專利名稱：：刪除轉(zhuǎn)基因植物中抗生素標(biāo)記基因的系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及刪除轉(zhuǎn)基因植物中抗生素標(biāo)記基因的系統(tǒng)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：自轉(zhuǎn)基因技術(shù)誕生以來，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中人們最擔(dān)心的是安全性問題，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中帶有的一些選擇標(biāo)記基因可能會對人類健康、自然界的物種和環(huán)境存在潛在的風(fēng)險。因此，轉(zhuǎn)基因植物的安全性問題日益受到重視，并已成為影響轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要瓶頸(參考文獻(xiàn):HarePD,ChuaNH.Excisionofselectablemarkergenesfromtransgenicplants.NatureBiotechnology,2002,20:575_580·)。胃胃中;g中素抗性基因問題。轉(zhuǎn)基因食品中的抗生素抗性基因可能會通過轉(zhuǎn)染腸道細(xì)菌，而使人類對這些抗生素產(chǎn)生抗性，也就是耐藥性。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織在2003年聯(lián)合頒布的轉(zhuǎn)基因植物食品風(fēng)險評估準(zhǔn)則明確指出“對在臨床上應(yīng)用的抗生素具有抗性的耐抗生素基因不應(yīng)在食品中出現(xiàn)”?？敲顾乜剐曰?qū)敲顾鼐哂锌剐?，被世界衛(wèi)生組織列為第二級別，為重要類抗生素，意味著該抗生素抗性基因不應(yīng)在食品中出現(xiàn)。因此抗生素抗性基因的刪除具有重要意義。Cre/loxP重組系統(tǒng)由于特異、高效、作用專一性強(qiáng)，因而不影響基因的正常表達(dá)與調(diào)控，在轉(zhuǎn)基因研究中得到了廣泛的應(yīng)用(參考文獻(xiàn)BallesterA，CerveraM，PenaL.Efficientproductionoftransgeniccitrusplantsusingisopentenyltransferasepositiveselectionandremovalofthemarkergenebysite-specificrecombination.PlantCellReports,2006,26:39-45.禾口CaoMX，HuangJQ,YaoQH,LiuSJ,WangCL,WeiZM.Site-specificDNAexcisionintransgenicricewithacell-permeableCrerecombinase.MolecularBiotechnology,2006,32:55-63.禾口ChakrabortiD,SarkarA,MondalHA,SchuermannD,HohnB,SarmahBK,DasS(2008)Cre/loxsystemtodevelopselectablemarkerfreetransgenictobaccoplantsconferringresistanceagainstsapsuckinghomopteraninsect.PlantCellRep27:1623-1633.禾口CuellarW,GaudinA,SolorzanoD,CasasA,NopoL,ChudalayandiP,MedranoG,KreuzeJ,GhislainM.Self-excisionoftheantibioticresistancegenenptllusingaheatinducibleCre-IoxPsystemfromtransgenicpotato.PlantMolecularBiology，2006，62:71-82.)。Cre(causesrecombination)重組酶是由來源于Pl噬菌體的ere基因所編碼的一類酶，屬于Int家族，識別特異靶位點(IoxP位點)并催化在該位點斷裂和重組(參考文獻(xiàn)Stembergn,SauerB,HoessR,etal.BacteriophagePIcregeneanditsregulatoryregionevidenceformultiplepromotersandforregulationbyDNAmethylation[J].JournalofMolecularBiology,1986,187197-121.)。IoxP位點是一段長度為34bp的DNA序列，是Cre重組酶的特異性識別位點，具有典型的回文結(jié)構(gòu)，由兩個13bp的反向重復(fù)序列和中間8bp的不對稱間隔區(qū)組成，8bp的間隔區(qū)負(fù)責(zé)位點的定向(參考文獻(xiàn)RonaldHH，MarciaΖ,NatS.Plsite2specificrecombinationnucleotidesequenceofrecombiningsites[J].ProcNatlAcadSci,USA,1982，79:3398-3402.)。當(dāng)同一條DNA分子上有2個同向的IoxP位點時，Cre重組酶催化兩個IoxP位點間基因的剔除，只留下1個IoxP位點，重組發(fā)生在8bp的分隔區(qū)內(nèi)(參考文獻(xiàn):HoessRH,AbremskiK.InteractionofthebacteriophagePlrecombinaseCrewiththerecombiningsiteIoxP.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1984,81:1(^6-1029.)。Cre重組酶介導(dǎo)的DNA重組不受切除片段長度和位置的限制，只要靶基因被2個識別位點標(biāo)記就可以準(zhǔn)確地進(jìn)行DNA重組。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供刪除轉(zhuǎn)基因植物中抗生素標(biāo)記基因的系統(tǒng)及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的刪除轉(zhuǎn)基因植物中抗生素標(biāo)記基因的系統(tǒng)，由用于插入外源目的DNA表達(dá)盒的含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體和用于刪除所述抗生素標(biāo)記基因的含Cre酶基因的植物表達(dá)載體組成。所述的含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體為環(huán)狀載體，含有兩個同向IoxP位點，抗生素標(biāo)記基因的表達(dá)盒，可視化標(biāo)記基因的表達(dá)盒，篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒，及插入外源目的DNA的多克隆位點；所述兩個同向的IoxP位點將所述含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體劃分為兩段，其中一段含有編碼所述抗生素標(biāo)記基因及所述可視化標(biāo)記基因的表達(dá)盒，另一段含有所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒，和所述插入外源目的DNA的多克隆位點。所述的含Cre酶基因的植物表達(dá)載體為環(huán)狀載體，該環(huán)狀載體含有兩個同向的IoxP位點，可控啟動子，被所述可控啟動子啟動的Cre酶基因，抗生素標(biāo)記基因的表達(dá)盒，可視化標(biāo)記基因的表達(dá)盒，和篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒；所述兩個同向的IoxP位點將所述含Cre酶基因的植物表達(dá)載體劃分為兩段，其中一段含有編碼所述抗生素的基因，可控啟動子及被所述可控啟動子啟動的Cre酶基因，另一段含有所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒，以及所述可視化標(biāo)記基因的表達(dá)盒。所述表達(dá)盒均指含有目的基因及表達(dá)該目的基因所需元件的DNA分子。所述抗生素標(biāo)記基因的表達(dá)盒是一個含有抗生素標(biāo)記基因及該抗生素標(biāo)記基因表達(dá)所需元件的DNA分子，從上游至下游依次含有如下片段啟動子、SD序列、由所述啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的所述抗生素標(biāo)記基因的編碼序列和終止子(轉(zhuǎn)錄終止序列)。在本發(fā)明的實施例中，所述抗生素基因表達(dá)盒具體為卡那霉素(Kan)基因表達(dá)盒；所述Kan基因表達(dá)盒是一個含有Kan基因及Kan基因表達(dá)所需元件的DNA分子，從上游至下游依次含有如下片段含有啟動Kan基因的原核啟動子(序列7的第沈30位到第M92位)、SD序列、被該啟動子啟動的Kan基因和終止子(轉(zhuǎn)錄終止序列)。所述可視化標(biāo)記基因的表達(dá)盒是一個含有可視化標(biāo)記基因及可視化標(biāo)記基因表達(dá)所需元件的DNA分子，從上游至下游依次含有如下片段啟動子、由所述啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的所述可視化標(biāo)記基因的編碼序列以及終止子(轉(zhuǎn)錄終止序列)。在本發(fā)明的實施例中，所述可視化標(biāo)記基因表達(dá)盒具體由花青素基因合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因表達(dá)盒和花青素基因合成途徑中cl基因表達(dá)盒組成。其中，bi基因的表達(dá)盒是一個含有bi基因及bi基因表達(dá)所需元件的DNA分子，從上游至下游依次含有如下片段啟動子、被該啟動子啟動的bi基因和nos終止子(轉(zhuǎn)錄終止序列)；cl基因的表達(dá)盒是一個含有cl基因及cl基因表達(dá)所需元件的DNA分子，從上游至下游依次含有如下片段啟動子、被該啟動子啟動的cl基因和nos終止子(轉(zhuǎn)錄終止序列)。其表達(dá)產(chǎn)物花青素可作為植物轉(zhuǎn)基因成功與否及鑒定轉(zhuǎn)基因植物是否成功刪除抗生素標(biāo)記基因的可視化標(biāo)記。cl基因的表達(dá)盒和bi基因表達(dá)盒的啟動子均可為任何可以啟動基因在植物中轉(zhuǎn)錄的啟動子，如常用的3啟動子。所述bi基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中序列1所示，所述Cl基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中序列2所示。所述bi基因的編碼序列如序列表中序列10的第3137位到第4796位所示；所述cl基因的編碼序列如序列表中序列10的第1013位到第1834位所示。所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒是一個含有篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因及其表達(dá)所需元件的DNA分子，從上游至下游依次含有如下片段啟動子、由所述啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需的標(biāo)記基因的編碼序列以及終止子(轉(zhuǎn)錄終止序列)。在本發(fā)明的實施例中，所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒具體為EPSP基因表達(dá)盒；所述EPSP基因表達(dá)盒是一個含有EPSP基因及EPSP基因表達(dá)所需元件的DNA分子，從上游至下游依次含有如下片段啟動子、由該啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的所述EPSP基因的編碼序列以及終止子(轉(zhuǎn)錄終止序列)；所述EPSP基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述EPSP基因的編碼序列如序列表中序列8的第10位到第2549位所示。所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒中的啟動子可為任何可以啟動基因在植物中轉(zhuǎn)錄的啟動子，如常用的3啟動子。在本發(fā)明的實施例中，所述插入外源目的DNA的多克隆位點從上游到下游具體依次為KpnI，HindIII，EcoRI，SmaI,XbaI,NotI。所述的可控啟動子具體為水稻熱激蛋白hsp70基因啟動子hsp70；所述的水稻熱激蛋白hsp70基因啟動子hsp70的核苷酸序列如序列表中序列9的第1位到第687位所示。所述的Cre酶基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中序列4所示；所述的Cre酶基因的編碼序列如序列表中序列9的第694位到第17位所示。所述的含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體和所述的含Cre酶基因的植物表達(dá)載體分別單獨(dú)包裝。所述的含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體為pBAC9008，pBAC9008按照如下方法構(gòu)建1)在PGreen載體的第1648位和第沈35位處分別插入如序列表中序列5所示的IoxP位點得到重組載體pBAC814，pBAC814中的兩個IoxP位點方向相同；2)在pBAC814的多克隆位點前的NdeI酶切位點處插入所述EPSP基因的表達(dá)盒得到重組載體PBAC823；3)將上述PBAC823載體的用DraIII酶切，加入Agel/PacIlinker，之后將所述花青素合成途徑中轉(zhuǎn)錄因子bi基因和轉(zhuǎn)錄因子cl基因的表達(dá)框插入AgeI和I^cI位點之間，得到的載體命名為pBAC9008。所述pGreen載體的序列如序列表中序列7所示；所述EPSP基因的表達(dá)盒的序列如序列表中序列8所示，其中第1位到第434位為所述35S啟動子的核苷酸序列，第461位到第994位為所述玉米Adhl基因的Intronl的核苷酸序列，第10位到第2549位為所述EPSP基因的編碼序列；所述Agel/PacIlinker的核苷酸序列如序列表中序列6所示。所述的含Cre酶基因的植物表達(dá)載體為pBAC9009，pBAC9009按照如下方法構(gòu)建a)構(gòu)建被所述熱激活蛋白基因啟動子啟動的所述Cre酶基因的表達(dá)盒，將該表達(dá)盒插入所述PBAC823載體的DraIII酶切位點處，得到重組載體pBAC830；b)將所述花青素基因合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因和轉(zhuǎn)錄因子cl基因的表達(dá)盒插入pBAC830載體的EcoRI酶切位點，得到PBAC9009載體。被所述熱激活蛋白基因啟動子啟動的所述Cre酶基因的表達(dá)盒的核苷酸序列如序列表中序列9所示，其中，第1位到第687位為所述hsp70啟動子的核苷酸序列，第694位到第1725位為所述Cre酶基因的編碼序列；所述花青素基因合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因的表達(dá)盒和所述花青素基因合成途徑中轉(zhuǎn)錄因子cl基因的表達(dá)盒的序列如序列表中序列10所示，其中，第1位到第2112位為所述cl表達(dá)框的基因序列，第2125位到第5074位為所述bi表達(dá)框的序列，第1013位到第1834位為cl基因的編碼序列，第3137位到第4796位為bi的編碼序列。所述刪除轉(zhuǎn)基因植物中抗生素標(biāo)記基因的系統(tǒng)在刪除轉(zhuǎn)基因植物抗生素基因中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供利用上述刪除轉(zhuǎn)基因植物中抗生素標(biāo)記基因的系統(tǒng)培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。該方法包括如下步驟a、將目的基因插入所述含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體中的所述多克隆位點，得到重組目的基因表達(dá)載體。b、用所述重組目的基因表達(dá)載體和含Cre酶基因的植物表達(dá)載體分別通過DNA直接轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，獲得所述重組目的基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株和所述含Cre酶基因的植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株。所述重組目的基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株中，所述目的基因、所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因和所述可視化標(biāo)記基因這三個基因均表達(dá)，將所述三個基因記作含有目的基因的三基因；所述含Cre酶基因的植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株中，所述Cre酶基因、所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因和所述可視化標(biāo)記基因這三個基因均表達(dá)，將所述三個基因記作含Cre酶基因的三基因。C、從所述重組目的基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株自交后代中選擇所述含有目的基因的三基因均穩(wěn)定表達(dá)和純合的植株作為父本，從所述含Cre酶基因的植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株自交后代中選擇所述含Cre酶基因的三基因均穩(wěn)定表達(dá)和純合的植株作為母本，將所述母本和所述父本進(jìn)行雜交，對得到的雜交種子進(jìn)行處理，使所述可控啟動子被激活，再將該種子進(jìn)行種植，得到的不含所述可視化標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的植株即為抗生素標(biāo)記基因被刪除的轉(zhuǎn)基因植株。所述DNA的直接轉(zhuǎn)移法包括電擊法(電穿孔法)、基因槍法(微彈轟擊法)、激光微束穿孔法、顯微注射法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、多聚物介導(dǎo)法，花粉管通導(dǎo)法等。在本發(fā)明的實施例中采用的具體方法為基因槍法。在本發(fā)明的實施例中，所述轉(zhuǎn)基因植物具體可為單子葉植物，如玉米；所述對得到的雜交種子進(jìn)行處理使所述可控啟動子被激活的方法具體為40°C熱誘導(dǎo)處理。本發(fā)明通過Cre-IoxP系統(tǒng)構(gòu)建了抗生素標(biāo)記基因的刪除系統(tǒng)。含有IoxP位點的表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植株通過與表達(dá)Cre酶基因的轉(zhuǎn)基因植株雜交，就可以從轉(zhuǎn)基因植株的后代中刪除抗生素標(biāo)記基因，為食品安全提供保證，在轉(zhuǎn)基因研究中具有重要的意義。另外，本發(fā)明的發(fā)明人在刪除系統(tǒng)中又同時引進(jìn)了可視化標(biāo)記基因花青素合成途徑的兩個7轉(zhuǎn)錄因子，使得本發(fā)明僅僅從玉米種皮的顏色上就可以判斷出轉(zhuǎn)基因的效果與刪除效果，因此該刪除體系在轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域是一個突破，大大節(jié)省了分子檢測的成本，對于后續(xù)的育種也有著重要的意義。圖1為pBAC823質(zhì)粒圖譜。圖2為pBAC9008質(zhì)粒圖譜。圖3為pBAC830質(zhì)粒圖譜。圖4為pBAC9009質(zhì)粒圖譜。圖5為轉(zhuǎn)基因玉米植株的分化及田間移栽。A誘導(dǎo)愈傷組織；B轉(zhuǎn)化再生植株；C田間移栽；D轉(zhuǎn)化植株結(jié)實種子。圖6為pBAC9008轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測。1:2Kplusmarker；2陰性對照(水)；3非轉(zhuǎn)基因植株；5質(zhì)粒pBAC9008；618轉(zhuǎn)化植株。圖7為pBAC9009轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測。1:2Kplusmarker；217轉(zhuǎn)化植株；18陰性對照(水)；19非轉(zhuǎn)基因植株；20質(zhì)粒pBAC9009。圖8為轉(zhuǎn)基因玉米中Kan基因刪除示意圖。其中，A代表轉(zhuǎn)目的基因玉米(父本)；B代表轉(zhuǎn)重組酶基因玉米(母本)；C代表轉(zhuǎn)目的基因玉米(刪除抗生素基因)；D代表轉(zhuǎn)重組酶基因玉米；E和F均代表轉(zhuǎn)目的基因玉米/轉(zhuǎn)重組酶基因玉米的雜合體。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。玉米優(yōu)良自交系501(楊東歌，楊鳳萍，陳緒清，張立全，張曉東.外源脫水應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子CBF4基因轉(zhuǎn)化玉米的獲得.作物學(xué)報，2009，35(10):1759-1763)T4DNA連接酶、Taq酶、卡納霉素、IPTG、X-gal等試劑均購自大連寶生物工程有限公司；DNA回收試劑盒購自天根生化科技公司；限制性內(nèi)切酶購自！Iomega、NewEnglandBiolabs；普通生化試劑購自Sigma公司、Promega公司或國產(chǎn)?；驑屝吞朠DS_1000/He(BioRad)?；A(chǔ)載體pGreen，購自英國JohnInnesCentre[聯(lián)系人MarkSmedley，JohnInnesCentre,NorwichResearchPark,Colney,Norwich,NR47UH,UK.e-mail:mark.smedleyibbsrc.ac.uk,Fax(+44)1603450045]。下面結(jié)合具體實施例，詳細(xì)闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1、含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建一、pGreen載體的改造根據(jù)pGreen中Kan基因的兩側(cè)序列分別合成擴(kuò)增IoxP位點的正向、反向共四條引物(見表1)，其中兩個正向引物PF1648(序列如序列表中序列11所示)和ΡΜ635(序列如序列表中序列12所示)的前4個核苷酸殘基均為IoxP序列的8bp間隔區(qū)的后4位，第5-17位核苷酸殘基均為IoxP序列的13bp的反向重復(fù)序列；兩個反向引物PR1648(序列如序列表中序列13所示)和(序列如序列表中序列14所示)的前4個核苷酸殘基均為IoxP序列的8bp間隔區(qū)的前4位，第5-17位核苷酸殘基均為IoxP序列的13bp的反向重復(fù)序列。利用兩次PCR的方法，將IoxP位點加入pGreen中Kan基因表達(dá)框的兩側(cè)。具體操作方法如下所述首先以pGreen基礎(chǔ)框架載體為模板，利用PF1648/冊1648引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物自連，轉(zhuǎn)化E.coliJM110。通過序列測定確定IoxP位點是否正確插入PGreen載體中。將鑒定正確的載體命名為pGreen-loxp(在pGreen的1648位點處插入如序列表中序列5所示的IoxP位點得到的重組載體)，以pGreen-loxp載體為模板，以PM635/PR2635引物對進(jìn)行第二次PCR，步驟同上。測序正確的載體命名為pBAC814(在pGreen-loxp中對應(yīng)pGreen的沈35位點處插入如序列表中序列5所示的IoxP位點得到的重組載體，PBAC814中的兩個IoxP位點方向相同)。在pBAC814多克隆位點前的NdeI酶切位點處插入CaMV35S啟動子和玉米Adhl基因的Intronl驅(qū)動的EPSP基因(EPSP基因表達(dá)盒)，所述EPSP基因作為篩選轉(zhuǎn)基因植物的選擇標(biāo)記基因。經(jīng)測序鑒定正確的載體命名為pBAC823(pBAC823的質(zhì)粒圖譜如圖1所示)。pBAC823中CaMV35S啟動子和玉米Adhl基因的htronl驅(qū)動的EPSP基因(EPSP基因表達(dá)盒)的序列如序列表中序列8所示，其中第1位到第434位為所述35S啟動子的核苷酸序列，第461位到第994位為所述玉米Adhl基因的htronl的核苷酸序列，第10位到第2549位為所述EPSP基因的編碼序列表1擴(kuò)增IoxP位點的四條引物序列權(quán)利要求1.刪除轉(zhuǎn)基因植物中抗生素標(biāo)記基因的系統(tǒng)，由用于插入外源目的DNA的含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體和用于刪除所述抗生素標(biāo)記基因的含Cre酶基因的植物表達(dá)載體組成；所述的含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體為環(huán)狀載體，含有兩個同向IoxP位點，抗生素標(biāo)記基因的表達(dá)盒，可視化標(biāo)記基因的表達(dá)盒，篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒，插入外源目的DNA的多克隆位點；所述兩個同向的IoxP位點將所述含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體劃分為兩段，其中一段含有編碼所述抗生素標(biāo)記基因及所述可視化標(biāo)記基因的表達(dá)盒，另一段含有所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒，和所述插入外源目的DNA的多克隆位點；所述的含Cre酶基因的植物表達(dá)載體為環(huán)狀載體，該環(huán)狀載體含有兩個同向的IoxP位點，可控啟動子，被所述可控啟動子啟動的Cre酶基因，抗生素標(biāo)記基因的表達(dá)盒，可視化標(biāo)記基因的表達(dá)盒，和篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒；所述兩個同向的IoxP位點將所述含Cre酶基因的植物表達(dá)載體劃分為兩段，其中一段含有編碼所述抗生素標(biāo)記基因，可控啟動子及被所述可控啟動子啟動的Cre酶基因，另一段含有所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒和所述可視化標(biāo)記基因的表達(dá)盒；所述表達(dá)盒均指含有目的基因及該目的基因表達(dá)所需元件的DNA分子。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于所述可視化標(biāo)記基因由花青素基因合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因和花青素基因合成途徑中轉(zhuǎn)錄因子cl基因組成；所述可視化標(biāo)記基因的表達(dá)盒為由所述轉(zhuǎn)錄因子bi基因的表達(dá)盒和所述轉(zhuǎn)錄因子cl基因的表達(dá)盒組成；所述bi基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中序列1所示，所述cl基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中序列2所示。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的系統(tǒng)，其特征在于所述bi基因的編碼序列如序列表中序列10的第3137位到第4796位所示；所述cl基因的編碼序列如序列表中序列10的第1013位到第1834位所示。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的系統(tǒng)，其特征在于所述的可控啟動子為熱激活蛋白基因啟動子；所述的Cre酶基因編碼的蛋白質(zhì)的序列如序列表中序列9所示。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的系統(tǒng)，其特征在于所述的熱激活蛋白基因啟動子的核苷酸序列如序列表中序列9的第1位到第687位所示；所述的Cre酶基因的編碼序列如序列表中序列9的第694位到第1725位所示。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的系統(tǒng)，其特征在于所述的含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體和所述的含Cre酶基因的植物表達(dá)載體分別單獨(dú)包裝。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的系統(tǒng)，其特征在于所述的含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體為pBAC9008，pBAC9008按照如下方法構(gòu)建1)在如序列表中序列7所示的PGreen載體的第1649位和第沈35位分別插入如序列表中序列5所示的IoxP位點得到重組載體pBAC814，pBAC814中的兩個IoxP位點方向相同；2)在pBAC814的NdeI酶切位點處插入如序列表中序列8所示的EPSP基因表達(dá)盒得到重組載體pBAC823；3)將上述pBAC823載體的用DraIII酶切，加入如序列表中序列6所示的Agel/PacIlinker，之后將如序列表中序列10所示的所述花青素合成途徑中轉(zhuǎn)錄因子cl基因和轉(zhuǎn)錄因子bi基因的表達(dá)盒插入AgeI和I^cI位點之間，得到的載體命名為PBAC9008；所述的含Cre酶基因的植物表達(dá)載體為pBAC9009，pBAC9009按照如下方法構(gòu)建a)構(gòu)建被所述熱激活蛋白基因啟動子啟動的如序列表中序列9所示的所述Cre酶基因的表達(dá)盒，將該表達(dá)盒插入所述PBAC823載體的DraIII酶切位點處，得到重組載體pBAC830；b)將如序列表中序列10所示的所述花青素基因合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因和轉(zhuǎn)錄因子cl基因的表達(dá)盒插入PBAC830載體的EcoRI酶切位點，得到pBAC9009載體。8.權(quán)利要求1-6中任一所述的刪除轉(zhuǎn)基因植物中抗生素標(biāo)記基因系統(tǒng)在刪除轉(zhuǎn)基因植物抗生素標(biāo)記基因中的應(yīng)用。9.利用權(quán)利要求1-6中任一所述系統(tǒng)培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟a、將目的基因插入所述含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體中的所述多克隆位點，得到重組目的基因表達(dá)載體；b、用所述重組目的基因表達(dá)載體和含Cre酶基因的植物表達(dá)載體分別通過DNA的直接轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，獲得所述重組目的基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株和所述含Cre酶基因的植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株；所述重組目的基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株中，所述目的基因、所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因和所述可視化標(biāo)記基因這三個基因均表達(dá)，所述三個基因記作含有目的基因的三基因；所述含Cre酶基因的植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株中，所述Cre酶基因、所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因和所述可視化標(biāo)記基因這三個基因均表達(dá)，所述三個基因記作含Cre酶基因的三基因；C、從所述重組目的基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株自交后代中選擇所述含有目的基因的三基因均穩(wěn)定表達(dá)和純合的植株作為父本，從所述含Cre酶基因的植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株自交后代中選擇所述含Cre酶基因的三基因均穩(wěn)定表達(dá)和純合的植株作為母本，將所述母本和所述父本進(jìn)行雜交，對得到的雜交種子進(jìn)行處理使所述可控啟動子被激活，再將該種子進(jìn)行種植，得到表達(dá)所述目的基因并且不含所述可視化標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的植株即為抗生素標(biāo)記基因被刪除的轉(zhuǎn)基因植株。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述方法，其特征在于所述植物為單子葉植物，如玉米；所述對得到的雜交種子進(jìn)行處理使所述可控啟動子被激活的方法為40°C熱誘導(dǎo)處理。全文摘要本發(fā)明公開了刪除轉(zhuǎn)基因植物中抗生素標(biāo)記基因的系統(tǒng)及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的刪除系統(tǒng)由分別含有抗生素標(biāo)記基因和含Cre酶基因的兩個植物表達(dá)載體各自單獨(dú)包裝組成。所述含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體含有兩個同向的loxP位點，且兩loxP位點之間含有抗生素標(biāo)記基因及可視化標(biāo)記基因表達(dá)盒。將所述兩載體的轉(zhuǎn)基因植株后代雜交，便可從雜交后代中刪除抗生素標(biāo)記基因，這為食品安全提供了保證，在轉(zhuǎn)基因研究中具有重要的意義。另外，可視化標(biāo)記基因使得僅僅從轉(zhuǎn)基因植株及種皮果皮的顏色上就可以判斷出轉(zhuǎn)基因的效果與刪除效果，因此該刪除體系在轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域是一個突破，大大節(jié)省了分子檢測的成本，對于后續(xù)的育種也有著重要的意義。文檔編號C12N15/82GK102337292SQ20111029558公開日2012年2月1日申請日期2011年9月27日優(yōu)先權(quán)日2011年9月27日發(fā)明者張曉東,張立全,李向龍,楊鳳萍,薛靜,陳緒清申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院