng)酰胺，所合成的是皮膚所具有的常規(guī)結(jié)構(gòu)的神經(jīng)酰胺等，因而其不存在與皮膚的適應性不好等的安全性問題。
因此最近關(guān)于在皮膚角質(zhì)層中產(chǎn)生促進表皮神經(jīng)酰胺等的生成的物質(zhì)的研究相當熱門。其中，作為能夠促進神經(jīng)酰胺生成的物質(zhì)，已報道的有以靈芝、蜂花粉(Bee Pollen)、川芎等的提取物為有效成分的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑(專利文獻2 4)。然而，由于這些神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑全都是從植物原料提取得到，其提取操作耗費時間長，且在天然資源的可利用性方面有限制，因而其制造成本高。
另外，在專利文獻5中，公開了一種能夠活化皮膚表層內(nèi)部的表皮細胞自身的神經(jīng)酰胺合成的神經(jīng)酰胺合成促進劑，其以含有煙酸和/或煙酰胺的菌培養(yǎng)物為有效成分，該菌培養(yǎng)物可以是乳酸菌培養(yǎng)物、雙歧桿菌培養(yǎng)物、香菇菌體培養(yǎng)物或者酵母菌培養(yǎng)物。但是，該促進劑的制備過程中使用的培養(yǎng)基實質(zhì)上以煙酸和/或煙酰胺作為有效成分，因此這種神經(jīng)酰胺合成促進劑的制備成本較高。
另一方面，人們對隱球酵母屬的微生物已有一些研究。例如，有文獻報道稱乳酒隱球酵母變種產(chǎn)生β-半乳糖苷酶。另外，人們也發(fā)現(xiàn)羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)菌株具有對忙藏柑橘酸腐細菌(Geotrichum citr1-aurantii)的抑制作用。
但是，目前還沒有利用隱球酵母來制備神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的報道。
專利文獻1:日本特開2010-22217號公報
專利文獻2 :日本特開2005-194240號公報
專利文獻3 :日本特開2010-7049 9號公報
專利文獻4 :日本特開2010-150237號公報
專利文獻5 :日本特開平9-194383號公報發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題而做出的，目的在于提供一種低成本且高效地制造神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的方法。
本發(fā)明人為了解決上述技術(shù)問題進行了專心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在含有豆渣和糖類的培養(yǎng)基中培養(yǎng)隱球酵母屬(Cryptococcus)的微生物，能夠高效地獲得神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑；從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供一種神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的制造方法，其中，在含有豆洛和糖類的培養(yǎng)基中培養(yǎng)隱球酵母屬(Cryptococcus)的微生物，從其上清液中獲得神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑。
根據(jù)本發(fā)明的制造方法，能夠使用特定的微生物并利用豆渣這樣的容易獲得的物質(zhì)作為培養(yǎng)基的主要原料，從而能夠廉價且高效地獲得神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑，該促進劑能夠有效提高皮膚所具有的產(chǎn)生神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺的能力，從而有效提高皮膚的保濕能力。
具體實施方式
本發(fā)明的制造方法是在含有豆渣和糖類的培養(yǎng)基中培養(yǎng)隱球酵母屬的微生物，并從其上清液中獲得神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑。
作為在本發(fā)明中使用的隱球酵母屬(Cryptococcus)的微生物,可以列舉出羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)、匈牙利隱球酵母(Cryptococcus hungaricus)、地生隱球酵母(Cryptococcus terreus)等。
其中，從所獲得的產(chǎn)品具有更高的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進效果和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進效果的觀點考慮，優(yōu)選羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)或匈牙利隱球酵母(Cryptococcus hungaricus)。
本發(fā)明所涉及的隱球酵母屬(Cryptococcus)的微生物都可以從中國普通微生物保藏管理中心(CGMCC)、中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)、江南大學工業(yè)微生物資源和信息中心(CICM)等商業(yè)渠道購買得到。
在本發(fā)明的制造方法中，可以單獨使用I種上述微生物，也可以組合2種以上的上述微生物進行使用。
本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基是含有豆渣和糖類的培養(yǎng)基。豆渣和糖類都是容易獲得的物質(zhì)，因而，本發(fā)明的培養(yǎng)基具有成本低的優(yōu)點。并且，除此之外，也可以適當添加例如1% 的蛋白胨、O. 5%的酵母粉等。
其中，豆渣是指，將大豆浸泡在水中使其充分吸收水分后粉碎、再經(jīng)過濾、除水、浙干而得到的物質(zhì)。也可以使用食品產(chǎn)業(yè)中壓榨豆?jié){等的豆制品制造工序中殘留的大豆殘渣。
糖類可以是葡萄糖、蔗糖、麥芽糖等，它們可以任意單獨使用或混合使用。而從提高神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進效果和葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進效果的觀點考慮，其中優(yōu)選葡萄糖。
從提高神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進效果和葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進效果的觀點考慮，本發(fā)明的培養(yǎng)基優(yōu)選由豆渣、葡萄糖和水構(gòu)成，進一步優(yōu)選培養(yǎng)基中豆渣的含量為5 20w/、更優(yōu)選8 12w/v%,葡萄糖的含量為O. 2 2w/v%、更優(yōu)選O. 8 1. 2w/v%。
從隱球酵母屬(Cryptococcus)微生物的生理特性、以及提高神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進效果和葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進效果的觀點考慮，優(yōu)選在27 35°C下進行上述培養(yǎng)。
從隱球酵母屬(Cryptococcus)微生物的生理特性、以及提高神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進效果和葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進效果的觀點考慮，上述培養(yǎng)時間優(yōu)選為I 7天，更優(yōu)選為 48 96小時，更優(yōu)選為68 76小時。
從得到更純的產(chǎn)品的觀點出發(fā)，優(yōu)選將通過所述培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)物進一步進行精制從而得到上清液。作為精制的方法，可以根據(jù)需要適當組合使用過濾、離心分離、離子交換或吸附色譜、溶劑提取、結(jié)晶化等的常用的操作來進行。優(yōu)選通過離心分離獲得上清液， 該離心分離的速度優(yōu)選為2000 4000rpm、更優(yōu)選為2500 3500rpm,離心時間優(yōu)選為O 20分鐘，更優(yōu)選為5 15分鐘。
可以在離心后獲得的上述上清液中加入乙醇，用來進行滅菌，并將加入了乙醇的上清液作為神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑。
也可以通過離心分離從培養(yǎng)液中除去菌體，再超聲波處理，離心分離，回收上清液。接著，再將回收后的上清液過濾除去雜質(zhì)等，真空下干燥處理后作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑。
通過培養(yǎng)本發(fā)明的隱球酵母屬(Cryptocous)微生物并從培養(yǎng)上清液中得到的大豆殘渣發(fā)酵提取物，具有在正常人體的角化細胞中使神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺的量增加的作用。
因此,通過培養(yǎng)本發(fā)明的隱球 酵母屬(Cryptococcus)微生物而從培養(yǎng)上清液中得到的大豆殘渣發(fā)酵提取物，可以用于促進神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生的治療目的或非治療目的的使用，也可以作為治療目的或非治療目的的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑使用。非治療目的的使用是以美容為目的的使用，或為維持健康狀態(tài)的使用等。并且，所述治療目的的使用和非治療目的的使用是可以完全區(qū)分地進行的。
通過培養(yǎng)本發(fā)明的隱球酵母屬(Cryptococcus)微生物并從培養(yǎng)上清液中得到的大豆殘渣發(fā)酵提取物，也可以用于制造神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑。
本發(fā)明的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑可以作為使角質(zhì)層中的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺增加并恢復和提高皮膚的屏障功能和保濕功能的醫(yī)藥品、準醫(yī)藥品、化妝品等使用。另外，該神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑也可以作為以神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進為概念的、并根據(jù)需要標明該概念的準醫(yī)藥品、化妝品使用。
作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的使用形態(tài)，可以是用于向培養(yǎng)細胞中添加的添加劑，也可以是配合到皮膚洗凈劑、化妝品等皮膚外用劑中使用。例如，可以列舉化妝水、乳液、凝膠、霜、軟膏等各種形態(tài)。而作為外用劑的基劑，只要是公知的外用基劑即可，沒有特別限制。在配制各種皮膚外用劑時，可以單獨地使用本發(fā)明的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑，或與在皮膚洗凈劑和化妝品等皮膚外用劑中通常配合的油性成分、保濕劑、粉體、色素、乳化劑、增溶劑、紫外線吸收劑、增稠劑、藥效成分、香料、防菌防霉劑、植物提取物、醇類等適當組合來使用。
將本發(fā)明的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑添加到培養(yǎng)的表皮細胞中來促進神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺的情況下，作為該促進劑的干燥物的添加量優(yōu)選為O. 0001 10w/v%，更優(yōu)選為O. 001 5w/v%。當添加量為O. 0001w/v%& 上時，能得到充分的促進效果；而當添加量為10w/V%以下時，對表皮細胞的刺激性更小。
將本發(fā)明的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑配合在皮膚外用劑使用時，從有效促進神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生、從而有效提高皮膚的保濕能力、而且不易顯示出培養(yǎng)物的顏色和氣味的觀點出發(fā)，其配合量優(yōu)選為皮膚外用劑總量的O. 01 20w/v%,更優(yōu)選為O.1 10w/v%。
實施例
下面，基于實施例對本發(fā)明進行更詳細的說明，但本發(fā)明并不限定于此?！?br> 實施例1
<神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的制備(發(fā)酵液處理)>
首先，按照以下方法制備培養(yǎng)基將大豆放入水中浸泡12小時，使大豆充分吸收水分，然后將吸收了水分的大豆研磨破碎，將其過濾并除去液體成分，剩余殘渣浙干，得到豆渣。將該豆渣與葡萄糖以及水相混合，并使豆渣和葡萄糖在混合物中的濃度分別達到 10界八％和lw/v%，將該混合物作為培養(yǎng)基。
然后，將IOOml的上述培養(yǎng)基加至三角燒瓶中，接種一定量的羅倫隱球酵母 (Cryptococcus laurentii)(保藏于江南大學工業(yè)微生物資源和信息中心CICIM,編號 CICIM Y0232)，在 30°C下培養(yǎng) 3 天。
然后將所得到的培養(yǎng)物離心分離(3000rpm，10分鐘)。剩余上清液加入2. 5倍的無水乙醇稀釋，取Iml混合液作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的樣品A，存于4°C冰箱中以備用作細胞培養(yǎng)用添加物。
對該無水乙醇稀釋后的混合液進行超聲處理10分鐘，離心(3000rpm) 30分鐘，收集上清液(約70ml)，上清液以濾紙過濾得濾液，濾液于真空干燥機中干燥至恒重，將此干燥品作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的樣品B、C，將樣品B、C分別以50%乙醇溶解而配制成1%、0. 1%濃度的溶液，存于4°C冰箱中作為細胞培養(yǎng)用添加物。
<神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的評價>
(細胞培養(yǎng))
首先，取正常人的活化角質(zhì)化細胞(Cascade Co. ,Ltd)作為原代細胞，于75cm2培養(yǎng)瓶中(含有生長因子的培養(yǎng)基2ml) ,37°C XO2濃度為5%的條件下培養(yǎng)細胞至80 90% 濃度。進行傳代，傳代細胞至175cm2方瓶中繼續(xù)培養(yǎng)細胞至80 90%濃度。然后將傳代后的人體表皮細胞接種到12孔板中，每孔容積為2ml，細胞濃度為I X IO5個細胞/ml，繼續(xù)培養(yǎng)細胞至80 90%濃度。
然后，在上述12孔板中更換不含有生長因子的培養(yǎng)基，將樣品A、B、C和對照品 (濃度為50V/V%的乙醇水溶液)分別加入上述12孔板中(η = 2)，相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3天。
3天培養(yǎng)后，棄去上清培養(yǎng)液，以2ml PBS (磷酸鹽緩沖液)對細胞進行2次清洗， 再加入Iml的PBS至板孔中，以細胞收集器(細胞鏟)收集細胞至試管中，以備后續(xù)神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺和蛋白質(zhì)分析。
(神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進效果的確認)
在回收得到的含有細胞的PBS溶液中加入甲醇氯仿=2. 5ml 1. 25ml的溶劑， 進行振動20分鐘，進行離心(3 000rpm，5分鐘)分離，從而得到上清液a和沉淀b。將上清液a用于神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺量的分析，將沉淀b用于蛋白質(zhì)含量的分析。
(I)神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺量的分析
在由此得到的上清液a中加入PBS 氯仿=1. 25ml 1. 25ml的溶劑，進行振動 20分鐘，進行離心(3000rpm，5分鐘)分離，得到上下兩相?；厥障孪啵⒃?0°C、氮氣保護下進行干燥40分鐘。在得到的干燥品中加入100 μ I的氯仿甲醇=2ml Iml的溶劑進行溶解，并用下述薄板層析(TLC)法對其進行神經(jīng)酰胺和葡萄糖神經(jīng)酰胺的量(分別記為 Cer和GlyCer,單位為μ g/ml)的解析。
將神經(jīng)酰胺(或葡萄糖神經(jīng)酰胺)標準品與樣品溶液點至干燥TLC板上，以 CHC13 CH30H CH3C00H(190 9 lv/v/v)為展層劑進行薄板層析，待展層劑行至薄板頂端，以吹風機吹干展層劑；重復以上步驟一次。然后以 CHCl3 CH30H C3H60(76 20 4v/v/v)為展層劑進行薄板層析，待展層劑行至距薄板底端2. 5cm處，停止展層，以吹風機吹干。噴以硫酸銅磷酸溶液，吹干，將層析板放置于 180°C烘烤板上烘烤7分鐘顯色。掃描顯色TLC板并進行神經(jīng)酰胺(或葡萄糖神經(jīng)酰胺) 分析。
(2)蛋白質(zhì)含量的分析
為了表征細胞中的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺量，進行蛋白質(zhì)含量分析。在上述沉淀b中加入90 μ I的SDS (十二烷基磺酸鈉)溶液并進行混合，在60°C下加熱2小時使蛋白質(zhì)變性降解，冷卻后在其中添加100 μ I的2N的HCl溶液，按照BCAKit (蛋白質(zhì)定量分析試劑盒)法測定其中蛋白質(zhì)的量(記為Pro，單位為μ g/ml)。
(3)分析結(jié)果
對于本發(fā)明品和對照品的樣品，分別測定Cer/Pro和GlyCer/Pro (見下式)。以對照品的Cer/Pro和GlyCer/Pro為I,在表I中表示本發(fā)明品的Cer/Pro和GlyCer/Pro的相對值。另外，以對照品每孔中的蛋白質(zhì)的量為100，求出本發(fā)明品的每孔中的蛋白質(zhì)的量的相對值(Pro. (%))，并據(jù)此求出每孔的神經(jīng)酰胺和葡萄糖神經(jīng)酰胺的量(相對于對照品的相對量)，即，Cer/Well = Cer/ProXPro. (% ), GlyCer/ffell = GlyCer/ProXPro. (% ) 一并在表I中表不。
如果Cer/Pro (或Cer/Well)大于I (對照品的值)，則表明該樣品具有神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進效果；如果GlyCer/Pro (或GlyCer/Well)大于I (對照品的值),則表明該樣品具有葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進效果。
如表I所示，確認了本發(fā)明品A、B和C具有神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進效果。
實施例2
在實施例1的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的制備過程中，用匈牙利隱球酵母(Cryptococcus hungaricus)(保藏于江南大學工業(yè)微生物資源和信息中心CICIM, 編號 CICM Y0203)代替羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)(編號 CICIM Y0232)，除此以外，與實施例1同樣進行培養(yǎng)。
然后將所得到的培養(yǎng)物離心分離(3000rpm，10分鐘)。剩余上清液加入2. 5倍的無水乙醇稀釋，取Iml混合液作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的樣品 D，存于4°C冰箱中以備用作細胞培養(yǎng)用添加物。
對上述無水乙醇稀釋后的混合液進行超聲處理10分鐘，離心(3000rpm) 10分鐘， 收集上清液(約70ml)，上清液以濾紙過濾得濾液，濾液于真空干燥機中干燥至恒重，作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的樣品E、F，將樣品E、F分別以50%乙醇 溶解而配制成1%、0.1 %濃度的溶液，存于4°C冰箱中作為細胞培養(yǎng)用添加物。
按照與實施例1同樣的方法評價樣品D、E、F的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進效果，結(jié)果一并表不在表I中。
如表I所示，確認了實施例2的樣品D、E、F具有葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進效果。
實施例3
在實施例1的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的制備過程中，用羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)(保藏于江南大學工業(yè)微生物資源和信息中心CICIM,編號 CICM Y0218)代替異羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)(編號 CICIM Y0232)，除此以外，與實施例1同樣進行培養(yǎng)。
然后將所得到的培養(yǎng)物離心分離(3000rpm，10分鐘)。剩余上清液加入2. 5倍的無水乙醇稀釋，取Iml混合液作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的樣品 G，存于4°C冰箱中以備用作細胞培養(yǎng)用添加物。
對上述無水乙醇稀釋后的混合液進行超聲處理10分鐘，離心(3000rpm) 10分鐘， 收集上清液(約70ml)，上清液以濾紙過濾得濾液，濾液于真空干燥機中干燥至恒重，作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的樣品H，將樣品H以50%乙醇溶解而配制成I %濃度的溶液，存于4°C冰箱中作為細胞培養(yǎng)用添加物。
按照與實施例1同樣的方法評價樣品G、H的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進效果，結(jié)果一并表不在表I中。
如表I所示，確認了實施例3的樣品G、H具有葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進效果。
實施例4
在實施例1的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的制備過程中，用匈牙利隱球酵母(Cryptococcus hungaricus)(保藏于江南大學工業(yè)微生物資源和信息中心CICIM, 編號 CICM Y0219)代替羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)(編號 CICIM Y0232)，除此以外，與實施例1同樣進行培養(yǎng)。
然后將所得到的培養(yǎng)物離心分離(3000rpm，10分鐘)。剩余上清液加入2. 5倍的無水乙醇稀釋，取Iml混合液作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的樣品 I，存于4°C冰箱中以備用作細胞培養(yǎng)用添加物。
對上述無水乙醇稀釋后的混合液進行超聲處理10分鐘，離心(3000rpm) 10分鐘， 收集上清液(約70ml)，上清液以濾紙過濾得濾液，濾液于真空干燥機中干燥至恒重，作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的樣品J，將樣品J以50%乙醇溶解而配制成I %濃度的溶液，存于4°C冰箱中作為細胞培養(yǎng)用添加物。
按照與實施例1同樣的方法評價樣品1、J的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進效果，結(jié)果一并表不在表I中。
如表I所示，確認了實施例4的樣品J具有葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進效果。
表I
權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的制造方法，其中，在含有豆洛和糖類的培養(yǎng)基中培養(yǎng)隱球酵母屬(Cryptococcus)的微生物，從其上清液中獲得神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑。
2.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的制造方法，其中， 所述隱球酵母屬(Cryptococcus)的微生物是羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)或匈牙利隱球酵母(Cryptococcus hungaricus)。
3.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的制造方法，其中， 所述糖類是葡萄糖。
4.如權(quán)利要求3所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的制造方法，其中， 所述培養(yǎng)基由豆渣、葡萄糖和水構(gòu)成。
5.如權(quán)利要求4所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的制造方法，其中， 所述培養(yǎng)基中所述豆洛的含量為8 12w/v%,所述糖類的含量為O. 8 1. 2w/v%。
6.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的制造方法，其中， 在27 35 °C下進行所述培養(yǎng)。
7.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的制造方法，其中， 所述培養(yǎng)時間為I 7天。
8.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的制造方法，其中， 將通過所述培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)物進行離心，從而得到所述上清液。
9.如權(quán)利要求8所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的制造方法，其中， 在離心后獲得的所述上清液中加入乙醇后，將其作為神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑。
10.如權(quán)利要求9所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的制造方法， 其中，進一步對所述加入了乙醇后得到的物質(zhì)通過超聲波處理、離心分離、過濾、真空干燥處理進行精制后，得到神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑。
11.豆渣的發(fā)酵提取物用于促進神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生的用途，所述豆渣的發(fā)酵提取物是在含有豆渣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)隱球酵母屬(Cryptococcus)的微生物得到的。
12.豆渣的發(fā)酵提取物作為神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的用途，所述豆渣的發(fā)酵提取物是在含有豆渣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)隱球酵母屬(Cryptococcus)的微生物得到的。
13.豆渣的發(fā)酵提取物在制造神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑中的用途，所述豆渣的發(fā)酵提取物是在含有豆渣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)隱球酵母屬(Cryptococcus)的微生物得到的。
14.如權(quán)利要求11 13的任一項所述的用途，其中，所述隱球酵母屬(Cryptococcus)的微生物是羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)或匈牙利隱球酵母(Cryptococcus hungaricus)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑的制造方法，其中，在含有豆渣和糖類的培養(yǎng)基中培養(yǎng)隱球酵母屬(Cryptococcus)的微生物，從其上清液中獲得神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑。根據(jù)本發(fā)明的制造方法，能夠利用容易獲得的物質(zhì)作為培養(yǎng)基并利用特定的微生物，來廉價而高效地獲得神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進劑。
文檔編號C12R1/645GK102994557SQ201110289078
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月15日
發(fā)明者孔凡旗 申請人:花王株式會社