專利名稱：作為選擇性ngf途徑抑制劑的人抗ngf中和抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)合神經(jīng)生長因子(NGF)的人單克隆抗體。本發(fā)明還描述了用以治療疼痛和疼痛相關(guān)疾病的組合物和方法。
背景技術(shù)：
美國每天有兩百多萬人因慢性疼痛而致殘(Jessell和Kelly，1991，“I^in and Analgesia”，PRINCIPLES OF NEURAL SCIENCE，第 3 版，(Kandel，khwartz 和 Jessell 編輯)，Elsevier，New York)。不幸的是，目前的疼痛治療只是部分有效，而且這些治療中有許多本身會導(dǎo)致人虛弱或者導(dǎo)致危險的副作用。例如，雖然非類固醇抗炎藥(“NSAID”)， 如阿司匹林、布洛芬和吲哚美辛對炎性疼痛有中度的效果，但它們同時也是腎臟毒素，劑量高時往往會導(dǎo)致胃腸刺激、潰瘍、出血和精神錯亂。用阿片類治療的患者也常常遭遇精神錯亂，且長期使用阿片類與伴隨出現(xiàn)藥物耐受性和依賴性。局部麻醉劑如利多卡因和美西律在抑制疼痛的同時導(dǎo)致正常感覺的喪失。疼痛是一種基于從周圍環(huán)境接受并由神經(jīng)系統(tǒng)傳遞和解釋的信號的感知(有關(guān)綜述參見Millan，1999，Prog. Neurobiol. 57 :1-164)。有害的刺激如熱覺和觸覺會促使皮膚中的專用感受器將信號傳輸?shù)街袠猩窠?jīng)系統(tǒng)(“CNS”)。這個過程稱作傷害感受，介導(dǎo)這個過程的周圍感覺神經(jīng)元即傷害感受器。取決于來自傷害感受器的信號強度以及CNS對該信號的提取和解析，人可能會或者可能不會將有害刺激感受為疼痛刺激。當(dāng)一個人對疼痛的感知與刺激的強度正確校準時，疼痛能發(fā)揮其預(yù)期的保護功能。但是，某些類型的組織損害會導(dǎo)致稱為痛覺過敏或早期痛覺(pronociception)的現(xiàn)象，其中相對無害的刺激被感知為強烈疼痛，這是因為人的疼痛閾已降低。炎癥和神經(jīng)損害均會引起痛覺過敏。受炎癥疾病影響的人往往會體驗到疼痛感覺增強，所述炎癥例如曬傷、骨關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎、心炎、皮炎、肌炎、神經(jīng)炎、膠原血管病(其包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和狼瘡)等。同樣，創(chuàng)傷、外科手術(shù)、 截肢、膿腫、灼痛、膠原血管病、脫髓鞘病、三叉神經(jīng)痛、癌癥、慢性酒精中毒、中風(fēng)、丘腦疼痛綜合征、糖尿病、皰疹感染、獲得性免疫缺陷綜合征(“AIDS”)、毒素和化學(xué)療法會造成神經(jīng)損傷，導(dǎo)致過度疼痛。隨著對傷害感受器在正常和痛覺過敏條件下轉(zhuǎn)導(dǎo)外界信號的機制的認識加深，可以把目標(biāo)指向牽涉痛覺過敏的過程，以抑制疼痛閾的下降，從而減少所體驗到的疼痛的量。已顯示神經(jīng)營養(yǎng)因子在生理和病理疼痛的傳遞中發(fā)揮重要的作用。神經(jīng)生長因子(NGF)看來似乎特別重要(有關(guān)綜述參見McMahon，1996，Phil. Trans. R. Soc. Lond. 351 431-40 ；及 Apfel，2000，The Clinical Jourstal of Pain 16 :S7-S11) 已顯示局部性和全身給予NGF能引起痛覺過敏和異常性疼痛(Lewin等，1994，Eur. J Neurosci. 6 1903-191 。在人類中靜脈輸注NGF產(chǎn)生全身肌痛，而局部給予時除了會引起全身效應(yīng)外， 還會引起注射部位痛覺過敏和異常性疼痛(Apfel等，1998，Neurology 51 =695-702) 0還有大量的證據(jù)暗示內(nèi)源NGF牽涉到以疼痛為主要特征的疾病。例如，出現(xiàn)周圍神經(jīng)損傷之后，NGF在背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)膜細胞中被上調(diào)至少2個月，已報告在患有各種關(guān)節(jié)炎模型的動物關(guān)節(jié)中NGF水平提高(例如Aloe等，1993，Growth Factors 9 :149-155) 在人類中，患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或者其他類型關(guān)節(jié)炎的患者的滑液中NGF水平提高(例如Aloe 等，1992，Arthritis和Rheumatism迪=351-355)。此外，還已證明，在神經(jīng)性和慢性炎性疼痛模型中，對NGF功能的拮抗能防止痛覺過敏和異常性疼痛。例如，神經(jīng)性疼痛的動物模型 (例如神經(jīng)干或脊神經(jīng)結(jié)扎)中，全身注射抗NGF中和抗體能防止異常性疼痛和痛覺過敏 (Ramer 等，1999，Eur. J. Neurosci. 11 :837-846 ；及 Ro 等，1999，Pain 79 :265-274)。本領(lǐng)域公知的抗NGF抗體的實例包括例如PCT公開WO 01/78698,WO 01/64247,W002/096458和 WO 2004/032870 ；美國專利第 5，844，092 號、第 5，877，016 號和第 6，153，189 號；Hongo 等， 2000,Hybridoma 19 :215-227 ；Hongo 等，1993，Cell. Mol. Biol. 13 :559-568 ；及 GenBank 檢索號 U39608、U39609、L17078 或 L17077。顯然，需要安全有效的新型疼痛治療法，特別是把目標(biāo)指向小分子的疼痛介體或惡化體(exacerbator)如NGF的治療法。發(fā)明概述本發(fā)明提供在治療上用于控制疼痛的新型人單克隆抗體。具體的說，本發(fā)明提供結(jié)合神經(jīng)生長因子(NGF)的單克隆抗體。優(yōu)選所述單克隆抗體是人單克隆抗體，能中和NGF 的生物活性，可用于改善NGF介導(dǎo)的疼痛反應(yīng)的效應(yīng)。本發(fā)明還提供生產(chǎn)本發(fā)明單克隆抗體、最優(yōu)選還將單克隆抗體分泌到細胞培養(yǎng)基中的細胞。本發(fā)明抗體除了在治療和控制疼痛中的用途之外，還用于治療神經(jīng)病性反應(yīng)和炎性疼痛相關(guān)反應(yīng)。本發(fā)明進一步提供包含抗體Fc區(qū)序列和一個或多個標(biāo)識為以下的序列的融合蛋白SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO 20,SEQ ID N0:22禾口SEQ ID NO :79_130。可使用例如在國際專利申請公開WO 00/24782 中描述的方法制備這種分子，所述專利申請通過引用結(jié)合到本文中。這種分子可例如在哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞)或者細菌細胞(例如大腸桿菌細胞)中表達。在某些方面，本發(fā)明提供包含重鏈和輕鏈的抗體，優(yōu)選單克隆抗體、最優(yōu)選人抗體和人單克隆抗體，其中重鏈包含SEQ ID NO 2,SEQID NO :4或SEQ ID NO :6表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，重鏈的可變區(qū)包含SEQ ID N0:10表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。優(yōu)選重鏈包含SEQ ID N0:4表示的氨基酸序列。在某些方面，本發(fā)明提供包含重鏈和輕鏈的抗體，優(yōu)選人抗體，更優(yōu)選單克隆抗體，最優(yōu)選人單克隆抗體，其中重鏈包含選自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE重鏈恒定區(qū)或其任何等位變異的重鏈恒定區(qū)(如在Kabat等，199Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH 出版號91-3242中所討論，該文獻通過引用結(jié)合到本文中)，重鏈的可變區(qū)包含SEQ ID N0 10表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。優(yōu)選本發(fā)明抗體包含SEQ IDNO 4表示的IgG2重鏈恒定區(qū)氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。在某些方面，本發(fā)明提供包含重鏈和輕鏈的抗體，優(yōu)選人抗體，更優(yōu)選單克隆抗體，最優(yōu)選人單克隆抗體，其中輕鏈包含SEQ ID NO :8表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :12表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。在某些方面，本發(fā)明抗體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO 10表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。在其他方面，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :12表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。在另外的方面，重鏈包含任何SEQ ID NO 14,SEQ ID N0:18或SEQ IDNO 20表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。在還其他方面，輕鏈包含任何SEQ ID NO :16、20、M表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。本發(fā)明還提供特異性結(jié)合NGF的抗體，其中重鏈包含的可變區(qū)包含SEQ ID NO 10 表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，輕鏈包含的可變區(qū)包含SEQ ID NO :12表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。本發(fā)明進一步提供特異性結(jié)合NGF的分離人抗體，其中所述抗體包含(a)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO 79表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :80表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；(b)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO 81表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :82表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；(c)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO 83表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :84表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；或者(d)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO 86表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :87表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。在某些方面，本發(fā)明還提供包含重鏈和輕鏈的抗體，其中重鏈包含重鏈可變區(qū)，且其中重鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO: 10表示的氨基酸序列有至少75%、優(yōu)選80%、更優(yōu)選至少 85%、甚至更優(yōu)選至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、最優(yōu)選約99%—致性的序列，其中輕鏈包含輕鏈可變區(qū)，且其中輕鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO 12 表示的氨基酸序列有至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、91 %、92%、93%、94%、 95%,96%,97%,98%,最優(yōu)選約99%一致性的序列，其中所述抗體特異性結(jié)合NGF。本發(fā)明還提供特異性結(jié)合NGF的抗體，其中重鏈包含SEQ ID NO :14表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，輕鏈包含SEQ ID N0:16表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。在某些方面，本發(fā)明提供包含重鏈和輕鏈的抗體，其中重鏈包含重鏈可變區(qū)，且其中重鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO 14, SEQ ID N0:18或SEQ ID NO :22表示的氨基酸序列有至少75%、優(yōu)選80%、更優(yōu)選至少85%、甚至更優(yōu)選至少90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、最優(yōu)選約99%—致性的序列，其中輕鏈包含輕鏈可變區(qū)，且其中輕鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO :16表示的氨基酸序列有至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、最優(yōu)選約 99% —致性的氨基酸序列， 其中所述抗體特異性結(jié)合NGF。本發(fā)明還提供單鏈抗體、單鏈Fv抗體、F(ab)抗體、F(ab) ’抗體和F(ab’)2抗體。在具體方面，本發(fā)明提供包含SEQ ID NO :16表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段的輕鏈。另外，本發(fā)明提供包含任何SEQ ID NO :14、SEQ ID NO 18或SEQ ID NO 22表示的氨基酸序列或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段的重鏈。本發(fā)明還涉及特異性結(jié)合NGF的分離人抗體，其中所述抗體包含(a)人重鏈構(gòu)架區(qū)、人重鏈⑶Rl區(qū)、人重鏈⑶R2區(qū)和人重鏈⑶R3區(qū)；及(b)人輕鏈構(gòu)架區(qū)、人輕鏈⑶Rl區(qū)、 人輕鏈⑶R2區(qū)和人輕鏈⑶R3區(qū)。在某些方面，人重鏈⑶Rl區(qū)可以是SEQ ID NO 22所示的稱為4D4的單克隆抗體(mAb)的重鏈⑶Rl區(qū)，人輕鏈⑶Rl區(qū)可以是SEQ ID NO 24所示的mAb 4D4的輕鏈⑶Rl區(qū)。在其他方面，人重鏈⑶R2區(qū)可以是SEQ ID NO 18所示的 mAb 4D4的重鏈CDR2區(qū)，人輕鏈CDR2區(qū)可以是SEQ ID NO 20所示的mAb 4D4的輕鏈CDR2 區(qū)。在還其他方面，人重鏈⑶R3區(qū)是SEQ ID NO 14所示的mAb 4D4的重鏈⑶R3區(qū)，人輕鏈⑶R3區(qū)是SEQ ID NO 16所示的mAb 4D4的輕鏈⑶R3區(qū)。本發(fā)明還提供特異性結(jié)合神經(jīng)生長因子的分離人抗體，所述分離人抗體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包含的重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 79、SEQ ID NO :81、SEQ ID NO :83,SEQ ID NO :85或SEQ ID NO :87表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。本發(fā)明也提供特異性結(jié)合NGF的分離人抗體，所述分離人抗體包含重鏈和輕鏈， 其中輕鏈包含的輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 80、SEQ ID NO :82、SEQ ID NO: 84,SEQ ID NO 86,SEQ ID NO :88、SEQ ID NO :89、SEQ ID NO :90、SEQ ID NO :91 或 SEQ ID NO 131表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。本發(fā)明抗體的特征為拮抗與NGF多肽相關(guān)的至少一種體外和/或體內(nèi)活性的能力。優(yōu)選本發(fā)明提供能與NGF多肽高親和性結(jié)合的分離抗人NGF人抗體，其中所述抗體結(jié)合人NGF多肽并以約50xl0~M或更低的解離常數(shù)(Kd)(用KinExA測定)與人NGF多肽解離，或者在體外中和試驗中所述抗體以約ΙχΙΟΛ 或更低的IC5tl抑制NGF誘導(dǎo)的存活。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供具有以下特征的分離抗人NGF人抗體a)在體外中和試驗中以約1x10_9M或更低的IC5tl抑制NGF誘導(dǎo)的存活；b)具有包含SEQ ID NO 14氨基酸序列的重鏈⑶R3 ；c)具有包含SEQ ID NO 16氨基酸序列的輕鏈⑶R3。本發(fā)明還提供以高親和性特異性結(jié)合NGF的分離人抗體或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，其中所述抗體或者片段以約IxlO-9或更低的Kd與人NGF多肽解離，在標(biāo)準的體外試驗中以約1x10_8M或更低的IC5tl中和人NGF生物活性，且其中所述抗體或者片段包含的重鏈可變區(qū)包含a)包含下式氨基酸序列的⑶Rl區(qū)B1B2B3B4B5其中a1是極性親水性氨基酸殘基；a2是芳族氨基酸殘基；a3是脂族、極性疏水性、芳族氨基酸殘基；a4是中性疏水性或脂族氨基酸殘基；a5是脂族或極性親水性氨基酸殘基；b)包含下式氨基酸序列的⑶R2區(qū)bWbVbVbWWWbW其中b1是脂族、極性疏水性或芳族氨基酸殘基；b2是脂族疏水性氨基酸殘基；b3是極性親水性或芳族氨基酸殘基；b4是極性親水性、疏水性或芳族氨基酸殘基；b5_b9獨立是極性親水性或脂族氨基酸殘基；是極性親水性、芳族或脂族氨基酸殘基；b11是芳族或疏水性氨基酸殘基；b12是脂族疏水性或極性親水性氨基酸殘基；b13是脂族、疏水性或極性親水性氨基酸殘基；b14和b16獨立是極性親水性氨基酸殘基；b15是脂族或芳族疏水性氨基酸殘基； b17是脂族酸性氨基酸殘基；c)包含下式氨基酸序列的⑶R3區(qū)
Γ/ι/ / ι 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
L0047」 cccccccccc c c c c c c c其中C1不存在或者是脂族氨基酸殘基；C2不存在或者是極性親水性或芳族疏水性氨基酸殘基；C3和C4獨立是不存在或者極性親水性、芳族疏水性或脂族氨基酸殘基；C5不存在或者是極性親水性、脂族或芳族氨基酸殘基；C6不存在或者是極性親水性或脂族氨基酸殘基； C7是極性親水性或脂族氨基酸殘基；C8是極性親水性、疏水性或芳族氨基酸殘基；C9是極性親水性、脂族或芳族疏水性氨基酸殘基；Ck1是極性親水性、芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸殘基；C11-C13獨立是極性親水性或芳族疏水性氨基酸殘基；C14是脂族或芳族疏水性氨基酸殘基；C15是極性親水性或中性疏水性氨基酸殘基；C16不存在或者是極性親水性氨基酸殘基；C17是芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸殘基。在一個方面，a1是極性親水性氨基酸殘基；a2是芳族疏水性氨基酸殘基；a3是脂族疏水性氨基酸殘基；a4是中性疏水性；a5是極性親水性氨基酸殘基；b1是脂族或芳族氨基酸殘基；b2是Ile ；b3是極性親水性氨基酸殘基；b4是極性親水性或芳族氨基酸殘基；b5_b9獨立是極性親水性或脂族氨基酸殘基；是脂族氨基酸殘基；b11是Tyr ；b12是脂族疏水性氨基酸殘基；b13是脂族或極性親水性氨基酸殘基；b14和b16獨立是極性親水性氨基酸殘基；b15 是脂族疏水性氨基酸殘基；b17是脂族酸性氨基酸殘基；C1不存在或者是脂族氨基酸殘基； C2不存在或者是極性親水性或芳族疏水性氨基酸殘基；C3和C4獨立是不存在或者極性親水性、芳族疏水性或脂族氨基酸殘基；C5不存在或者是極性親水性氨基酸殘基；C6不存在或者是極性親水性或脂族氨基酸殘基；C7是極性親水性或脂族氨基酸殘基；C8是極性親水性、疏水性或芳族氨基酸殘基；C9是極性親水性、脂族或芳族疏水性氨基酸殘基；Cki是極性親水性、芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸殘基；C11-C13獨立是極性親水性或芳族疏水性氨基酸
20殘基；C14是脂族或芳族疏水性氨基酸殘基；C15是極性親水性或中性疏水性氨基酸殘基；C16 不存在或者是極性親水性氨基酸殘基；C17是芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸殘基。在一個具體方面，a1是 Ser,Asp 或 Thr ；a2 是 Tyr ；a3 是 Ala,Ser,Trp 或 Gly ；a4 是 Met 或 Ile ；a5 是 His、Gly 或 Asn ；b1 是 Tyr、Gly、Ile 或 Asp ；b2 是 Ile ；b3 是 kr、Thr、Tyr 或 Asn ；b4 是 Trp> Arg 或 Pro ；b5 是 Ser > Asn 或 Gly ；b6 是 Ser > Arg、Asp 或 Gly ；b7 是 Ser > His 或 Gly ；b8 是 Ser、lie、Asp 或 Thr ；b9 是 Leu、Ile 或 Thr ；b10 是 Gly, Lys 或 Phe ；b11 是 Tyr ；b12 是 Ala 或 Ser ；b13 是 Asp,Gly 或 Pro ；b14 是 Ser ；b15 是 Val 或 Phe ；b16 是 Lys 或 Gln ； b17是Gly ；C1不存在或是脂族氨基酸殘基；C2不存在或是Tyr ；C3和C4獨立是不存在、Tyr, Asn,Val 或 Glu ；C5 是不存在、Ser、Gly 或 Trp ；C6 是不存在、Ser、Gly、Glu 或 Leu ；C7 是 Gly, Arg 或 Asp ；C8 是 Trp、Pro、Ser 或 Thr ；C9 是 His、Gly 或 Tyr ；Cici 是 Val、Tyr 或 Arg ；C11-C13 獨立是 Ser、Phe、Tyr、Asp 或 Asn ；c14 是 Phe、Val 或 Gly ；c15 是 Met 或 Asp ；c16 是不存在、 Asp 或 Asn ； C17 是 Tyr 或 Val。在另一個具體方面，a1是Ser或Asp ；a2是Tyr ；a3是Ala或^^ ；a4是Met或Ile ； a5 是 His 或 Asn ；b1 是 Tyr 或 Gly ；b2 是 Ile ；b3 是 kr、Thr、Tyr 或 Asn ；b4 是 ρ、Arg 或 Pro ；b5 是 Ser 或 Asn ；b6 是 Ser 或 Arg ；b7 是 His 或 Gly ；b8 是 Ile 或 Thr ；b9 是 Leu、Ile 或 Thr ；b10 是 Gly 或 Phe ；b11 是 Tyr ；b12 是 Ala 或 Ser ；b13 是 Asp 或 Gly ；b14 是 Ser ；b15 是 Val 或Phe ；b16是Lys或Gln ；b17是Gly ；C1不存在或是Gly ；C2不存在或是Tyr ；C3和C4獨立是不存在、Tyr、Gly或Val ；C5不存在或是Ser ；C6是Ser或Gly ；C7是Gly或Arg ；C8是Trp或 Pro ；C9 是 His,Gly 或 Tyr ；c10 是 Val 或 Tyr ；C11-C13 獨立是 Ser,Tyr,Phe 或 Asp ；c14 是 Phe 或 Val ；C15 是 Met 或 Asp ；c16 不存在或是 Asp ；c17 是 Tyr 或 Val。在其他具體方面a)重鏈⑶Rl具有SEQ ID NO 22表示的氨基酸序列，重鏈⑶R2具有SEQ ID NO 18表示的氨基酸序列，重鏈⑶R3具有SEQ ID NO 14表示的氨基酸序列；b)重鏈CDRl具有SEQ ID NO 92表示的氨基酸序列，重鏈CDR2具有SEQ ID NO 93表示的氨基酸序列，重鏈⑶R3具有SEQ ID NO 94表示的氨基酸序列；c)重鏈⑶Rl具有SEQ ID NO 98表示的氨基酸序列，重鏈⑶R2具有SEQ ID NO 99表示的氨基酸序列，重鏈⑶R3具有SEQ ID NO :100表示的氨基酸序列；d)重鏈⑶Rl具有SEQ ID NO :104表示的氨基酸序列，重鏈⑶R2具有SEQ ID NO 105表示的氨基酸序列，重鏈⑶R3具有SEQ ID NO :106表示的氨基酸序列；e)重鏈⑶Rl具有SEQ ID NO :110表示的氨基酸序列，重鏈⑶R2具有SEQ ID NO 111表示的氨基酸序列，重鏈⑶R3具有SEQ ID NO :112表示的氨基酸序列；f)重鏈⑶Rl具有SEQ ID NO :116表示的氨基酸序列，重鏈⑶R2具有SEQ ID NO 117表示的氨基酸序列，重鏈⑶R3具有SEQ ID NO :118表示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供特異性結(jié)合NGF的分離人抗體或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，其中所述抗體或其片段包含的輕鏈可變區(qū)包含a)包含下式氨基酸序列的⑶Rl區(qū) 其中a1是極性親水性氨基酸殘基；a2、a"和a12獨立是脂族或疏水性氨基酸殘基；a3、a5、a7和a8獨立是脂族、極性親水性或疏水性氨基酸殘基；a4是極性親水性氨基酸殘基；a6是脂族或疏水性氨基酸殘基；a9不存在，或是脂族或極性親水性氨基酸殘基；^是脂族、芳族或疏水性氨基酸殘基；b)包含下式氨基酸序列的⑶R2區(qū)bWbVbV其中b1是脂族、極性疏水性或疏水性氨基酸殘基；b2是脂族或疏水性氨基酸殘基；b3和 b4獨立是極性親水性、脂族或疏水性氨基酸殘基；b5是極性親水性或脂族疏水性氨基酸殘基；b6是極性親水性或脂族疏水性氨基酸殘基；b7是極性親水性氨基酸殘基；c)包含下式氨基酸序列的⑶R3區(qū)
Γ/ι/ιι/ι 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
L0070」 cccccccccc c c c c c c c其中C1和C2獨立是極性親水性氨基酸殘基；C3是極性親水性、脂族或疏水性氨基酸殘基；c4、C5和C6獨立是脂族、極性親水性或疏水性氨基酸殘基；C7不存在或者是極性親水性或脂族疏水性氨基酸殘基；C8是極性親水性或疏水性氨基酸殘基；C9是極性親水性氨基酸殘基，且其中所述抗體或者片段以約lxl0_9或更低的Kd與人NGF多肽解離，在標(biāo)準的體外試驗中以約1x10_8M或更低的IC5tl中和人NGF生物活性。在一個方面，a1、a3、a4、a7和a8獨立是極性親水性氨基酸殘基；a2、a6、a11和a12獨立是脂族疏水性氨基酸殘基；a5是極性親水性或脂族氨基酸殘基；a9不存在，或是脂族或極性親水性氨基酸殘基；是脂族或芳族氨基酸殘基；b1是脂族、極性疏水性或疏水性氨基酸殘基；b2是脂族疏水性氨基酸殘基；b3、b4和b7獨立是極性親水性氨基酸殘基；b5和b6獨立是極性親水性或脂族疏水性氨基酸殘基；C1和C2獨立是極性親水性氨基酸殘基；C3是極性親水性、脂族或疏水性氨基酸殘基；c4、C5和C6獨立是脂族、極性親水性或疏水性氨基酸殘基；C7不存在或是脂族疏水性氨基酸殘基；C8是疏水性氨基酸殘基；C9是極性親水性氨基酸殘基。在一個具體方面，a^a^a4和a7分別是Argjer、Gln和kr ；a2是Ala ；a5是Gly或 Ser ；a8 是 Ser 或 Ile ；a9 是不存在、Ser 或 Gly ；a10 是 Ala、Tyr、Trp 或 Phe ；b1 是 Asp、Gly, Ala 或 Val ；b2 和 b3 分別是 Ala 和 Ser ；b4 是 Ser 或 Asn ；b5 是 Leu 或 Arg ；b6 是 Glu、Ala 或 Gln ；b7 是 Ser 或 Thr ；C1 和 C2 是 Gln ；C3 是 Phe,Tyr,Arg 或 Ala ；C4 是 AsruGly 或 Ser ；C5 是 Ser 或 Asn ；C6 是 Tyr、Ser、Trp 或 Phe ；C7 是不存在、Pro 或 His ；c8 是 Leu> Trp>Tyr 或 Arg ； C9 是 Thr0在另一個具體方面，a1、a2、a3、a4和 a7 分別是 Arg、Ala、Ser、Gln 和 Ser ；a5 是 Gly 或 kr ；a8 是 Ser 或 Ile ；a9 是不存在、Ser 或 Gly ；a10 是 Ala 或 Tyr ；b1 是 Asp 或 Gly ；b2 和 b3 分別是 Ala 和 Ser ；b4 是 Ser 或 Asn ；b5 是 Leu 或 Arg ；b6 是 Glu、Ala 或 Gln ；b7 是 Ser 或 Thr ；C1 和 C2 是 Gln ；C3 是 Phe、Tyr, Arg 或 Ala ；C4 是 Asn、Gly 或 Ser ；C5 是 Ser 或 Asn ；C6 是 Tyr、Ser、Trp 或 Phe ；C7 是不存在、Pro 或 His ;c8 是 Leu、Trp, Tyr 或 Arg ；c9 是 Thr。在其他具體方面a)輕鏈CDRl具有SEQ ID NO 24表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO 20表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R3具有SEQ ID NO 16表示的氨基酸序列；
b)輕鏈CDRl具有SEQ ID NO 95表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO 96表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R3具有SEQ ID NO 97表示的氨基酸序列；c)輕鏈⑶Rl具有SEQ ID NO :101表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R2具有SEQ ID NO 102表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R3具有SEQ ID NO :103表示的氨基酸序列；d)輕鏈CDRl具有SEQ ID NO :107表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO 108表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R3具有SEQ ID NO :109表示的氨基酸序列；e)輕鏈⑶Rl具有SEQ ID NO :113表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R2具有SEQ ID NO 114表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R3具有SEQ ID NO :115表示的氨基酸序列；f)輕鏈⑶Rl具有SEQ ID NO :119表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R2具有SEQ ID NO 120表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R3具有SEQ ID NO :121表示的氨基酸序列；g)輕鏈⑶Rl具有SEQ ID NO :122表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R2具有SEQ ID NO 123表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R3具有SEQ ID NO 124表示的氨基酸序列；h)輕鏈CDRl具有SEQ ID NO :125表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO 126表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R3具有SEQ ID NO :127表示的氨基酸序列；i)輕鏈⑶Rl具有SEQ ID NO 128表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R2具有SEQ ID NO 129表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R3具有SEQ ID NO :130表示的氨基酸序列；j)輕鏈⑶Rl具有SEQ ID NO :132表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R2具有SEQ ID NO 133表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R3具有SEQ ID NO :134表示的氨基酸序列。同時本發(fā)明的一部分是編碼新型抗人NGF人抗體的多核苷酸序列、包含編碼抗人 NGF人抗體的多核苷酸序列的載體、用摻入編碼抗人NGF人抗體的多核苷酸的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞、包含抗人NGF人抗體的制劑以及制備和使用所述制劑的方法。本發(fā)明還提供檢測生物樣品中的NGF水平的方法，所述方法包括將樣品與本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段接觸的步驟。本發(fā)明的抗NGF抗體可應(yīng)用于任何已知的分析測定方法，如競爭性結(jié)合測定、直接和間接夾心測定、免疫沉淀測定及酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA) (參見 Sola，1987, Monoclonal Antibodies :A Manual of Techniques,第 147-158 頁，CRC Press, Inc.)，以對NGF進行檢測和定量。本發(fā)明抗體能以適合于所采用的分析測定方法的親和性結(jié)合NGF。此外，本發(fā)明提供與NGF產(chǎn)生提高或者與對NGF敏感性提高有關(guān)的疾病的治療方法，所述方法包括將藥學(xué)有效量的包含至少一種本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段的藥物組合物給予有需要個體的步驟。由某些優(yōu)選實施方案的以下更詳細描述以及權(quán)利要求書，本發(fā)明具體的優(yōu)選實施方案將變得顯而易見。附圖簡述

圖1描繪的圖顯示在基于DRG神經(jīng)元的中和生物測定中，從雜交瘤條件培養(yǎng)基純化的4D4單克隆抗體對NGF活性的中和作用。圖2描繪的圖顯示由人NGF活性刺激的VRl表達，以及在基于DRG神經(jīng)元的中和生物測定中，從雜交瘤條件培養(yǎng)基純化的抗NGF單克隆抗體(4D4)對NGF活性的中和作用。圖3描繪的圖顯示在基于DRG神經(jīng)元的中和生物測定中，在滾瓶(R)或在旋動瓶 (S)培養(yǎng)的細胞中表達為IgGl或IgG2的瞬時表達重組抗NGF 4D4單克隆抗體對NGF活性
23的中和作用。圖4描繪神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的序列比對。序列上方的編號和二級結(jié)構(gòu)元件指的是成熟人NGF。保守殘基用星號標(biāo)示，具有較低序列同源性的區(qū)域用陰影標(biāo)示。人類NGF是SEQ ID NO :135 ；小鼠 NGF 是 SEQID NO :136 ；BDNF 是 SEQ ID NO :137 ；NT3 是 SEQ ID NO :138。圖 5 顯示 14D10(SEQ ID NO :98)、6H9 (SEQ ID NO :104)、7H2 (SEQ ID NO :110), 4G6 (SEQ ID NO :116)、14D11 (SEQ ID NO :92)和 4D4(SEQ ID NO :22)抗體的抗NGF CDRl 重鏈比對和一致性百分率。圖 6 顯示 14D10(SEQ ID NO :99)、6H9 (SEQ ID NO :105)、7H2 (SEQ ID NO :111)、 4G6 (SEQ ID NO :117)、14D11 (SEQ ID NO :93)和 4D4(SEQ ID NO :18)抗體的抗NGF CDR2 重
鏈比對和一致性百分率。圖 7 顯示 14D10(SEQ ID NO 100)、6H9 (SEQ ID NO 106)、7H2 (SEQ ID NO :112)、 4G6 (SEQ ID NO :118)、14D11 (SEQ ID NO :94)和 4D4(SEQ ID NO :14)抗體的抗NGF CDR3 重
鏈比對和一致性百分率。圖 8 顯示 14D10(SEQ ID NO :95)、6H9 (SEQ ID NO :107)、7H2 (SEQ ID NO :113)、 4G6a(SEQ ID NO :119)、4G6b(SEQ ID NO : 122)、4G6c(SEQ ID NO :125)、4G6d(SEQ ID NO:
128)、4G6e(SEQID NO :132)、14D11 (SEQ ID NO :95)和 4D4(SEQ ID NO :24)抗體的抗 NGFCDR1輕鏈比對和一致性百分率(各圖中的20031(^8340指4G6a ；各圖中的20031(^8；351 指4G6b ；各圖中的200310715 指4G6c ；各圖中的20031(^8；344指4G6d ；各圖中的 20031000528 指 4G6e)。圖 9 顯示 14D10(SEQ ID NO :96)、6H9 (SEQ ID NO :108)、7H2 (SEQ ID NO :114)、 4G6a(SEQ ID NO : 120)、4G6b(SEQ ID NO : 123)、4G6c(SEQ ID NO :126)、4G6d(SEQ ID NO:
129)、4G6e(SEQID NO :133)、14D11 (SEQ ID NO :96)和 4D4(SEQ ID NO :20)抗體的抗 NGFCDR2輕鏈比對和一致性百分率(各圖中的20031(^8340指4G6a ；各圖中的20031(^8；351 指4G6b ；各圖中的200310715 指4G6c ；各圖中的20031(^8；344指4G6d ；各圖中的 20031000528 指 4G6e)。圖 10 顯示 14D10(SEQ ID NO :97)、6H9 (SEQ ID NO : 109)、7H2 (SEQ ID NO :115)、 4G6a(SEQ ID NO : 121)、4G6b(SEQ ID NO : 124)、4G6c(SEQ ID NO :127)、4G6d(SEQ ID NO:
130)、4G6e(SEQID NO :134)、14D11 (SEQ ID NO :97)和 4D4(SEQ ID N0:16)抗體的抗 NGFCDR3輕鏈比對和一致性百分率(各圖中的20031(^8340指4G6a ；各圖中的20031(^8；351 指4G6b ；各圖中的200310715 指4G6c ；各圖中的20031(^8；344指4G6d ；各圖中的 20031000528 指 4G6e)。圖 11 顯示 14D10(SEQ ID NO :82)、6H9 (SEQ ID NO :84)、7H2 (SEQ ID NO :86)、 4G6a(SEQ ID NO :88)、4G6b(SEQ ID NO :89)、4G6c(SEQ ID NO :90)、4G6d(SEQ ID NO :91)、 4G6e (SEQ ID NO :131)、14D11 (SEQ ID NO :80)和 4D4(SEQ ID NO :12)抗體的抗 NGF 輕鏈比對和一致性百分率(各圖中的20031028340指4G6a ；各圖中的20031028351指4G6b ；各圖中的200310715 指4G6c ；各圖中的20031(^8；344指4G6d ；各圖中的200310005 指 4G6e)。圖 12 顯示 4D4(SEQ ID NO :10)、4G6 (SEQ ID NO :87)、14D10 (SEQ ID NO :81)、 14D11(SEQ ID NO :79)、7H2 (SEQ ID NO :85)和 6H9 (SEQ ID NO :83)抗體的抗 NGF 重鏈比對和一致性百分率。某些優(yōu)選實施方案的詳細描述本文在此使用的章節(jié)標(biāo)題只是出于組織目的，不應(yīng)解釋為對所描述的主題進行限制。對于任何目的，本申請中引用的所有參考文獻通過引用結(jié)合到本文中。定義對于重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(例如電穿孔法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法)可使用常規(guī)技術(shù)。酶反應(yīng)和純化技術(shù)可按照廠商說明書或者按照本領(lǐng)域常用的方式或者按照本文的描述來進行。上述技術(shù)和方法通?？砂凑毡绢I(lǐng)域公知的方法，或者如本說明書中引用和討論的各種一般及更具體的參考文獻所述來進行。參見例如Sambrook等，2001， MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL,第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，N. Y.，對于任何目的其通過引用結(jié)合到本文中。除非提供了具體的定義，本文描述的涉及分析化學(xué)、合成有機化學(xué)及醫(yī)學(xué)和藥物化學(xué)的術(shù)語及實驗室方法和技術(shù)，是本領(lǐng)域所公知和常用的。同樣，可將常規(guī)技術(shù)用于化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、制劑和傳遞以及患者的治療。依照本發(fā)明公開內(nèi)容應(yīng)用的以下術(shù)語，除非另有指明，應(yīng)被理解為具有以下含義 有關(guān)本發(fā)明抗體的詞組“生物性質(zhì)”、“生物特征”和術(shù)語“活性”在本文中可互換使用，包括但不限于表位親和性和特異性(例如抗人NGF人抗體與人NGF的結(jié)合)、拮抗靶多肽的活性 (例如NGF活性)的能力、抗體的體內(nèi)穩(wěn)定性以及抗體的免疫原性性質(zhì)。本領(lǐng)域公認的抗體其他可鑒定生物性質(zhì)或者特征包括例如交叉反應(yīng)性(通常也就是與靶多肽的非人類同源物或者與其他蛋白質(zhì)或組織的交叉反應(yīng)性)，以及在哺乳動物細胞中保持蛋白質(zhì)高表達水平的能力。上述性質(zhì)或特征可用本領(lǐng)域公認的技術(shù)來觀察或測定，包括但不限于ELISA、 競爭性ELISA、表面等離子共振分析、體外和體內(nèi)中和試驗(例如實施例2)以及用不同來源(包括人類、靈長類動物或者任何其他可能需要的來源)的組織切片進行的免疫組織化學(xué)分析。抗人NGF人抗體的具體活性和生物性質(zhì)在下文實施例中有更詳細的描述。本文所用的術(shù)語“分離多核苷酸”應(yīng)當(dāng)指基因組、cDNA的多核苷酸，或者合成起源的多核苷酸，或者它們的某些組合，由于其來源，分離多核苷酸(1)與其中天然發(fā)現(xiàn)該分離多核苷酸的多核苷酸的全部或一部分無關(guān)，( 與其天然不相連的多核苷酸相連，或者(3) 沒有作為更大序列的一部分天然出現(xiàn)。本文所指的術(shù)語“分離蛋白”意指主題蛋白質(zhì)(1)沒有至少某些其通常發(fā)現(xiàn)與其伴隨的其他蛋白質(zhì)，( 基本沒有相同來源(例如相同物種)的其他蛋白質(zhì)，(3)由不同物種的細胞表達，(4)與至少約50%的與其天然相關(guān)的多核苷酸、脂質(zhì)、碳水化合物或其他物質(zhì)分離，( 不與該“分離蛋白”天然相連的蛋白質(zhì)部分(通過共價或非共價相互作用)相連，(6)與其天然不相連的多肽(通過共價或非共價相互作用)有效相連，或者(7)在自然界中不出現(xiàn)。這種分離蛋白可由基因組DNA、cDNA、mRNA或合成起源的其他RNA，或者它們的任何組合來編碼。優(yōu)選分離蛋白與見于其所在天然環(huán)境、會干擾其用途(治療、診斷、預(yù)防、研究或者其他用途)的蛋白質(zhì)或多肽或其他污染物基本分開。“分離”抗體是已被鑒定且已與其所在天然環(huán)境的組分分離和/或從中回收的抗體。抗體天然環(huán)境中的污染成分是會干擾其診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素及其他蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，抗體將被純化(1)至超過Lowry法測定的抗體的95% (重量)，最優(yōu)選超過99% (重量)，(2)至足以獲得至少15個N端或者內(nèi)部氨基酸殘基序列(通過使用旋杯式測序儀)的程度，( 至均一(通過在還原或非還原條件下使用考馬斯藍染色或優(yōu)選銀染色進行SDS-PAGE)。分離抗體包括重組細胞內(nèi)部的原位抗體，因為至少一種抗體的天然環(huán)境的組分不存在。術(shù)語“多肽”或“蛋白質(zhì)”指具有天然蛋白質(zhì)序列的分子，即由天然細胞和具體非重組細胞，或者遺傳工程細胞或重組細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，包括具有天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列的分子，或者缺失、插入和/或置換天然序列的一個或多個氨基酸的分子。術(shù)語“多肽”和 “蛋白質(zhì)”明確包涵抗NGF抗體或缺失、插入和/或置換抗NGF抗體的一個或多個氨基酸的序列。術(shù)語“多肽片段”指具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或內(nèi)部缺失的多肽。在某些實施方案中，片段至少長為5至約500個氨基酸。可以理解，在某些實施方案中，片段至少長為 5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400 或 450 個氨基酸。特別有用的多肽片段包括功能域，包括結(jié)合域在內(nèi)。在抗NGF抗體的情況中，有用的片段包括但不限于CDR區(qū)、重鏈或輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域、抗體鏈的一部分或者正好是其包括兩個CDR的可變區(qū)等等。術(shù)語“特異性結(jié)合物”指特異性結(jié)合靶標(biāo)的天然或非天然分子。特異性結(jié)合物的實例包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、核酸、碳水化合物和脂質(zhì)。在某些實施方案中，特異性結(jié)合物是抗體。術(shù)語“NGF的特異性結(jié)合物”指特異性結(jié)合NGF的任何部分的特異性結(jié)合物。在某些實施方案中，NGF的特異性結(jié)合物是特異性結(jié)合NGF的抗體。本文所用術(shù)語“免疫功能性免疫球蛋白片段”指含有至少免疫球蛋白重鏈和輕鏈的CDR的多肽片段。本發(fā)明的免疫功能性免疫球蛋白片段能夠結(jié)合抗原。在優(yōu)選的實施方案中，抗原是特異性結(jié)合受體的配體。在這些實施方案中，本發(fā)明的免疫功能性免疫球蛋白片段的結(jié)合防止配體與其受體結(jié)合，阻斷由于配體與受體結(jié)合而產(chǎn)生的生物反應(yīng)。優(yōu)選本發(fā)明免疫功能性免疫球蛋白片段特異性結(jié)合NGF。最優(yōu)選所述片段特異性結(jié)合人NGF。本文所用的應(yīng)用于某個對象的“天然”指該對象可在自然界中找到。例如，存在于可從自然界來源分離到的生物體(包括病毒)、且未被人們有意修飾的多肽或多核苷酸序列是天然的。術(shù)語“有效連接”指該術(shù)語所指的組分處于允許它們在合適的條件下執(zhí)行其固有功能的關(guān)系之中。例如，與蛋白質(zhì)編碼序列“有效連接”的控制序列連接到該編碼序列，從而在與控制序列的轉(zhuǎn)錄活性相容的條件下，蛋白質(zhì)編碼序列的表達得以實現(xiàn)。本文所用術(shù)語“控制序列”指能夠?qū)崿F(xiàn)它們所連接的編碼序列的表達、加工或胞內(nèi)定位的多核苷酸序列。這種控制序列的種類可能取決于宿主生物體。在具體實施方案中， 原核生物的控制序列可包括啟動子、核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止序列。在其他具體實施方案中，真核生物的控制序列可包括包含一個或多個轉(zhuǎn)錄因子的識別位點的啟動子、轉(zhuǎn)錄增強序列、轉(zhuǎn)錄終止序列和聚腺苷酸化序列。在某些實施方案中，“控制序列”可包括前導(dǎo)序列禾口 / 或融合伴侶序列(fusion partner sequence)。本文所指的術(shù)語“多核苷酸”意指長度為至少10個核苷酸的單鏈或雙鏈核酸聚合物。在某些實施方案中，包含多核苷酸的核苷酸可為核糖核酸或脫氧核糖核酸或任何類型的核苷酸的修飾形式。所述修飾包括如堿基修飾如溴尿苷(bromuridine)、核糖修飾如阿拉伯糖苷和2’，3’ - 二脫氧核糖及核苷酸間鍵修飾如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯 (phoshoraniladate)和氨基磷酸酯。術(shù)語“多核苷酸”明確包括單鏈和雙鏈形式的DNA。本文所指術(shù)語“寡核苷酸”包括通過天然和/或非天然寡核苷酸鍵連接在一起的天然的和修飾的核苷酸。寡核苷酸是多核苷酸的子集，包含通常為單鏈且長度為200個核苷酸或更少的成員。在某些實施方案中，寡核苷酸的長度為10-60個核苷酸。在某些實施方案中，寡核苷酸的長度為12、13、14、15、16、17、18、19或20-40個核苷酸。寡核苷酸可以是單鏈或雙鏈，例如用于構(gòu)建遺傳突變體。本發(fā)明的寡核苷酸對于蛋白質(zhì)編碼序列可以是有義或反義寡核苷酸。術(shù)語“天然核苷酸”包括脫氧核糖核酸和核糖核酸。術(shù)語“修飾核苷酸”包括帶有修飾或取代糖基等的核苷酸。術(shù)語“寡核苷酸鍵”包括寡核苷酸鍵如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺基磷酸酯、氨基磷酸酯等。參見例如 LaPlanche 等，1986，Nucl. Acids Res.，M :9081 ；Stec 等，1984，J. Am. Chem. Soc.， 106 6077 ；Stein 等，1988，Nucl. Acids Res. ,16 3209 ；Zon 等，1991，Anti-Cancer Drug Design，^ :539 ;Zon等，1991，OLIGONUCLEOTIDES AND ANALO⑶ES :A PRACTICALAPPROACH，第 87-108 頁(F. Eckstein 編輯)，Oxford University Press,Oxford England ;Stec 等，美國專利第 5，151，510 號；Uhlmann 禾Π Peyman, 1990，Chemical Reviews, 90 :543，對于任何目的這些文獻的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。寡核苷酸可包括可檢測標(biāo)記，以便能進行寡核苷酸或其雜交的檢測。術(shù)語“載體”包括能夠轉(zhuǎn)運其所連接的另一種核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)?！?，其指另外的DNA節(jié)段可與其連接的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中另外的DNA片段可連接至病毒基因組中。某些載體能夠在引入它們的宿主細胞中自主復(fù)制(例如具有細菌復(fù)制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如非附加型哺乳動物載體)在被引入到宿主細胞時可整合到宿主細胞的基因組中，從而隨著宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)它們有效連接的基因的表達。這種載體在本文中稱為“重組表達載體”(或簡稱“表達載體”)。一般的說，在重組DNA技術(shù)中有用的表達載體往往以質(zhì)粒的形式出現(xiàn)。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因為質(zhì)粒是最常用的載體形式。但是，本發(fā)明包括這種其他類型的表達載體，例如發(fā)揮等同功能的病毒載體(例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。詞組“重組宿主細胞”(或簡稱“宿主細胞”)包括重組表達載體已引入其中的細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，這種術(shù)語不僅指具體對象細胞，而且指這種細胞的后代。因為由于變異或環(huán)境影響，在以后的各代中可能出現(xiàn)某些修飾，這種后代實際上可不與母細胞完全相同，但它們?nèi)园ㄔ诒疚乃玫男g(shù)語“宿主細胞”的范圍內(nèi)。有很多種宿主表達系統(tǒng)可用于表達本發(fā)明抗體，包括細菌、酵母、桿狀病毒和哺乳動物表達系統(tǒng)(以及噬菌體展示表達系統(tǒng))。合適的細菌表達載體的實例是PUC19。為重組表達抗體，用一種或多種攜有編碼抗體免疫球蛋白輕鏈和重鏈的DNA片段的重組表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞，以使輕鏈和重鏈在宿主細胞中表達，并優(yōu)選被分泌到培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基中，從所述培養(yǎng)基中可回收到抗體。用標(biāo)準的重組DNA方法獲得重鏈和輕鏈基因，將這些基因摻入到重組表達載體中，并將載體引入到宿主細胞中，例如Sambrook等，2001，MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratories,Ausubel,F. M.等(編輯)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates, (1989)及 Boss 等的美國專利第 4,816, 397號中所述。術(shù)語“宿主細胞”用以指已用或者能夠用核酸序列轉(zhuǎn)化，然后能夠表達選定的目的基因的細胞。該術(shù)語包括母細胞的后代，不論所述后代是否在形態(tài)上或在遺傳結(jié)構(gòu)上與原始親本完全相同，只要選定的基因存在即可。術(shù)語“轉(zhuǎn)導(dǎo)”用以指基因從一個細菌轉(zhuǎn)移到另一個細菌，通常通過噬菌體轉(zhuǎn)移。“轉(zhuǎn)導(dǎo)”還指通過逆轉(zhuǎn)錄病毒獲得和轉(zhuǎn)移真核細胞序列。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”用以指細胞攝入外來或外源DNA，當(dāng)外源DNA已被引入到細胞膜之內(nèi)時，細胞即被“轉(zhuǎn)染”。有多種轉(zhuǎn)染技術(shù)為本領(lǐng)域所公知并公開于本文中。參見例如 Graham 等，1973，Virology52 :456 ；Sambrook 等，2001，MOLECULAR CLONING, ALAB0RAT0RY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratories ；Davis等，1986，BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier ；及Chu等，1981，Gene旦197。這種技術(shù)可用以將一種或多種外源DNA 部分引入到合適的宿主細胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”在本文中用以指細胞的遺傳特征的變化，當(dāng)細胞已被修飾從而包含新的DNA時，細胞即被轉(zhuǎn)化。例如，在細胞由其天然狀態(tài)被遺傳修飾的情況中，該細胞被轉(zhuǎn)化。 轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)之后，轉(zhuǎn)化DNA可通過在物理整合到細胞的染色體中與細胞的DNA重組，或者可作為不復(fù)制的附加型元件而短暫保持，或者可作為質(zhì)粒而獨立復(fù)制。當(dāng)轉(zhuǎn)化DNA隨著細胞的分裂而復(fù)制時，認為該細胞已被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。當(dāng)術(shù)語“天然出現(xiàn)的”或“天然的”用于生物材料如核酸分子、多肽、宿主細胞等等時，指可在自然界中發(fā)現(xiàn)且未被人操控的材料。同樣，本文所用的“非天然出現(xiàn)的”或“非天然的”指未在自然界中發(fā)現(xiàn)的或者已被人結(jié)構(gòu)修飾或合成的材料。術(shù)語“抗原”指能由選擇性結(jié)合物如抗體結(jié)合的分子或分子部分，所述分子或分子部分另外還能夠用于動物中以產(chǎn)生能夠結(jié)合該抗原表位的抗體?？乖哂幸粋€或多個表位。本領(lǐng)域所公知的術(shù)語“一致性”指通過比較兩種或更多種多肽分子的序列或者兩種或更多種核酸分子的序列而確定的所述序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域中，“一致性”也指通過兩個或更多個核苷酸序列鏈之間或者兩個或更多個氨基酸序列鏈之間的配對情況確定的，核酸分子之間或多肽之間(視情況而定)的序列相關(guān)性的程度?！耙恢滦浴睖y定的是兩個或更多個序列中(共有的)較小一個的相同配對百分率，空位比對(如果有)通過特殊的數(shù)學(xué)模型或計算機程序(即“算法”)來處理。術(shù)語“相似性”在本領(lǐng)域中用以指相關(guān)的概念，但與“一致性”不同的是，“相似性” 指的是相關(guān)性的度量，其包括完全相同的配對和保守置換的配對。如果兩個多肽序列具有例如1(V20的相同氨基酸，其余的均為非保守置換，則一致性百分率和相似性百分率均為 50%。在同一個實例中，如果還有5個位置為保守置換，則一致性百分率仍為50%，但相似性百分率將為75% (15/20)。因此，在存在保守置換的情況下，兩個多肽之間的相似性百分率將高于這兩個多肽之間的一致性百分率。相關(guān)核酸和多肽的一致性和相似性可通過公知的方法容易地計算出來。這種方法包括但不限于 COMPUTATIONAL M0LECULARBI0L0GY, (Lesk, Α. Μ.編輯)，1988，Oxford University Press, New York ；BIOCOMPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, (Smith, D. W.編輯)，1993，Academic Press, New York ；COMPUTERANALYSIS OF SEQUENCE DATA, Part 1，(Griffin, A. M.和 Griffin, H. G.編輯)，1994，Humana Press, New Jersey ； von Heinje, G. , SEQUENCEANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY,1987, Academic Press ； SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, (Gribskov, M.和 Devereux, J.編輯)，1991，Μ. Stockton Press, New York ;Carillo 等，1988，SIAM J. Applied Math.，巡1073 ；及 Durbin 等，1998， BIOLOGICAL SEQUENCEANALYSIS, Cambridge University Press 中描述的那些方法。優(yōu)選的一致性測定方法被設(shè)計成在受試序列之間產(chǎn)生最大程度的配對。一致性測定方法在可公開獲得的計算機程序中有描述。優(yōu)選的測定兩個序列之間一致性的計算機程序方法包括但不限于GCG程序包，包括GAP (Devereux等，1984，Nucl. Acid. Res. ,12 387 ； Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP、BLASTN 禾口 FASTA (Altschul 等，1990，J. Mol. Biol. ,215 :403-410)。BLASTX 程序可從美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)和其他來源公開獲得(BLAST 手冊，Altschul 等 NCB/NLM/NIH Bethesda，MD 20894 ；Altschul 等，1990，出處同上)。也可用著名的Smith Waterman算法測定一致性。某些用以比對兩個氨基酸序列的比對方案可能導(dǎo)致兩個序列中只有較短一段區(qū)域配對，而這個較小的比對區(qū)域可具有非常高的序列一致性，盡管兩個全長序列之間并沒有顯著的關(guān)系。因此，在某些實施方案中，選定的比對方法(GAP程序)將導(dǎo)致跨越靶多肽的至少50個連續(xù)氨基酸的比對。例如，使用GAP 計算機算法(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)，比對兩個待測定序列一致性百分率的多肽，以對它們各自的氨基酸進行最佳配對。(“配對范圍”，由算法確定)。在某些實施方案中，空位開放罰分(將計算為3乘以平均對角線；其中“平均對角線”是所用的比較矩陣的對角線的平均值；“對角線”是由具體比較矩陣分配給各個完全氨基酸配對的分數(shù)或數(shù)值)和空位拓展罰分(其通常為空位開放罰分的十分之一)，以及比較矩陣如PAM250或BLOSUM 62與算法一起使用。 在某些實施方案中，算法中也使用標(biāo)準的比較矩陣(PAM 250比較矩陣參見Dayhoff等， 1978，Atlas of Protein Sequence and Structure, 5 :345-352 ；BLOSUM 62 比較失巨陣參見 Henikoff 等，1992，Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89 :10915-10919)。在某些實施方案中，用于多肽序列比較的參數(shù)包括以下算法Needleman等，1970，J. Mol. Biol.，堅443-453 ；比較矩陣=Henikoff 等，1992(出處同上)的 BLOSUM 62 ；空位罰分12空位長度罰分4相似性閾值0GAP程序可使用以上參數(shù)。在某些實施方案中，上述參數(shù)是使用GAP算法進行多肽比較的默認參數(shù)(末端空位無罰分)。術(shù)語“同源性”指蛋白質(zhì)或核酸序列之間的相似性程度。同源信息用于理解某些蛋白質(zhì)或核酸種類的遺傳相關(guān)性。可通過比對和比較序列來確定同源性。通常，為確定氨
29基酸同源性，將蛋白質(zhì)序列與已知蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)庫進行比較。同源序列在其序列上的某處享有共同的功能一致性。盡管較低程度的相似性或一致性并不一定表示缺乏同源性， 但較高程度的相似性或一致性通常表示有同源性。有幾種方法可用來比較一個序列的氨基酸與另一個序列的氨基酸，以確定同源性。通常，這些方法分為以下兩類(1)比較物理特征如極性、電荷和范德華體積，以產(chǎn)生相似性矩陣；(2)基于對來自已知同源蛋白質(zhì)的許多蛋白質(zhì)序列的觀察，比較序列中的氨基酸被任何其他氨基酸的可能置換，以產(chǎn)生可接受點突變矩陣(PAM)。也可使用作為Vector NTI suite 9. 0. 0軟件包模塊的程序needle (EMBOSS包) 或stretcheHEMBOSS程序包)或程序align X，采用默認參數(shù)(例如，空位罰分5，空位開放罰分15，空位拓展罰分6. 6)，計算一致性百分率。本文所用的二十個常見氨基酸及其縮寫遵循常規(guī)用法。參見IMMUN0L0GY-A SYNTHESIS,第 2 版，(E. S. Golub 禾口 D. R. Gren,編輯),Sinauer Associates :Sunderland, MA，1991，對于任何目的其通過引用結(jié)合到本文中。二十個常見氨基酸的立體異構(gòu)體(例如 D-氨基酸)；非天然氨基酸如α-，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸及其他非常見氨基酸也可以作為本發(fā)明多肽的合適組分。非常見氨基酸的實例包括4-羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、ε "N, N, N-三甲基賴氨酸、ε -N-乙酰賴氨酸、0_磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、 N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥賴氨酸、α -N-甲基精氨酸及其他類似的氨基酸和亞氨基酸(例如4-羥脯氨酸)。依據(jù)標(biāo)準用法和慣例，在本文所用的多肽符號中，左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端方向。根據(jù)共同的側(cè)鏈性質(zhì)，可將天然殘基分類如下1)疏水性殘基正亮氨酸(Nor)，Met, Ala, Val, Leu, lie, Phe, Trp, Tyr, Pro ；2)極性親水性殘基:Arg, Asn，Asp, Gin, Glu，His, Lys, Ser，Thr ；3)脂族殘基:Ala, Gly, lie, Leu, Val, Pro ；4)脂族疏水性殘基Ala，lie, Leu, Val, Pro ；5)中性親水性殘基:Cys, Ser，Thr, Asn，Gln ；6)酸性殘基Asp，Glu ；7)堿性殘基:His, Lys，Arg ；8)影響鏈的方向的殘基Gly，Pro ；9)芳族殘基:His, Trp, Tyr, Phe ；10)芳族疏水性殘基Phe，Trp，Tyr0保守氨基酸置換可能涉及這些類別中的某一類別的成員與同一類別的另一成員互換。保守氨基酸置換可包括非天然氨基酸殘基，其通常通過化學(xué)肽合成而不是在生物體系中合成而摻入。這些包括肽模擬物和氨基酸部分的其它顛倒或反向形式。非保守置換可包括這些類別中的某一類別的成員與另一類別的成員互換。這種置換殘基可被引入到人抗體中與非人抗體同源的區(qū)域，或者被引入到分子中的非同源區(qū)域。根據(jù)某些實施方案，在造成這種變化時，可考慮氨基酸的親水性指數(shù)。根據(jù)每種氨基酸的疏水性和電荷特征，給予其親水性指數(shù)。它們?yōu)楫惲涟彼?+4.5)；繳氨酸(+4.2)； 亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸 (+1. 8)；甘氨酸(-0. 4)；蘇氨酸(-0. 7)；絲氨酸(-0. 8)；色氨酸(-0. 9)；酪氨酸(-1. 3)；脯氨酸("1. 6)；組氨酸(-3. 2)；谷氨酸(-3. 5)；谷氨酰胺(-3. 5)；天冬氨酸(-3. 5)；天冬酰胺("3. 5)；賴氨酸(-3. 9)；及精氨酸(-4. 5)。親水性氨基酸指數(shù)在賦予蛋白質(zhì)活性生物功能方面的重要性為本領(lǐng)域所認識 (參見例如Kyte等，1982，J. Mol. Biol. 157 :105-131)。已知可用某些氨基酸置換具有類似親水性指數(shù)或分數(shù)的其他氨基酸，且仍保持類似的生物活性。在根據(jù)親水性指數(shù)造成這種變化時，在某些實施方案中，包括其親水性指數(shù)在士2之內(nèi)的氨基酸置換。在某些實施方案中，包括其親水性指數(shù)在士 1之內(nèi)的氨基酸置換，還在某些實施方案中，包括其親水性指數(shù)在士0.5之內(nèi)的氨基酸置換。本領(lǐng)域還認識到，如本文所公開的，可根據(jù)親水性有效地造成相似氨基酸的置換， 特別是在所創(chuàng)建的生物功能性蛋白質(zhì)或肽意在用于免疫學(xué)實施方案中的情況下。在某些實施方案中，由其鄰近氨基酸的親水性所決定的蛋白質(zhì)最大局部平均親水性與其免疫原性和抗原性相關(guān)，即與該蛋白質(zhì)的生物性質(zhì)相關(guān)。已給這些氨基酸殘基分配以下親水性值精氨酸(+3. 0)；賴氨酸(+3. 0)；天冬氨酸(+3.0士1)；谷氨酸(+3.0士1)；絲氨酸(+0. 3)；天冬酰胺(+0. 2)；谷氨酰胺(+0.2)； 甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(_0.5士1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸 (-2. 3)；苯丙氨酸(-2. 5)和色氨酸(-3. 4)。在根據(jù)類似的親水性值造成變化時，在某些實施方案中，包括其親水性指數(shù)在士 2之內(nèi)的氨基酸置換，在某些實施方案中，包括其親水性指數(shù)在士 1之內(nèi)的氨基酸置換，還在某些實施方案中，包括其親水性指數(shù)在士 0. 5之內(nèi)的氨基酸置換。還可根據(jù)親水性從一級氨基酸序列鑒別表位。這些區(qū)域也稱為“表位核心區(qū)”。示例性的氨基酸置換在表1中顯示。表 1氨基酸置換
權(quán)利要求
1.一種特異性結(jié)合NGF的分離人抗體，其中所述抗體包含具有重鏈可變區(qū)的重鏈和輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含與SEQ IDNO 10表示的氨基酸序列有至少80%序列一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中所述輕鏈可變區(qū)包含與SEQID NO :12表示的氨基酸序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
3.權(quán)利要求1的抗體，其中所述輕鏈包含人輕鏈⑶Rl，所述⑶Rl具有與SEQID NO 24 表示的氨基酸序列有至少85%—致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
4.權(quán)利要求1的抗體，其中所述輕鏈包含人輕鏈⑶R3，所述⑶R3具有與SEQID NO 16 表示的氨基酸序列有至少85%—致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
5.權(quán)利要求1的抗體，其中所述重鏈包含的重鏈可變區(qū)包含與SEQID NO 10表示的氨基酸序列有至少90%—致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
6.權(quán)利要求1的抗體，其中所述重鏈包含人重鏈⑶R2，所述⑶R2具有與SEQID NO 18 表示的氨基酸序列有至少80%—致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
7.權(quán)利要求1的抗體，所述抗體包含(a)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQID NO: 10表示的氨基酸序列， 或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :12表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；(b)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQID NO: 14表示的氨基酸序列， 或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :16表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；(c)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQID NO: 18表示的氨基酸序列， 或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :16表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；或者(d)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQID NO :22表示的氨基酸序列， 或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :16表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
8.權(quán)利要求1的抗體，其中所述重鏈包含的重鏈可變區(qū)具有SEQIDN0:10表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，所述輕鏈包含的輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO :12表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
9.權(quán)利要求1的抗體，其中所述重鏈包含可變區(qū)和恒定區(qū)，其中所述可變區(qū)包含SEQ ID NO :10表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合或免疫原性片段。
10.權(quán)利要求9的抗體，其中所述重鏈包含任何SEQID NO 14,SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 22表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合或免疫原性片段。
11.權(quán)利要求1的抗體，其中所述輕鏈包含可變區(qū)和恒定區(qū)，其中所述可變區(qū)包含SEQ ID NO :12表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合或免疫原性片段。
12.權(quán)利要求11的抗體，其中所述重鏈包含SEQID NO :16表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合或免疫原性片段。
13.權(quán)利要求1的抗體，所述抗體包含a.人重鏈框架區(qū)、人重鏈⑶Rl區(qū)、人重鏈⑶R2區(qū)和人重鏈⑶R3區(qū)，其中所述人重鏈 ⑶R3區(qū)是SEQ ID NO 14所示的重鏈⑶R3區(qū)；b.人輕鏈框架區(qū)、人輕鏈CDRl區(qū)、人輕鏈CDR2區(qū)和人輕鏈CDR3區(qū)，其中所述人輕鏈 CDR3區(qū)是SEQ ID NO 16所示的輕鏈CDR3區(qū)。
14.權(quán)利要求13的分離人抗體，其中所述人重鏈⑶R2區(qū)是SEQIDNO 18所示的重鏈 ⑶R2區(qū)，所述人輕鏈⑶R2區(qū)是SEQ ID NO 20所示的輕鏈⑶R2區(qū)。
15.權(quán)利要求13的分離人抗體，其中所述人重鏈⑶Rl區(qū)是SEQIDNO 22所示的重鏈 ⑶Rl區(qū)，所述人輕鏈⑶Rl區(qū)是SEQ ID NO 24所示的輕鏈⑶Rl區(qū)。
16.權(quán)利要求13的抗體，其中所述抗體以約IxlO-9或更低的Kd與人NGF多肽解離，在標(biāo)準的體外試驗中以約1x10_8M或更低的IC5tl中和人NGF生物活性。
17.權(quán)利要求16的抗體，其中所述抗體以約IxlO-"1或更低的Kd與人NGF多肽解離，在標(biāo)準的體外試驗中以約1x10_9M或更低的IC5tl中和人NGF生物活性。
18.權(quán)利要求17的抗體，其中所述抗體以約lxlO—11或更低的Kd與人NGF多肽解離，在標(biāo)準的體外試驗中以約0. 2x10-9M或更低的IC5tl中和人NGF生物活性。
19.權(quán)利要求1的抗體，其中所述重鏈和輕鏈通過柔性連接基團連接，形成單鏈抗體。
20.權(quán)利要求19的抗體，所述抗體是單鏈Fv抗體。
21.權(quán)利要求1的抗體，所述抗體是Fab抗體。
22.權(quán)利要求1的抗體，所述抗體是Fab'抗體。
23.權(quán)利要求1的抗體，所述抗體是(Fab')2抗體。
24.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是完全人抗體。
25.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體抑制NGF信號傳導(dǎo)。
26.一種治療患者中疾病的方法，所述疾病由NGF的表達增加或?qū)GF的敏感性提高導(dǎo)致，所述方法包括給予患者藥物有效量的權(quán)利要求25的抗體。
27.權(quán)利要求沈的方法，其中所述疾病是急性痛、牙痛、外傷導(dǎo)致的疼痛、外科手術(shù)疼痛、截肢或膿腫導(dǎo)致的疼痛、灼痛、脫髓鞘病、三叉神經(jīng)痛、癌癥、慢性酒精中毒、中風(fēng)、丘腦痛綜合征、糖尿病、獲得性免疫缺陷綜合征(“AIDS”)、毒素、化療、一般性頭痛、偏頭痛、叢集性頭痛、混合型血管或非血管綜合征、緊張性頭痛、一般炎癥、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病、狼瘡、骨關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛、炎性腸病、過敏性腸綜合征、炎性眼病、炎性或不穩(wěn)定性膀胱功能障礙、牛皮癬、炎性組分造成的皮膚不適、曬傷、心炎、皮炎、肌炎、神經(jīng)炎、膠原血管病、慢性炎性疾病、炎性疼痛及相關(guān)痛覺過敏和異常性疼痛、神經(jīng)性疼痛及相關(guān)痛覺過敏和異常性疼痛、糖尿病性神經(jīng)性疼痛、灼痛、交感神經(jīng)維持的疼痛、傳入神經(jīng)阻滯綜合征、哮喘、上皮組織損傷或功能紊亂、單純皰疹、在呼吸、泌尿生殖、胃腸或者血管區(qū)域的內(nèi)臟活動障礙、創(chuàng)傷、燒傷、過敏性皮膚反應(yīng)、瘙癢、白癜風(fēng)、一般性胃腸機能紊亂、結(jié)腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管舒縮性或過敏性鼻炎或者支氣管病、痛經(jīng)、消化不良、胃食管反流、胰腺炎或內(nèi)臟痛。
28.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含藥物可接受的載體和治療有效量的權(quán)利要求25的抗體。
29.一種治療患者中疾病的方法，所述疾病由NGF的表達增加或?qū)GF的敏感性提高導(dǎo)致，所述方法包括給予患者權(quán)利要求觀的藥物組合物。
30.一種檢測生物樣品中的NGF的方法，所述方法包括a.在能讓抗體結(jié)合NGF的條件下使樣品與權(quán)利要求1的抗體接觸；b.測量樣品中結(jié)合抗體的水平。
31.一種特異性結(jié)合神經(jīng)生長因子的分離人抗體，所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述重鏈包含的重鏈可變區(qū)包含 SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 79、SEQ ID NO :81、SEQ ID NO :83、 SEQ ID N0:85或SEQ ID NO :87表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
32.權(quán)利要求31的抗體，其中所述重鏈包含的重鏈可變區(qū)包含與任何SEQID NO :81、 SEQ ID NO :83、SEQ ID NO :85、SEQ ID NO 87 或 SEQ ID NO 79 表示的氨基酸序列有至少 90%—致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
33.一種特異性結(jié)合NGF的分離人抗體，所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述輕鏈包含的輕鏈可變區(qū)包含 SEQ ID NO 12, SEQ IDNO 80、SEQ ID NO :82、SEQ ID NO :84、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO :88、SEQ ID NO :89、SEQ ID NO :90、SEQ ID NO :91 或 SEQ ID NO :131 表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
34.權(quán)利要求33的分離人抗體，其中所述輕鏈包含的輕鏈可變區(qū)包含與任何SEQID NO 12,SEQ ID NO 80、SEQ ID NO 88、SEQ IDNO 89、SEQ ID NO 90、SEQ ID NO :91、SEQ ID NO :82、SEQ ID NO :84、SEQ ID NO 86 或 SEQ ID NO :131 表示的氨基酸序列有至少 85% — 致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
35.權(quán)利要求33的抗體，其中所述輕鏈包含的輕鏈可變區(qū)包含如下氨基酸序列a.與SEQID NO :80表示的氨基酸序列有至少89%或94%的一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；b.與SEQID NO :88表示的氨基酸序列有至少91%或94%的一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；c.與SEQID NO :89表示的氨基酸序列有至少86%或87%的一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；d.與SEQID NO :90表示的氨基酸序列有至少87^^91%或94%的一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；e.與SEQID NO :91表示的氨基酸序列有至少86%、94%、96%或99%的一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；f.與SEQID NO :82表示的氨基酸序列有至少91^^95%或96%的一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；g.與SEQID NO :84表示的氨基酸序列有至少86%、94%、95%、98%或99%的一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；h.與SEQID NO :86表示的氨基酸序列有至少86%、94%、95%、98%或99%的一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；或者i.與SEQID NO :131表示的氨基酸序列有至少86%、89%、91%或96%的一致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
36.一種特異性結(jié)合NGF的分離人抗體，所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述重鏈包含任何 SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :18、SEQ IDNO :22、SEQ ID NO :92、SEQ ID NO :93、SEQ ID NO 94, SEQ IDNO 98, SEQ ID NO 99, SEQ ID NO 100, SEQ ID NO 104, SEQ IDNO 105, SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQID NO :112、SEQ ID NO :116、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO :118表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
37.權(quán)利要求36的分離人抗體，其中所述重鏈包含人重鏈CDR2，其中所述重鏈CDR2是與 SEQ ID NO 99, SEQ ID NO 106, SEQ IDNO 117, SEQ ID NO :111 表示的氨基酸序列有至少80%—致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
38.一種特異性結(jié)合NGF的分離人抗體，所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述輕鏈包含任何 SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :20、SEQID NO :24、SEQ ID NO :95、SEQ ID NO :96、SEQ ID NO 97,SEQ IDNO =IOUSEQ ID NO :102、SEQ ID NO 103、SEQ ID NO 107、SEQID NO :108、SEQ ID NO :109,SEQ ID NO 113,SEQ ID NO 114,SEQID NO :115 或者任何 SEQ ID NO :119-134 表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
39.權(quán)利要求38的分離人抗體，所述抗體包含人輕鏈⑶Rl，其中所述⑶Rl是與SEQID NO =IOUSEQ ID NO 95,SEQ ID N0:119、SEQ ID NO :122、SEQ ID NO :125,SEQ ID NO :107, SEQ ID NO :113表示的氨基酸序列有至少85% —致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
40.權(quán)利要求38的分離人抗體，所述抗體包含人輕鏈⑶R3，其中所述⑶R3是與SEQID NO :103,SEQ ID NO 97、SEQ ID NO :121、SEQ ID NO 127,SEQ ID NO 130,SEQ ID NO :109、 SEQ ID NO :115,SEQ ID NO :134表示的氨基酸序列有至少85%—致性的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
41.一種特異性結(jié)合NGF的分離人抗體，所述抗體包含的重鏈或重鏈片段包含CDR3，所述 CDR3 包含選自 SEQ ID NO 14,SEQ IDNO 16、SEQ ID NO 94、SEQ ID NO 97、SEQ ID N0: 100、SEQ ID NO :103、SEQ ID NO :106、SEQ ID NO :109、SEQ ID NO :112、SEQ ID NO :115、 SEQ ID NO :118,SEQ ID NO :121、SEQ ID NO 124,SEQ ID NO 127、SEQ ID NO 130,SEQ ID NO 134和其變體的氨基酸序列，其中所述變體包含不超過一個氨基酸置換、插入或缺失。
42.一種特異性結(jié)合NGF的分離人抗體，所述抗體包含與選自SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 12,SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 18,SEQ ID N0:20 禾口 SEQ ID N0:22 和其變體的序列有至少90%—致性的氨基酸序列，其中所述變體包含不超過一個氨基酸置換、 插入或缺失。
43.權(quán)利要求31、33、36、38、41或42的抗體，其中所述重鏈和輕鏈通過柔性連接基團連接，形成單鏈抗體。
44.權(quán)利要求43的抗體，所述抗體是單鏈Fv抗體。
45.權(quán)利要求31、33、36、38、41或42的抗體，所述抗體是Fab抗體。
46.權(quán)利要求31、33、36、38、41或42的抗體，所述抗體是Fab'抗體。
47.權(quán)利要求31、33、36、38、41或42的抗體，所述抗體是(Fab')2抗體。
48.權(quán)利要求31、33、36、38、41或42的抗體，其中所述抗體是完全人抗體。
49.權(quán)利要求31、33、36、38、41或42的抗體，其中所述抗體抑制NGF的信號傳導(dǎo)。
50.一種治療患者中疾病的方法，所述疾病由NGF的表達增加或?qū)GF的敏感性提高導(dǎo)致，所述方法包括給予患者藥物有效量的權(quán)利要求49的抗體。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述疾病是是急性痛、牙痛、外傷導(dǎo)致的疼痛、外科手術(shù)疼痛、截肢或膿腫導(dǎo)致的疼痛、灼痛、脫髓鞘病、三叉神經(jīng)痛、癌癥、慢性酒精中毒、中風(fēng)、丘腦痛綜合征、糖尿病、獲得性免疫缺陷綜合征(“AIDS”)、毒素、化療、一般性頭痛、偏頭痛、叢集性頭痛、混合型血管或非血管綜合征、緊張性頭痛、一般炎癥、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病、狼瘡、骨關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛、炎性腸病、過敏性腸綜合征、炎性眼病、炎性或不穩(wěn)定性膀胱功能障礙、牛皮癬、炎性組分造成的皮膚不適、曬傷、心炎、皮炎、肌炎、神經(jīng)炎、膠原血管病、慢性炎性疾病、炎性疼痛及相關(guān)痛覺過敏和異常性疼痛、神經(jīng)性疼痛及相關(guān)痛覺過敏和異常性疼痛、糖尿病性神經(jīng)性疼痛、灼痛、交感神經(jīng)維持的疼痛、傳入神經(jīng)阻滯綜合征、哮喘、上皮組織損傷或功能紊亂、單純皰疹、在呼吸、泌尿生殖、胃腸或者血管區(qū)域的內(nèi)臟活動障礙、創(chuàng)傷、燒傷、 過敏性皮膚反應(yīng)、瘙癢、白癜風(fēng)、一般性胃腸機能紊亂、結(jié)腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管舒縮性或過敏性鼻炎或者支氣管病、痛經(jīng)、消化不良、胃食管反流、胰腺炎或內(nèi)臟痛。
52.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含藥物可接受的載體和治療有效量的權(quán)利要求49的抗體。
53.一種治療患者中疾病的方法，所述疾病由NGF的表達增加或?qū)GF的敏感性提高導(dǎo)致，所述方法包括給予患者權(quán)利要求52的藥物組合物。
54.一種檢測生物樣品中的NGF的方法，所述方法包括a.在能讓抗體結(jié)合NGF的條件下使樣品與權(quán)利要求31、33、36、38、41或42的抗體接觸；b.測量樣品中結(jié)合抗體的水平。
55.一種核酸分子，所述核酸分子編碼權(quán)利要求31、33、36、38、41或42的抗體。
56.一種宿主細胞，所述宿主細胞包含權(quán)利要求55的核酸。
57.一種分離的細胞系，所述分離細胞系產(chǎn)生權(quán)利要求31、33、36、38、41或42任一項的抗體。
58.一種NGF特異性結(jié)合物，所述結(jié)合物包含至少一種選自SEQID NO 10, SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ IDNO : 18、SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :22，以及任何 SEQ ID NO :79-130的氨基酸序列，且其中所述抗體能結(jié)合NGF。
59.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含藥物可接受的載體和治療有效量的權(quán)利要求58的結(jié)合物。
60.一種治療患者中疾病的方法，所述疾病由NGF的表達增加或?qū)GF的敏感性提高導(dǎo)致，所述方法包括給予患者權(quán)利要求58的藥物組合物。
61.權(quán)利要求58的結(jié)合物，所述結(jié)合物是蛋白質(zhì)。
62.一種核酸分子，所述核酸分子編碼權(quán)利要求61的結(jié)合物。
63.一種宿主細胞，所述宿主細胞包含權(quán)利要求62的核酸。
64.一種分離的細胞系，所述分離細胞系產(chǎn)生權(quán)利要求63的結(jié)合物。
65.一種治療患者中疾病的方法，所述疾病由NGF的表達增加或?qū)GF的敏感性提高導(dǎo)致，所述方法包括給予患者藥物有效量的權(quán)利要求58的結(jié)合物。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述疾病是是急性痛、牙痛、外傷導(dǎo)致的疼痛、外科手術(shù)疼痛、截肢或膿腫導(dǎo)致的疼痛、灼痛、脫髓鞘病、三叉神經(jīng)痛、癌癥、慢性酒精中毒、中風(fēng)、丘腦痛綜合征、糖尿病、獲得性免疫缺陷綜合征(“AIDS”)、毒素、化療、一般性頭痛、偏頭痛、叢集性頭痛、混合型血管或非血管綜合征、緊張性頭痛、一般炎癥、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病、狼瘡、骨關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛、炎性腸病、過敏性腸綜合征、炎性眼病、炎性或不穩(wěn)定性膀胱功能障礙、牛皮癬、炎性組分造成的皮膚不適、曬傷、心炎、皮炎、肌炎、神經(jīng)炎、膠原血管病、慢性炎性疾病、炎性疼痛及相關(guān)痛覺過敏和異常性疼痛、神經(jīng)性疼痛及相關(guān)痛覺過敏和異常性疼痛、糖尿病性神經(jīng)性疼痛、灼痛、交感神經(jīng)維持的疼痛、傳入神經(jīng)阻滯綜合征、哮喘、上皮組織損傷或功能紊亂、單純皰疹、在呼吸、泌尿生殖、胃腸或者血管區(qū)域的內(nèi)臟活動障礙、創(chuàng)傷、燒傷、 過敏性皮膚反應(yīng)、瘙癢、白癜風(fēng)、一般性胃腸機能紊亂、結(jié)腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管舒縮性或過敏性鼻炎或者支氣管病、痛經(jīng)、消化不良、胃食管反流、胰腺炎或內(nèi)臟痛。
67.一種檢測生物樣品中的NGF的方法，所述方法包括a.在能讓結(jié)合物結(jié)合NGF的條件下使樣品與權(quán)利要求58的結(jié)合物接觸；b.測量樣品中結(jié)合抗體的水平。
68.一種分離核酸分子，所述分離核酸分子包含編碼任何SEQ IDNO 10, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO :14,SEQ ID NO 16,SEQ ID NO 18,SEQ ID NO 20,SEQ ID NO22,SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO 40, SEQ ID N0:41、SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, SEQ ID NO 44 或者任何 SEQ ID NO :79-134表示的氨基酸的核苷酸序列。
69.一種特異性結(jié)合NGF的分離人抗體或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，其中所述抗體或片段包含的重鏈可變區(qū)包含a)包含下式氨基酸序列的CDRl區(qū).1 2 3 4 5 3. 3. 3. 3. 3.其中a1是極性親水性氨基酸殘基； a2是芳族氨基酸殘基； a3是脂族、極性疏水性、芳族氨基酸殘基； a4是中性疏水性或脂族氨基酸殘基； a5是脂族或極性親水性氨基酸殘基；b)包含下式氨基酸序列的CDR2區(qū) bbbbbbbbbb b b b b b b b 其中b1是脂族、極性疏水性或芳族氨基酸殘基； b2是脂族疏水性氨基酸殘基； b3是極性親水性或芳族氨基酸殘基； b4是極性親水性、疏水性或芳族氨基酸殘基； b5-b9獨立是極性親水性或脂族氨基酸殘基；b10是極性親水性、芳族或脂族氨基酸殘基；b"是芳族或疏水性氨基酸殘基；b12是脂族疏水性或極性親水性氨基酸殘基；b13是脂族、疏水性或極性親水性氨基酸殘基；b14和b16獨立是極性親水性氨基酸殘基；b15是脂族或芳族疏水性氨基酸殘基；b17是脂族酸性氨基酸殘基；c)包含下式氨基酸序列的CDR3區(qū) 其中C1不存在或者是脂族氨基酸殘基；C2不存在或者是極性親水性或芳族疏水性氨基酸殘基；C3和C4獨立是不存在或者極性親水性、芳族疏水性或脂族氨基酸殘基；C5不存在或者是極性親水性、脂族或芳族氨基酸殘基；C6不存在或者是極性親水性或脂族氨基酸殘基；C7是極性親水性或脂族氨基酸殘基；C8是極性親水性、疏水性或芳族氨基酸殘基；C9是極性親水性、脂族或芳族疏水性氨基酸殘基；C10是極性親水性、芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸殘基；C11-C13獨立是極性親水性或芳族疏水性氨基酸殘基；C14是脂族或芳族疏水性氨基酸殘基；C15是極性親水性或中性疏水性氨基酸殘基；C16是不存在或者極性親水性氨基酸殘基；C17是芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸殘基，且其中所述抗體或片段以約1X10_9M或更低的Kd與人NGF多肽解離，在標(biāo)準的體外試驗中以約1x10_8M或更低的IC5tl中和人NGF生物活性。
70.權(quán)利要求69的抗體或片段，其中a1是極性親水性氨基酸殘基； a2是芳族疏水性氨基酸殘基； a3是脂族疏水性氨基酸殘基； a4是中性疏水性； a5是極性親水性氨基酸殘基； b1是脂族或芳族氨基酸殘基； b2 是 Ile ；b3是極性親水性氨基酸殘基；b4是極性親水性或芳族氨基酸殘基；b5_b9獨立是極性親水性或脂族氨基酸殘基；b10是脂族氨基酸殘基；b11 是 Tyr ；b12是脂族疏水性氨基酸殘基；b13是脂族或極性親水性氨基酸殘基；b14和b16獨立是極性親水性氨基酸殘基；b15是脂族疏水性氨基酸殘基；b17是脂族酸性氨基酸殘基；C1不存在或者是脂族氨基酸殘基；C2不存在或者是極性親水性或芳族疏水性氨基酸殘基；C3和C4獨立是不存在或者是極性親水性、芳族疏水性或脂族氨基酸殘基；C5不存在或者是極性親水性氨基酸殘基；C6不存在或者是極性親水性或脂族氨基酸殘基；C7是極性親水性或脂族氨基酸殘基；C8是極性親水性、疏水性或芳族氨基酸殘基；C9是極性親水性、脂族或芳族疏水性氨基酸殘基；C10是極性親水性、芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸殘基；C11-C13獨立是極性親水性或芳族疏水性氨基酸殘基；C14是脂族或芳族疏水性氨基酸殘基；C15是極性親水性或中性疏水性氨基酸殘基；C16不存在或者是極性親水性氨基酸殘基；C17是芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸殘基。
71.權(quán)利要求69的抗體或片段，其中a1 是 Ser、Asp 或 Thr ；a2 是 Tyr ；a3 是 Ala、Ser、Trp 或 Gly ；a4 是 Met 或 Ile ；a5 是 His、 Gly 或 Asn ；b1 是 Tyr、Gly, Ile 或 Asp ；b2 是 Ile ；b3 是 Ser、Thr、Tyr 或 Asn ；b4 是 Trp, Arg 或 Pro ；b5 是 Ser、Asn 或 Gly ；b6 是 Ser、Arg, Asp 或 Gly ；b7 是 Ser、His 或 Gly ；b8 是 Ser、 lie、Asp 或 Thr ；b9 是 Leu、Ile 或 Thr ；b1Q 是 Gly、Lys 或 Phe ；b11 是 Tyr ；b12 是 Ala 或 kr ； b13 是 Asp、Gly 或 Pro ；b14 是 Ser ；b15 是 Val 或 Phe ；b16 是 Lys 或 Gln ；b17 是 Gly ；C1 不存在或是脂族氨基酸殘基；C2不存在或是Tyr ；C3和C4獨立是不存在、Tyr, Asn, Val或Glu ；C5 是不存在、Ser、Gly 或 Trp ；C6 是不存在、Ser、Gly、Glu 或 Leu ；C7 是 Gly、Arg 或 Asp ；C8 是 Trp、Pro、Ser 或 Thr ;c9 是 His、Gly 或 Tyr ；c10 是 Val、Tyr 或 Arg ；C11-C13 獨立是 kr、Phe、 Tyr> Asp 或 Asn ；c14 是 Phe> Val 或 Gly ；c15 是 Met 或 Asp ；c16 是不存在、Asp 或 Asn ；c17 是 Tyr 或 Val。
72.權(quán)利要求69的抗體或片段，其中a1 是 Ser 或 Asp ；a2 是 Tyr ；a3 是 Ala 或 Ser ；a4 是 Met 或 Ile ；a5 是 His 或 Asn ；b1 是 Tyr 或 Gly ；b2 是 Ile ；b3 是 kr、Thr、Tyr 或 Asn ；b4 是 Trp、Arg 或 Pro ；b5 是 Ser 或 Asn ；b6 是 Ser 或 Arg ；b7 是 His 或 Gly ；b8 是 Ile 或 Thr ；b9 是 Leu、Ile 或 Thr ；b10 是 Gly 或 Phe ；b11 是 Tyr ；b12 是 Ala 或 kr ；b13 是 Asp 或 Gly ；b14 是 kr ；b15 是 Val 或 Phe ；b16 是 Lys 或 Gln ； b17是Gly ；C1不存在或是Gly ；C2不存在或是Tyr ；C3和C4獨立是不存在、Tyr、Gly或Val ；C5 不存在或是 Ser ；C6 是 Ser 或 Gly ；C7 是 Gly 或 Arg ；C8 是 Trp 或 Pro ；c9 是 His,Gly 或 Tyr ； C10 是 Val 或 Tyr ；C11-C13 獨立是 Ser、Tyr、Phe 或 Asp ；c14 是 Phe 或 Val ；c15 是 Met 或 Asp ； C16不存在或是Asp ；C17是Tyr或Val。
73.權(quán)利要求69的抗體，其中a)重鏈CDRl具有SEQID NO 22表示的氨基酸序列，重鏈CDR2具有SEQ ID N0:18表示的氨基酸序列，重鏈⑶R3具有SEQ ID NO 14表示的氨基酸序列；b)重鏈CDRl具有SEQID NO :92表示的氨基酸序列，重鏈CDR2具有SEQ ID NO :93表示的氨基酸序列，重鏈⑶R3具有SEQ ID NO 94表示的氨基酸序列；c)重鏈⑶Rl具有SEQID NO 98表示的氨基酸序列，重鏈⑶R2具有SEQ ID NO 99表示的氨基酸序列，重鏈⑶R3具有SEQ ID NO :100表示的氨基酸序列；d)重鏈CDRl具有SEQID NO :104表示的氨基酸序列，重鏈CDR2具有SEQ ID NO :105 表示的氨基酸序列，重鏈⑶R3具有SEQ ID NO :106表示的氨基酸序列；e)重鏈⑶Rl具有SEQID NO :110表示的氨基酸序列，重鏈⑶R2具有SEQ ID NO :111 表示的氨基酸序列，重鏈⑶R3具有SEQ ID NO :112表示的氨基酸序列；f)重鏈⑶Rl具有SEQID NO :116表示的氨基酸序列，重鏈⑶R2具有SEQ ID NO :117 表示的氨基酸序列，重鏈⑶R3具有SEQ ID NO :118表示的氨基酸序列。
74.一種特異性結(jié)合NGF的分離人抗體或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，其中所述抗體或片段包含的輕鏈可變區(qū)包含a)包含下式氨基酸序列的CDRl區(qū) 其中a1是極性親水性氨基酸殘基；a2、a11和a12獨立是脂族或疏水性氨基酸殘基；a3、a5、a7和a8獨立是脂族、極性親水性或疏水性氨基酸殘基；a4是極性親水性氨基酸殘基；a6是脂族或疏水性氨基酸殘基；a9不存在，或是脂族或極性親水性氨基酸殘基；a10是脂族、芳族或疏水性氨基酸殘基；b)包含下式氨基酸序列的CDR2區(qū) bWbWb7其中b1是脂族、極性疏水性或疏水性氨基酸殘基；b2是脂族或疏水性氨基酸殘基；b3和b4獨立是極性親水性、脂族或疏水性氨基酸殘基；b5是極性親水性或脂族疏水性氨基酸殘基；b6是極性親水性或脂族疏水性氨基酸殘基；b7是極性親水性氨基酸殘基；C)包含下式氨基酸序列的CDR3區(qū) 其中C1和C2獨立是極性親水性氨基酸殘基； C3是極性親水性、脂族或疏水性氨基酸殘基；c4、C5和C6獨立是脂族、極性親水性或疏水性氨基酸殘基； C7不存在或者是極性親水性或脂族疏水性氨基酸殘基； C8是極性親水性或疏水性氨基酸殘基； C9是極性親水性氨基酸殘基，且其中所述抗體或者片段以約lxl0_9或更低的Kd與人NGF多肽解離，在標(biāo)準的體外試驗中以約1x10_8M或更低的IC5tl中和人NGF生物活性。
75.權(quán)利要求74的抗體或片段，其中a1、a3、a4、a7和a8獨立是極性親水性氨基酸殘基；a2、a6、a11和a12獨立是脂族疏水性氨基酸殘基；a5是極性親水性或脂族氨基酸殘基；a9不存在，或是脂族或極性親水性氨基酸殘基；a10是脂族或芳族氨基酸殘基；b1是脂族、極性疏水性或疏水性氨基酸殘基；b2是脂族疏水性氨基酸殘基；b3、b4和b7獨立是極性親水性氨基酸殘基；b5和b6獨立是極性親水性或脂族疏水性氨基酸殘基；C1和C2獨立是極性親水性氨基酸殘基；C3是極性親水性、脂族或疏水性氨基酸殘基；c4、C5和C6獨立是脂族、極性親水性或疏水性氨基酸殘基；C7不存在或是脂族疏水性氨基酸殘基；C8是疏水性氨基酸殘基；C9是極性親水性氨基酸殘基。
76.權(quán)利要求75的抗體或片段，其中a1、a3、a4 禾口 a7 分另Ij是 Arg、Ser、Gln 禾口 Ser ；a2 是 Ala ；a5 是 Gly 或 Ser ；a8 是 Ser 或 Ile ；a9是不存在、Ser或Gly ；a10 是 Ala、TyrJrp 或 Phe ；b1 是 Asp、Gly、Ala 或 Val ；b2和b3分別是Ala和kr ；b4 是 Ser 或 Asn ；b5 是 Leu 或 Arg ；b6 是 Glu、Ala 或 Gln ；b7 是 kr 或 Ilir ；C1 和 C2 是 Gln ；C3 是 Phe> Tyr > Arg 或 Ala ；C4 是 AsruGly 或 Ser ；C5 是 Ser 或 Asn ；C6 是 Tyr λ Ser λ Trp 或 Phe ； C7是不存在、Pro或His ； C8 是 Leu λ Trp、Tyr 或 Arg ； C9 是 Thr0
77.權(quán)利要求75的抗體或片段，其中 a1、a2、a3、a4 和 a7 分別是 Arg、Ala、Ser、Gln 和 Ser ； a5 是 Gly 或 Ser ； a8 是 Ser 或 Ile ； a9是不存在、Ser或Gly ； a1Q 是 Ala 或 Tyr ； b1 是 Asp 或 Gly ； b2和b3分別是Ala和kr ； b4 是 Ser 或 Asn ； b5 是 Leu 或 Arg ； b6 是 Glu、Ala 或 Gln ； b7 是 kr 或 Ilir ； C1 和 C2 是 Gln ； C3 是 Phe> Tyr > Arg 或 Ala ； C4 是 AsruGly 或 Ser ； C5 是 Ser 或 Asn ； C6 是 Tyr、Ser、Trp 或 Phe ； C7是不存在、Pro或His ； C8 是 Leu、Trp、Tyr 或 Arg ； C9 是 Thr0
78.權(quán)利要求74的抗體，其中a)輕鏈⑶Rl具有SEQID NO 24表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R2具有SEQ 示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ ID NO 16表示的氨基酸序列；b)輕鏈⑶Rl具有SEQID NO 95表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R2具有SEQ 示的氨基酸序列，輕鏈CDR3具有SEQ ID NO 97表示的氨基酸序列；c)輕鏈CDRl具有SEQID NO :101表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO :102 表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R3具有SEQ ID NO :103表示的氨基酸序列；d)輕鏈CDRl具有SEQID NO :107表示的氨基酸序列，輕鏈CDR2具有SEQ ID NO :108 表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R3具有SEQ ID NO :109表示的氨基酸序列；e)輕鏈⑶Rl具有SEQID NO :113表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R2具有SEQ ID NO :114 表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R3具有SEQ ID NO :115表示的氨基酸序列；f)輕鏈⑶Rl具有SEQID NO :119表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R2具有SEQ ID NO :120 表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R3具有SEQ ID NO :121表示的氨基酸序列；g)輕鏈⑶Rl具有SEQID NO :122表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R2具有SEQ ID NO :123 表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R3具有SEQ ID NO 124表示的氨基酸序列；12ID NO :20 表 ID NO 96表h)輕鏈⑶Rl具有SEQID NO :125表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R2具有SEQ ID NO 126 表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R3具有SEQ ID NO :127表示的氨基酸序列；i)輕鏈⑶Rl具有SEQID NO 128表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R2具有SEQ ID NO 129 表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R3具有SEQ ID NO :130表示的氨基酸序列；j)輕鏈⑶Rl具有SEQ ID NO :132表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R2具有SEQ ID NO :133 表示的氨基酸序列，輕鏈⑶R3具有SEQ ID NO :134表示的氨基酸序列。
79.—種多核苷酸，所述多核苷酸編碼權(quán)利要求69-78任一項的抗體或片段。
80.一種表達載體，所述表達載體包含權(quán)利要求79的多核苷酸。
81.一種宿主細胞，所述宿主細胞包含權(quán)利要求80的表達載體。
82.權(quán)利要求81的宿主細胞，其中所述細胞是真核細胞。
83.權(quán)利要求82的宿主細胞，其中所述細胞是CHO細胞。
84.一種用以治療疼痛病癥或疾病的藥物，所述病癥或疾病與NGF的表達增加或?qū)GF 的敏感性提高有關(guān)，所述藥物包含藥物有效量的單克隆抗體或其免疫功能性免疫球蛋白片段，或者單克隆抗體或片段的藥物可接受鹽，及藥物可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，其中所述單克隆抗體是至少一種權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
85.權(quán)利要求84的藥物，其中所述單克隆抗體包含(a)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQID NO: 10表示的氨基酸序列， 或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :12表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；(b)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQID NO: 14表示的氨基酸序列， 或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQID NO 16表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；(c)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQID NO: 18表示的氨基酸序列， 或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :16表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；或者(d)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQID NO :20表示的氨基酸序列， 或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :16表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
86.一種用以治療疼痛病癥或疾病的藥物，所述病癥或疾病與NGF的表達增加或?qū)GF 的敏感性提高有關(guān)，所述藥物包含藥物有效量的單克隆抗體或其免疫功能性免疫球蛋白片段，及藥物可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，所述抗體或片段包含與SEQ ID N0:10表示的氨基酸序列有至少80%序列一致性的氨基酸序列，或者與SEQ IDNO :12表示的氨基酸序列有至少90%序列一致性的氨基酸序列。
87.權(quán)利要求86的藥物，其中所述單克隆抗體以約IxlO-9M或更低的Kd與人NGF多肽解離，在標(biāo)準的體外試驗中以約1x10_8M或更低的IC5tl中和人NGF生物活性。
88.權(quán)利要求86的藥物，其中所述抗體以約IxKTkiM或更低的Kd與人NGF多肽解離， 在標(biāo)準的體外試驗中以約1x10_9M或更低的IC5tl中和人NGF生物活性。
89.權(quán)利要求86的藥物，其中所述抗體以約1χ10_"Μ或更低的Kd與人NGF多肽解離， 在標(biāo)準的體外試驗中以約0. 2x10-9M或更低的IC5tl中和人NGF生物活性。
90.藥物有效量的權(quán)利要求1的抗體在制備藥物中的用途，所述藥物適合用于治療與 NGF的表達增加或?qū)GF的敏感性提高有關(guān)的疼痛病癥或疾病。
91.權(quán)利要求90的用途，其中所述單克隆抗體以約1x10_9M或更低的Kd與人NGF多肽解離，在標(biāo)準的體外試驗中以約1x10_8M或更低的IC5tl中和人NGF生物活性。
92.權(quán)利要求90的用途，其中所述抗體以約IxKTkiM或更低的Kd與人NGF多肽解離， 在標(biāo)準的體外試驗中以約1x10_9M或更低的IC5tl中和人NGF生物活性。
93.權(quán)利要求90的用途，其中所述抗體以約1χ10_"Μ或更低的Kd與人NGF多肽解離， 在標(biāo)準的體外試驗中以約0. 2x10-9M或更低的IC5tl中和人NGF生物活性。
94.權(quán)利要求93的用途，其中所述疼痛病癥或疾病選自急性痛、牙痛、外傷導(dǎo)致的疼痛、外科手術(shù)疼痛、截肢或膿腫導(dǎo)致的疼痛、灼痛、脫髓鞘病、三叉神經(jīng)痛、癌癥、慢性酒精中毒、中風(fēng)、丘腦痛綜合征、糖尿病、獲得性免疫缺陷綜合征(“AIDS”)、毒素、化療、一般性頭痛、偏頭痛、叢集性頭痛、混合型血管或非血管綜合征、緊張性頭痛、一般炎癥、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病、狼瘡、骨關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛、炎性腸病、過敏性腸綜合征、炎性眼病、炎性或不穩(wěn)定性膀胱功能障礙、牛皮癬、炎性組分造成的皮膚不適、曬傷、心炎、皮炎、肌炎、神經(jīng)炎、膠原血管病、 慢性炎性疾病、炎性疼痛及相關(guān)痛覺過敏和異常性疼痛、神經(jīng)性疼痛及相關(guān)痛覺過敏和異常性疼痛、糖尿病性神經(jīng)性疼痛、灼痛、交感神經(jīng)維持的疼痛、傳入神經(jīng)阻滯綜合征、哮喘、 上皮組織損傷或功能紊亂、單純皰疹、在呼吸、泌尿生殖、胃腸或者血管區(qū)域的內(nèi)臟活動障礙、創(chuàng)傷、燒傷、過敏性皮膚反應(yīng)、瘙癢、白癜風(fēng)、一般性胃腸機能紊亂、結(jié)腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管舒縮性或過敏性鼻炎或者支氣管病、痛經(jīng)、消化不良、胃食管反流、胰腺炎或內(nèi)臟痛。
95.一種特異性結(jié)合NGF的分離人抗體，其中所述抗體包含(a)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQID NO :79表示的氨基酸序列， 或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :80表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；(b)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQID NO :81表示的氨基酸序列， 或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :82表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；(c)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQID NO :83表示的氨基酸序列， 或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :84表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；或者(d)具有重鏈可變區(qū)的重鏈，所述重鏈可變區(qū)包含SEQID NO :86表示的氨基酸序列， 或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :87表示的氨基酸序列，或其抗原結(jié)合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
全文摘要
本發(fā)明提供了與人神經(jīng)生長因子(NGF)相互作用或結(jié)合并因此中和NGF功能的抗體。本發(fā)明還提供了所述抗體的藥物組合物，及通過給予藥物有效量的抗NGF抗體來中和NGF的功能、特別是治療NGF相關(guān)病癥(例如慢性疼痛)的方法。本發(fā)明也提供了用抗NGF抗體檢測樣品中NGF的量的方法。
文檔編號C12N1/19GK102408483SQ201110291428
公開日2012年4月11日 申請日期2004年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月15日
發(fā)明者F·馬丁, H·伊諾埃, H·黃, J·J·S·特里諾爾, K·D·小維爾德, T·J·張 申請人:安姆根有限公司, 米德列斯公司