專利名稱：紫花苜?；ㄇ嗨剡€原酶基因及其編碼的蛋白和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種紫花苜蓿花青素還原酶相關(guān)基因，還涉及由該基因編碼的蛋白， 以及含有所述紫花苜蓿花青素還原酶基因的表達(dá)載體和細(xì)胞，同時(shí)還涉及一種培育紫花苜蓿的方法，以及紫花苜?；ㄇ嗨剡€原酶基因及其編碼的蛋白和含有該基因的表達(dá)載體及細(xì)胞在培育高單寧含量的植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
紫花苜蓿是我國乃至世界上最重要的豆科牧草，被譽(yù)為“牧草之王”。長期以來，紫花苜蓿的利用方式以收獲干草和調(diào)制青貯為主，不宜讓家畜在放牧過程中直接利用。這是因?yàn)榉雌c家畜采食新鮮苜蓿后易在瘤胃內(nèi)形成大量泡沫樣物質(zhì)而不能排出從而導(dǎo)致鼓脹病，從而限制了紫花苜蓿在放牧系統(tǒng)中的應(yīng)用。
單寧又稱單寧酸或鞣質(zhì)，是多酚中高度聚合的化合物，單寧被認(rèn)為是一種抗鼓脹病因子，在家畜瘤胃內(nèi)單寧可與包括紫花苜蓿在內(nèi)的牧草中的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，產(chǎn)生大量過瘤胃蛋白，使牧草中的蛋白質(zhì)可在家畜小腸中得到更好的吸收利用，從而使家畜避免 鼓脹病的發(fā)生。但苜蓿等豆科牧草其含量非常低，在采食新鮮的苜蓿后極易引起家畜的鼓脹病。
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，生物技術(shù)在育種中得到了廣泛地應(yīng)用。但對紫花苜蓿中單寧合成的分子機(jī)制的研究還相對較少。因此，紫花苜蓿中單寧合成相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于對紫花苜蓿中單寧合成相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制的研究，一方面提供了紫花苜?；ㄇ嗨剡€原酶基因及該基因編碼的蛋白，另一方面還提供了含有所述紫花苜?；ㄇ嗨剡€原酶基因的表達(dá)載體和細(xì)胞，以及培育高單寧含量的紫花苜蓿的方法，還提供了它們的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種紫花苜蓿花青素還原酶基因編碼的蛋白，其中，該蛋白具有SEQ ID No :2所示的氨基酸序列，或者該蛋白具有將SEQ ID No :2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有花青素還原酶活性的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了一種紫花苜蓿花青素還原酶基因，其中，該基因具有SEQ ID No 1 所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，其中，該表達(dá)載體含有本發(fā)明提供的紫花苜?；ㄇ嗨剡€原酶基因。
本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有本發(fā)明提供的紫花苜?；ㄇ嗨剡€原酶基因。
本發(fā)明還提供了一種培育紫花苜蓿的方法，其中，該方法包括將本發(fā)明提供的紫花苜?；ㄇ嗨剡€原酶基因?qū)氲阶匣ㄜ俎＜?xì)胞中，得到單寧含量高的紫花苜蓿細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明提供的紫花苜?；ㄇ嗨剡€原酶基因、及其編碼的蛋白、含有所述基因的表達(dá)載體、含有所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在培育單寧含量高的植物中的應(yīng)用。
單寧是黃酮類化合物生物合成中的一種重要的分支產(chǎn)物，該途徑位于苯丙烷途徑下游，主要以花青素作為前體物質(zhì)，通過一步或多步酶促反應(yīng)而形成。本發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的MsBAN基因(SEQ ID NO I)是紫花苜蓿中的一種花青素還原酶的編碼基因，這種源自紫花苜蓿的花青素還原酶是紫花苜蓿中類黃酮物質(zhì)合成途徑中與單寧合成有關(guān)的一種重要的酶，可促成單寧的合成。
本發(fā)明從紫花苜蓿中克隆的花青素還原酶基因?yàn)榭朔饕敛葜参?特別是豆科植物，如紫花苜蓿)易引發(fā)家畜發(fā)生鼓脹病提供了基因資源，在基因工程改良牧草植物的研究中將發(fā)揮重要作用。


圖1顯示了實(shí)施例1中對紫花苜蓿植株進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的MsBAN基因轉(zhuǎn)化所用的插入有MsBAN基因的pCAMBIA1302載體的結(jié)構(gòu)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供了一種由紫花苜?；ㄇ嗨剡€原酶基因編碼的蛋白，其中，該蛋白具有 SEQ ID No :2所不的氣基酸序列，或者該蛋白具有將SEQ ID No :2所不的氣基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有花青素還原酶活性的氨基酸序列。優(yōu)選情況下，該蛋白具有SEQ ID No :2所示的氨基酸序列。
相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了一種紫花苜蓿花青素還原酶基因(MsBAN)，其中，該基因具有SEQ ID No 1所不的核昔酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No 2所不的氣基酸序列的核苷酸序列。優(yōu)選地，該基因具有SEQ ID No :1所示的核苷酸序列。
本發(fā)明提供的紫花苜?；ㄇ嗨剡€原酶基因(MsBAN)是發(fā)明人通過以下方法篩選得到的
根據(jù)截型苜蓿中已經(jīng)克隆的花青素還原酶基因(Genbank登記號(hào)為 AY184243)保守域設(shè)計(jì)引物(RT-PCR 引物為F :5 ' -TCAAGATCCTGAGAATGACA-3 ' ；R 5' -ATATCCTCGACATGAGTG A~3')，從紫花苜蓿(Medicago sativa L. cv. Zhongmu No.1, 中苜一號(hào)，北京中畜東方草業(yè)科技有限責(zé)任公司) 中進(jìn)行擴(kuò)增，回收預(yù)期大小為450bp的片段(跑電泳后回收此長度的片段)，將回收的片段連入PMD18-T Vector(Takara),測序測序結(jié)果在NCBI的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTx分析；將分析結(jié)果中與花青素還原酶類有關(guān)的4條序列用DNAstar進(jìn)行連續(xù)開放閱讀框(ORF)分析，發(fā)現(xiàn)I條具有連續(xù)的ORF (長度為 452bp);用該序列設(shè)計(jì)特異引物(MsBAN-RT-F GCTAGCTGAAAAGGCTGCAT ；MsBAN-RT-R TCCTCGACATGAGTGAGGA)，且利用該序列設(shè)計(jì)5’ RACE引物與3’ RACE引物，以紫花苜蓿莢果組織為材料，獲得其全長序列，具體步驟為
利用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, USA)分別對該 EST 序列進(jìn)行了 5’ RACE和3’ RACE克隆，最后獲得了該基因全長序列(SEQ ID N0:1)。其中，基因克隆的方法為分子生物學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作，具體方法如下
RACE-ready cDNA 的合成
A.準(zhǔn)備基本液體2. 0μ I 5X 第一鏈緩沖液，1. 0μ I DTT(20mM)，1. 0μ IdNTP Mix (IOmM)；
B.制備用于 5’ RACE 的 cDNA :2. 75 μ I RNA,1. O μ I 5' -CDS PrimerA ；
制備用于3’ RACE 的 cDNA :3. 75 μ I RNA,1. O μ 13' -CDS PrimerA ；
C.將準(zhǔn)備好的液體放于72°C 3分鐘，再放于42°C冷卻2分鐘。
D.向 B 中 5’ RACE 的 cDNA 中加入 I μ I 的 SMARTer IIA oligo。
E.制備5’ RACE和3，RACE-Ready cDNA反應(yīng)液4. O μ I的步驟A得到的緩沖液，0.25 μ I RNA 酶抑制劑(40U/ μ I)，1. O μ I SMARTScribe 逆轉(zhuǎn)錄酶(100U)。
F.將步驟E中的液體加入到步驟C中，完成3’RACE-Ready cDNA合成反應(yīng)液的制備；將步驟E中的液體加入到步驟D中，完成5’ RACE-ReadycDNA合成反應(yīng)液的制備。
G.將制備好的反應(yīng)液放于42°C中90分鐘，最后70°C中10分鐘，完成Ready-cDNA 的合成。
cDNA末端的快速合成
H.準(zhǔn)備基本液體34· 5 μ I PCR 用水，5. O μ I 10 X Adcantage 2PCR 緩沖液，1.0μ I dNTP Mix(IOmM),1. 0μ I 50 X Advantage 2 聚合酶 Mix;
1.制備用于 5’RACE 的 PCR反應(yīng)2. 5μ I 5’RACE-ready cDNA, 5· O μ IUPM(IOX)，1. O μ I GSPl 5' -GCAAAGCCACCCACTTGGGGTTATC-3' ；41. 5 μ I 的步驟 H 中制備的緩沖液
制備用于3’RACE 的 PCR 反應(yīng)2· 5μ I 3’ RACE-ready cDNA，5· O μ IUPM(IOX)，1.O μ I GSP25' -GCTGGTTTTATCATGTCA-3' ；41. 5 μ I 的步驟 H 中制備的緩沖液
RACE反應(yīng)體系為94°C 30秒，72°C 3分鐘，共5個(gè)循環(huán)94°C 30秒，70°C 3分鐘， 72 0C 3分鐘，共5個(gè)循環(huán)；94°C 30秒，68°C 30秒，72°C 3分鐘，共20個(gè)循環(huán)。
取PCR產(chǎn)物于1.0重量％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，回收目的條帶，連接回收產(chǎn)物與pEGM T-Easy載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒并測序，進(jìn)行序列拼接，測序結(jié)果顯不該基因具有SEQ ID Νο I所不的核昔酸序列(1247bp)。
本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，其中，該表達(dá)載體含有具有以下核苷酸序列的基因SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，或者編碼SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明提供的基因可以通過現(xiàn)有的方法構(gòu)建到表達(dá)載體中，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有具有以下核苷酸序列的基因SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，或者編碼SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。所述細(xì)胞可以為單子葉植物的細(xì)胞，也可以為雙子葉植物的細(xì)胞，如水稻、小麥、玉 米、黃瓜、番茄或苜蓿等的細(xì)胞。優(yōu)選為苜蓿細(xì)胞，更優(yōu)選為紫花苜蓿細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了一種培育單寧含量高的紫花苜蓿的方法，其中，該方法包括將具有SEQ ID No :1所示的核苷酸的基導(dǎo)入到紫花苜蓿細(xì)胞中，得到單寧含量提高的紫花苜蓿細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因植株。
根據(jù)本發(fā)明所述將有本發(fā)明提供的基因?qū)氲阶匣ㄜ俎＜?xì)胞中的方法為基因工程領(lǐng)域常規(guī)的方法，例如可以通過Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，之后將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培育成植株。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明提供的紫花苜?；ㄇ嗨剡€原酶基因、及其編碼的蛋白、含有所述基因的表達(dá)載體、含有所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在培育單寧含量高的植物中的應(yīng)用。 優(yōu)選地，所述植物為紫花苜蓿。
實(shí)施例1
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的MsBAN基因轉(zhuǎn)化紫花苜蓿植株
一、材料與試劑
1、植物材料
供試苜猜品種為紫花苜猜(Medicago sativa L. cv. Zhongmu No.1,中苜一號(hào)，北京中畜東方草業(yè)科技有限責(zé)任公司)。
發(fā)芽7天的無菌苗子葉為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料。
2、農(nóng)桿菌菌株和質(zhì)粒載體
所用的農(nóng)桿菌菌株為根癌農(nóng)桿菌LBA4404(北京天恩澤基因科技有限公司)
農(nóng)桿菌培養(yǎng)基
權(quán)利要求
1.一種由紫花苜?；ㄇ嗨剡€原酶基因編碼的蛋白，其特征在于，該蛋白具有SEQ IDNo :2所示的氨基酸序列，或者該蛋白具有將SEQ ID No :2所示的氨基酸序列經(jīng)過ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有花青素還原酶活性的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其中，該蛋白具有SEQID No :2所示的氨基酸序列。
3.一種紫花苜蓿花青素還原酶基因，其特征在于，該基因具有SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其中，該基因具有SEQID No :1所示的核苷酸序列。
5.—種表達(dá)載體,其特征在于,該表達(dá)載體含有權(quán)利要求3所述的基因。
6.ー種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其特征在干，該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有權(quán)利要求3所述的基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
8.一種培育紫花苜蓿的方法，其特征在于，該方法包括將權(quán)利要求3所述的基因?qū)氲阶匣ㄜ俎＜?xì)胞中，得到單寧含量高的紫花苜蓿細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因植株。
9.權(quán)利要求1所述的蛋白、權(quán)利要求3所述的基因、權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體、權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在培育單寧含量高的植物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中，所述植物為紫花苜蓿。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種由紫花苜?；ㄇ嗨剡€原酶基因編碼的蛋白，其中，該蛋白具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列，或者該蛋白具有將SEQ ID No2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有花青素還原酶活性的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及該蛋白的編碼基因，以及含有該基因的表達(dá)載體和細(xì)胞，同時(shí)還涉及一種培育單寧含量高的紫花苜蓿的方法和它們的應(yīng)用。本發(fā)明提供的紫花苜?；ㄇ嗨剡€原酶基因(MsBAN)在紫花苜蓿中的表達(dá)可以顯著提高紫花苜蓿中單寧的含量。該基因的發(fā)現(xiàn)為克服主要牧草植物(特別是豆科植物，如紫花苜蓿)易引發(fā)家畜發(fā)生鼓脹病提供了基因資源，在基因工程改良牧草的研究中將發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12N9/02GK103031282SQ20111029720
公開日2013年4月10日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者王學(xué)敏, 高洪文, 王贊, 董潔 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所