專利名稱：一種淋病奈瑟菌免疫阻遏突變基因Δrmp及突變方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學微生物學領(lǐng)域，具體涉及一種淋病奈瑟菌免疫阻遏基因突變方法。
背景技術(shù)：
淋病奈瑟菌(Afei^eria卯/^rrAoeae)的天然宿主是人類，感染后導(dǎo)致性傳播疾病淋病，可引起一系列病變，包括局部感染(如尿道炎、副睪炎、宮頸炎，輸卵管炎等)和全身播散性感染。輸卵管、盆腔等部位的病變可導(dǎo)致不孕癥或?qū)m外孕等嚴重后遺癥。淋病患者還大大增加了艾滋病的發(fā)病機會。淋病發(fā)病率高，全球每年新發(fā)病例約6200萬。越來越嚴重的淋病奈瑟菌耐藥性現(xiàn)象給淋病治療帶來了越來越大的困難。因此，研制有效的疫苗是淋病防制工作中的重點方向之一。淋病奈瑟菌疫苗研制歷經(jīng)艱難，二十世紀七十年代全細胞疫苗的人體試驗遭遇失敗，研究的重點開始轉(zhuǎn)向亞單位疫苗和基因疫苗等新型疫苗。菌毛是第一個被純化的淋病奈瑟菌亞單位成分，盡管純化后的菌毛能夠刺激機體產(chǎn)生較高滴度的抗體，但是由于菌毛表面一些表位變異程度高，這些抗體并不具有顯著的免疫保護作用。同樣由于高度變異的原因，另一類重要粘附因子Opa蛋白在淋病疫苗研制中也受到了限制。孔蛋白是持續(xù)表達在淋病奈瑟菌表面的I型外膜蛋白，具有免疫原性強、抗原相對保守等特點。90年代初期曾用覆蓋多數(shù)血清型的porin疫苗進行動物免疫實驗，效果并不十分理想。分析其原因，發(fā)現(xiàn)從淋病奈瑟菌細胞中提取的porin疫苗中污染了大量Rmp蛋白，后者是很好的免疫原，其免疫原性比porin高，能刺激機體產(chǎn)生補體結(jié)合抗體，但這些抗體不但沒有抗菌作用，相反能對porin抗體的抗菌活性產(chǎn)生拮抗作用，甚至能增強淋病奈瑟菌的感染性。隨著基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，用基因工程技術(shù)表達淋病奈瑟菌抗原成為研制淋病疫苗的重要方向。人們已經(jīng)成功表達了多種淋病奈瑟菌抗原，如Porin、NspA、TbpA、TbpB,LOS等，用蛋白質(zhì)相關(guān)技術(shù)進行純化和復(fù)性，配合一定佐劑免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)均可以誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性保護抗體。從目前的淋病奈瑟菌疫苗的研究現(xiàn)狀分析，用單一一種抗原的淋病奈瑟菌疫苗完全預(yù)防淋病奈瑟菌感染是非常困難的。盡管這種疫苗可以產(chǎn)生一定的保護力，但是，如果這種接種只是使淋病奈瑟菌感染轉(zhuǎn)為無癥狀型，感染者因而不就醫(yī)，那反而會增加淋病奈瑟菌的傳播。因此，含有更多甚至全部淋病奈瑟菌保護性抗原的疫苗是最理想的淋病疫苗候選。

發(fā)明內(nèi)容
野生型淋病奈瑟菌中含有免疫阻遏基因r /7，該基因的產(chǎn)物蛋白Rmp可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生對抗保護性抗體的有害抗體。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種突變r /7，以及一種淋病奈瑟菌免疫阻遏基因突變方法，從而避免有害抗體產(chǎn)生的有效方法，解決了研制淋病奈瑟菌全細胞疫苗的瓶頸問題。
本發(fā)明所述的突變免疫阻遏基因Lrmp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示。本發(fā)明所述的突變免疫阻遏基因Krmp通過以下方法獲得是以淋病奈瑟菌基因組DNA為模板，PCR擴增卿基因，并連接到T載體pMD19中，以連接產(chǎn)物pMD19_r /7為模板，擴增包含^剛基因下游側(cè)翼區(qū)、pMD19載體骨架和r剛基因上游側(cè)翼區(qū)的線性DNA片段，與相同酶切處理的卡那霉素抗性基因Kanr連接，得到的突變基因Krmp0本發(fā)明所述突變方法，包括步驟如下
(1>剛基因的克隆以淋病奈瑟菌基因組DNA為模板，以SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的序列為引物通過PCR擴增出序列如SEQ ID NO. 3所示的淋病奈瑟菌基因；
(2)r /7上下游兩側(cè)側(cè)翼區(qū)的擴增以上述(1)中擴增的基因與pMD19-T載體的連接產(chǎn)物pMD19_r /7為模板，擴增包含基因兩側(cè)側(cè)翼區(qū)的線性片段；擴增包含基因兩側(cè)側(cè)翼區(qū)線性片段的正反向引物序列分別如SEQ ID NO. 4和SEQ ID N0. 5所示，擴增得到序列如SEQ ID N0. 6所示的包含基因兩側(cè)側(cè)翼區(qū)的線性片段；
(3)以質(zhì)粒pET18a(+)為模板，擴增Kanr基因序列
其中引物序列為SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 8所示，經(jīng)PCR擴增得到的Kanr基因序列如 SEQ ID N0. 9 所示；
(4)r /7基因的插入突變
將步驟(2)得到的攜帶基因兩側(cè)側(cè)翼區(qū)線性片段用ΙΛ/Ι和損ο I雙酶切處理；步驟(3)得到的Kanr基因擴增產(chǎn)物用同樣的雙酶切消化；二者分別回收純化后用T4連接酶進行連接；連接產(chǎn)物pMD19Ar /7中載體骨架之外即為淋病奈瑟菌免疫阻遏突變基因Ar / ，其序列如SEQ ID NO. 10所示。將上述突變基因Lrmp克隆至自殺質(zhì)粒pGMB151，電轉(zhuǎn)化法將重組自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)入淋病奈瑟菌細胞。自殺質(zhì)粒帶有的基因可誘導(dǎo)細菌脫去質(zhì)粒并與野生型發(fā)生同源重組，從而得到突變株。目前淋病奈瑟菌疫苗研制中采用單一抗原或2種抗原組合作為疫苗，含有的抗原數(shù)量有限，而淋病奈瑟菌是一種含有數(shù)千種蛋白的細菌，有限數(shù)量抗原做成的疫苗很難刺激機體產(chǎn)生足夠的免疫保護。本發(fā)明提供的方法，因突變株不能表達淋病奈瑟菌免疫阻遏基因，解除了淋病奈瑟菌誘導(dǎo)機體產(chǎn)生有害抗體的可能性，因而可以制備只刺激機體產(chǎn)生有利抗體的全細胞疫苗，為淋病新型疫苗的研制帶來新的突破。


圖1是基因擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析。圖2是包含rmp基因下游側(cè)翼區(qū)、pMD19載體骨架和基因上游側(cè)翼區(qū)線性DNA片段瓊脂糖凝膠電泳分析。圖3是包含nnp基因下游側(cè)翼區(qū)、pMD19載體骨架和基因上游側(cè)翼區(qū)線性DNA片段的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4.是Kanr基因擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析。圖5是淋病奈瑟菌突變株的PCR篩選，其中1為陰性對照；2_3為kmp已經(jīng)進入細胞但尚未取代正常基因的菌株，可同時擴增出和基因；4為野生菌株，只能擴增出基因；5為突變菌株，只能擴增出kttip基因。
圖6是淋病奈瑟菌突變株的Western blotting鑒定，其中1為野生菌株，仍表達Rmp蛋白；2為突變菌株，不表達Rmp蛋白。
具體實施例方式用PCR將淋病奈瑟菌基因組中的擴增出來，將該基因的中間一段用來自pET28a的Kanr抗性基因替換，得到被插入失活的突變基因Δγ /7，后者連接到自殺載體中，攜帶的重組自殺載體放在大腸桿菌中，大腸桿菌與淋病奈瑟菌共孵育，使自殺載體轉(zhuǎn)化進野生型淋病奈瑟菌菌株中，然后篩選和鑒定同源重組后野生被Δγ /7替換的突變株。實施例一
i-)rmp基因的克隆及其兩側(cè)側(cè)翼區(qū)的擴增
l、r /7基因的克隆
以淋病奈瑟菌基因組DNA為模板，
以 F 5’CGGGATCCATGACCAAACAGCTGAAATTAAG 3，(.Bam H I) (SEQ ID NO. 1)禾口 R :5，CCCGGATCCTTAGTGTTGGTGATGATTGCGT 3，(.Bam H I) (SEQ ID NO. 2)的序列為引物通過 PCR擴增出淋病奈瑟菌基因組中的了剛基因(圖1)，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序，序列如SEQ ID N0.3所示SEQ ID NO. 3中，第沈7-466部分為將被Kanr抗性基因替換(而使插入失活)的部分，兩端劃線大寫字母部分為ife H I識別位點。2. 上下游兩側(cè)側(cè)翼區(qū)的擴增
將上述基因擴增產(chǎn)物與T載體pMD-19T連接，并以連接產(chǎn)物為模板擴增包含基因兩側(cè)側(cè)翼區(qū)的一個線性片段，該線性片段的瓊脂糖凝膠電泳分析圖2，該線性片段的的結(jié)構(gòu)示意圖如圖3。擴增包含基因兩側(cè)側(cè)翼區(qū)線性片段的正反向引物分別為
F 5' TGCCTCGAGTAGTGGCAAACAACCTGGTC 3，{Xho I) (SEQ ID NO. 4)R 5' GTCACGCGTTTATCTACTCA ACATATTGAGGAGCCTGC 3，(Mlu I) (SEQ ID NO. 5)，其中TTATCTACTCA為終止序列。擴增得到的包含pMD-19載體和基因兩側(cè)側(cè)翼區(qū)的線性片段的序列如SEQ IDN0. 6所示(前端為損ο I識別位點；第2584968bp部分為pMD_19骨架；末端為MJu I識別位點；其中7-257bp部分為基因下游側(cè)翼區(qū)，2969_32^bp部分為基因上游側(cè)翼區(qū))。(二)以質(zhì)粒pET_28a⑴為模板擴增Kanr基因序列引物序列為
F 5' TCGACGCGTGCTCAGTGGAACGAAAACTC ？, ‘ (. Mlu I) (SEQ ID N0. 7)R :5’ GCGCTCGAGCTTAGAAAAACTCATCGAGCAT 3，(Jho I) (SEQ ID N0. 8)經(jīng)PCR擴增得到的Kanr基因擴增產(chǎn)物(圖4)與pMD_19T連接后，使該載體獲得了卡那霉素抗性，表明擴增的DNA片段有活性；產(chǎn)物經(jīng)測序，序列如SEQ ID N0. 9所示(兩端分別為Mlu I和煬ο I識別位點)。(三)基因的插入突變
將SEQ ID NO. 6 基因下游側(cè)翼區(qū)、pMD19載體骨架和基因上游側(cè)翼區(qū)的線性DNA片段)和SEQ ID NO. 9 (Kanr基因)的DNA片段分別用ΙΛ/ I和損ο I雙酶切，并回收純化；二者用Τ4連接酶進行連接，獲得的環(huán)形DNA片段中即含有^剛基因中間部分被有活性的Kanr基因替換的突變基因Ar / 和ρΜΡ_19載體骨架，命名為pMD19 Ar / ，其中Krmp序列如SEQ ID NO. 10所示。
實施例二
將包含突變基因Lrmp的重組載體pMD19 Lrmp和自殺載體pGMB151 (Χ. X Huang,L. V. Phung, S. Dejsirilert, et al. , "Cloning and characterization of thegene encoding the z66 antigen of Salmonella enterica serovar Typhi,，，F(xiàn)EMSMicrobiology Letters, 2006, 234( 2) : 239 - 246)分別用漢警 H I 酶消化，回收純化后二者用T4連接酶連接，獲得的連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入宿主大腸桿菌SPTO72 λ pir,攜帶重組自殺載體的大腸桿菌與野生型淋病奈瑟菌共孵育。傳代過程中大腸桿菌死亡裂解，釋放的重組自殺載體進入淋病奈瑟菌，并與淋病奈瑟菌野生型發(fā)生同源重組，使野生rmp被突變的krmp取代，同時丟失自殺載體框架。表現(xiàn)為突變菌株具有kana抗性，但喪失了載體上的amp及sm抗性。提取傳代后分離的淋病奈瑟菌菌落，提取基因組DNA作模板，覓rmp引物進行PCR，篩選出只擴增出的菌株，即為突變株，(圖5)；用Westernblotting鑒定表明該突變株中Rmp蛋白表達缺失(圖6)。
權(quán)利要求
1.一種淋病奈瑟菌免疫阻遏突變基因Ar /7，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示。
2.一種淋病奈瑟菌免疫阻遏突變基因Δ^τ〃/7的突變方法，其特征在于，是以淋病奈瑟菌基因組DNA為模板，PCR擴增卿基因，并連接到T載體pMD19中，以連接產(chǎn)物pMD19r /7為模板，擴增包含r剛基因下游側(cè)翼區(qū)、pMD19載體骨架和r剛基因上游側(cè)翼區(qū)的線性DNA片段，與相同酶切處理的卡那霉素抗性基因Kanr連接，得到的突變基因Nrmp。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的突變方法，其特征在于，步驟如下(1>剛基因的克隆以淋病奈瑟菌基因組DNA為模板，以SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的序列為引物通過PCR擴增出序列如SEQ ID NO. 3所示的淋病奈瑟菌基因；(2)r /7上下游兩側(cè)側(cè)翼區(qū)的擴增以上述(1)中擴增的基因與pMD19-T載體的連接產(chǎn)物pMD19_r /7為模板，擴增包含基因兩側(cè)側(cè)翼區(qū)的線性片段；擴增包含基因兩側(cè)側(cè)翼區(qū)線性片段的正反向引物序列分別如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示，擴增得到序列如SEQ ID NO. 6所示的包含基因兩側(cè)側(cè)翼區(qū)的線性片段；(3)以質(zhì)粒pET18a(+)為模板，擴增Kanr基因序列其中引物序列為SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示，經(jīng)PCR擴增得到的Kanr基因序列如 SEQ ID NO. 9 所示；(4)r /7基因的插入突變將步驟(2)得到的攜帶基因兩側(cè)側(cè)翼區(qū)線性片段用i/Ζ I和損ο I雙酶切處理；步驟(3)得到的Kanr基因擴增產(chǎn)物用同樣的雙酶切消化；二者分別回收純化后用T4連接酶進行連接；連接產(chǎn)物pMD19Ar /7中載體骨架之外即為淋病奈瑟菌免疫阻遏突變基因Ar / ，其序列如SEQ ID NO. 10所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學微生物學領(lǐng)域，具體涉及一種淋病奈瑟菌免疫阻遏基因Δrmp及突變方法。所述淋病奈瑟菌免疫阻遏突變基因Δrmp，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。該突變基因通過下述方法和得是以淋病奈瑟菌基因組DNA為模板，PCR擴增rmp基因，并連接到T載體pMD19中，以連接產(chǎn)物pMD19rmp為模板，擴增包含rmp基因下游側(cè)翼區(qū)、pMD19載體骨架和rmp基因上游側(cè)翼區(qū)的線性DNA片段，與相同酶切處理的卡那霉素抗性基因Kanr連接，得到的突變基因Δrmp。
文檔編號C12N15/10GK102382844SQ201110293170
公開日2012年3月21日 申請日期2011年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月7日
發(fā)明者嚴華, 季明春, 李國才, 杜慶輝, 汪靜, 潘興元, 焦紅梅, 解如山, 錢莉, 陳紅菊, 龔衛(wèi)娟 申請人:揚州大學