專利名稱：一種分離魚類反轉(zhuǎn)座子SINEs的方法
一種分離魚類反轉(zhuǎn)座子SI NEs的方法技術領域
本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及利用魚類基因組內(nèi)反轉(zhuǎn)座子SINEs起源的特殊性、及其在基因組內(nèi)的分布特點，選擇特定的DNA序列設計獨特的引物，運用分子克隆的方法，分離魚類基因組內(nèi)含有反轉(zhuǎn)座子SINEs的目的片段。
背景技術：
反轉(zhuǎn)座子SINE的基本結(jié)構(gòu)一般由三部分組成5’端的頭部、軀干部和尾部。頭部為RNA相關區(qū)，衍生于相應的7SL RNA，tRNA或者5S rRNA ;軀干部來源不明，且長度也有變化；尾部為長度可變的具有簡單重復序列區(qū)。在真核生物基因組中，SINE大約為IO3-1O5拷貝數(shù)，長度一般在100-600bp之間。SINEs通過RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄為RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶作用形成的cDNA隨機插入到基因組中，引起宿主基因組的突變，可作為一種有應用價值的分子標記，應用于物種鑒定和生物進化方面的研究。SINE的插入與特定的重組相關聯(lián)，影響機體的應激反應和基因調(diào)控，同時，SINE插入的拷貝可成為宿主基因組的啟動子、增強子，沉默子和功能基因的來源。已有研究表明，盡管屬于同一家族的SINE，但其拷貝間的序列差異較大，最高可達35% ;不同科屬的生物類群，具有特定的SINE ;這此特性為克隆生物基因組內(nèi)的SINE帶來了困難。
目前，較為有效的分離生物基因組內(nèi)的SINE的方法6種l、pre-mRNA法。原理是利用SINE互補的pre-mRNA具有長發(fā)卡結(jié)構(gòu)特點，首先獲得發(fā)卡序列并用作探針，然后掃描基因組文庫，找到SINE的全序列。2、基因組重復序列雜交法。利用SINE為大量拷貝而基因為單拷貝的特點，將標記的基因組DNA與基因組文庫相雜交，去掉基因序列，找出重復序列的陽性克隆，然 后再多次雜交，測序，過濾基因序列，最終得到SINEs。3、體外轉(zhuǎn)錄法。以基因組DNA為模板，使用RNA聚合酶III進行體外轉(zhuǎn)錄，獲得RNA并標記成探針，與基因組文庫雜交，篩選陽性克隆，測序，獲得SINE。4、A-B PCR法。以RNA聚合酶III的Box A和 Box B序列設計I對引物(A和B) ,A-B PCR擴增得到tRNA相關的約50bp的核心序列，該序列標記成探針，與基因組文庫雜交，篩選出SINEs。5、A-PCR法，也稱改進的A-B PCR法。引物A在基因組內(nèi)進行PCR，彌散的PCR產(chǎn)物構(gòu)建文庫，A-B PCR產(chǎn)物標記后掃描該文庫，篩選陽性克隆并測序，獲得BoxA下游序列；根據(jù)已知序列設計正反引物，標記PCR產(chǎn)物并用作探針，掃描基因組文庫，得到全長的SINEs序列。6、磁珠富集法。該方法以A-B PCR法為基礎，獲得約50bp的核心序列，再以反向PCR法獲知核心序列兩側(cè)序列，以該序列為探針，通過生物素標記使此序列與磁珠耦合，然后與基因組文庫雜交，捕獲并分離基因組內(nèi)SINEs。
以上用于分離SINE的方法，關鍵在于SINE核心序列的特異性，但所涉及獲取核心序列的步驟都較為繁鎖，且僅適用于特定的生物類群。本發(fā)明利用兩次單引物PCR，無需體外轉(zhuǎn)錄、掃描基因組文庫、或反向PCR，便能實現(xiàn)快速有效的分離魚類SINE的核心序列，以此序列標記為探針，通過該探針與基因組文庫雜交或與磁珠耦合后再與基因組文庫雜交， 將可獲得魚類SINE全長序列。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種基于PCR分離魚類基因組DNA中SINE的方法，該方法簡單， 通過兩次單引物PCR擴增，就能直接獲取基因組DNA中SINE的片段。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)上述發(fā)明
①實驗材料鯡形目觸科魴屬的刀魴Coilia nasus、鳳魴C. mystus和七絲魴 C. grayi ;黃鯽屬的黃鯽Setipinna taty ;棱觸屬的赤鼻棱觸Thrissa kammalensis ;小公魚屬的中華小公魚Anchoviella Chinensis0鲇形目鱷科黃顙魚屬黃顙魚Pelteobagrus fulvidracoo S盧形目彈涂魚科大彈涂魚屬大彈涂魚Boleophthalmus pectinirostris。
②提取DNA :剪取一小塊新鮮的肌肉組織(約50g)，用DNA裂解酶56°C水浴消化 2-3小時，然后按照上海生工的UNIQ-1O柱式基因組DNA提取試劑盒進行操作，I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA質(zhì)量，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> ③引物B設計(見附圖1):根據(jù)不同魚類的 tRNA的聚合酶III的Box B序列高度保守性特點，設計I個獨特引物B，由上海生工公司合成，弓丨物序列5’ -GAGGAYTTGAACC-3’。
④B-PCR :使用 Eppendorf Mastercycler (Eppendorf, German) PCR 儀進行擴增，每個反應體積為50ul，包含基因組DNA 100叩，(1見13各0.41，引物0.51^&9酶21反應程序為:94°C預變性2min ;94°C變性30s，44°C退火45s，72°C延伸lmin，共30個循環(huán);最后72°C 延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(見附圖2)，選取刀鱭約300bp、500bp和 IOOObp的電泳條帶進行克隆和測序分析。
⑤引物A設計(見附圖1):根據(jù)步驟④獲得的序列，比對分析BoxA序列，設計單引物A，引物序列為5’ -TGGCCTAGTGG-3’，由上海生工公司合成。
⑥A-PCR=PCR反應條件、體系及程序似同步驟④，僅退火溫度稍有差異，為43°C。 PCR產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見附圖3。
⑦序列分析選取刀魴約500bp、700bp、IOOObp和1400bp的條帶進行大腸桿菌 DH5a克隆，隨機挑取克隆由上海生工公司進行測序。序列特點分析(附圖3)可見，具有生物基因組DNA中SINE的基本結(jié)構(gòu)特征，SINE的頭部包括Box A和Box B兩個結(jié)構(gòu)域，軀干部為一個變化區(qū)，尾部具有正向重復序列或poly (A/T)。
綜上所述，運用此實驗方法，可擴增出魚類基因組DNA中的反轉(zhuǎn)座子SINEs，將可進一步用于基因工程、分子標記和生物進化方面的研究。


圖1是分離SINE的B-PCR和A-PCR弓丨物設計示意圖
圖2是魚類基因組B-PCR (左)和A-PCR (右)擴增產(chǎn)物電泳圖。
電泳圖譜中O :空白對照；M :分子量標準；1 :彈涂魚；2 :黃顙魚；3 :中華小公魚；
4 :赤鼻棱鍉；5 :黃鯽；6 :七絲鱭；7 :鳳鱭；8 :刀鱭
附圖3A-PCR擴增的刀鱭SINE家族不同元件的序列比對。實框SINE的Box A和 Box B ;虛框正向重復序列；下箭頭略去了一段插入序列；單、雙下劃線局部正向重復;波浪線poly(A/T)或可 能的poly(A) 堿基缺失。
權利要求
1. 一種分離魚類基因組DNA的SINE的方法，其特征在于使用一個引物 B(5’ -GAGGAYTTGAACC-3’ )對基因組進行第1次PCR擴增，擴增產(chǎn)物克隆測序；使用一個引 物A (5’ -TGGCCTAGTGG-3’)對基因組進行第2次PCR擴增，擴增產(chǎn)物克隆測序，分析序列特 點，獲得SINEs。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于PCR方法分離魚類基因組DNA中的反轉(zhuǎn)座子SINEs的方法，本發(fā)明包括2次PCR擴增和2次克隆測序，具體步驟如下①使用一個引物B對魚類基因組DNA進行第1次擴增，回收擴增產(chǎn)物并克隆測序；②使用一個引物A對魚類基因組DNA進行第2次擴增，回收擴增產(chǎn)物并克隆測序，分析序列特點，獲得目的基因。該方法提供了一種快速、簡便、高效的分離魚類SINE的新途徑。
文檔編號C12N15/10GK103013990SQ20111028977
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月27日 優(yōu)先權日2011年9月27日
發(fā)明者劉 東, 朱國利, 唐文喬, 郭弘藝 申請人:上海海洋大學